GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI: CUỘC CÁCH MẠNG TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC

Giải trình tự gen thế hệ mới: một cuộc cách mạng trong chẩn đoán và nghiên cứu y sinh học. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới là một tiến bộ trong kỹ thuật giải trình tự từ kỹ thuật Sanger đến Pyro và hiện nay là kỹ thuật là next generation sequencing (1) Giai đoạn phản ứng giải trình tự là dùng enzyme polymerase để nhân bản đoạn DNA muốn giải trình tự thành các đoạn cách biệt nhau chỉ có một nucleotide tận ở đầu 3’ và nucleotide tận này có thể nhận diện được nhờ kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang trên chính nucleotide tận đó hay đánh dấu huỳnh quang trên mồi. (2) Giai đoạn điện di giải trình tự là dùng điện di độ phân giải cao (điện di bản gel polyacrylamide hay diện di mao quản) để sắp xếp các đoạn trình tự dài ngắn khác nhau theo kích thước (ngắn trước, dài sau dù chỉ cách nhau có một nucleotide) và chính nhờ thứ tự này mà biết được thứ tự sắp xếp các nucleotide của trình tự đoạn DNA được giải trình tự này

BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH Y TẾ CÔNG CỘNG TP HỒ CHÍ MINH GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI: CUỘC CÁCH MẠNG TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC Tác giả: Phạm Hùng Vân , Nguyễn Đỗ Phúc BÁO CÁO VIÊN: NGUYỄN ĐỖ PHÚC TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM ATVSTP KHU VỰC PHÍA NAM THÁNG 08-2012 NHỮNG BƯỚC TIẾN TRONG CƠNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN Giải trình tự gen hệ mới: cách mạng chẩn đoán nghiên cứu y sinh học Kỹ thuật giải trình tự gen hệ tiến kỹ thuật giải trình tự từ kỹ thuật Sanger đến Pyro kỹ thuật next generation sequencing Từ giải trình tự Sanger: giai đoạn - (1) Giai đoạn phản ứng giải trình tự dùng enzyme polymerase để nhân đoạn DNA muốn giải trình tự thành đoạn cách biệt có nucleotide tận đầu 3’ nucleotide tận nhận diện nhờ kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang nucleotide tận hay đánh dấu huỳnh quang mồi (2) Giai đoạn điện di giải trình tự dùng điện di độ phân giải cao (điện di gel polyacrylamide hay diện di mao quản) để xếp đoạn trình tự dài ngắn khác theo kích thước (ngắn trước, dài sau dù cách có nucleotide) nhờ thứ tự mà biết thứ tự xếp nucleotide trình tự đoạn DNA giải trình tự Các ứng dụng giải trình tự (1) Biết trình tự nucleotide đoạn DNA sở để nhà khoa học giải trình tự gene hay gen cho nghiên cứu có liên quan; (2) Để phát thay đổi trình tự nucleotide đoạn DNA sở để phát đột biến gene (liên quan đến ung thư, đên kháng thuốc), SNP (trong cá nhân hóa liệu pháp điều trị), kiểu gene (genotype virus gây bệnh)…; (3) Định danh vi khuẩn hay vi nấm dựa giải trình tự DNA gene qui định RNA ribosome (16S vi khuẩn 28S vi nấm) đặc biệt tác nhân khó định danh hay thất bại nuôi cấy từ mẫu thử; (4) Ngồi cơng nghệ điện di độ phân giải cao đặc biệt công nghệ điện di mao quản tự động sử dụng giải trình tự cịn áp dụng phân tích đoạn (fragment analysis) tức phân tích để phân biệt đoạn DNA có kích thước khác biệt vài nucleotide áp dụng sử dụng xét nghiệm dấu vân tay DNA (DNA finger printing) để nhận dạng cá nhân mối quan hệ cá nhân (pháp y), chẩn đốn tiền sanh, phát đa dạng lồi Đến pyrosequencing Nguyên tắc kỹ thuật giải trình tự pyrorequencing ghi nhận tín hiệu phát quang từ giếng phản ứng sợi bổ sung dựa sợi khuôn kéo dài nucleotide Để làm điều này, dung dịch chứa loại nucleotide A, hay T, hay C, hay G lập trình vào giếng phản ứng (có chứa đoạn DNA muốn giải trình tự, mồi giải trình tự, thành phần cho phản ứng tổng hợp sợi khuôn); dung dịch nucleotide cho vào với nucleotide bắt cặp vào sợi khuôn để tổng hợp sợi bổ sung pyrophosphate (PPi) phóng thích để enzyme sulfurylase tạo ATP, ATP giúp hệ thống phát quang luciferin-luciferase (cũng cho vào lúc) phát ánh sáng men luciferase oxide hóa luciferin thành oxyluciferin phát ánh sáng - Để huỷ ATP nucleotide tự thừa sau lần bổ sung nucleotide, men apyrase cho vào giếng phản ứng sau tín hiệu phát quang ghi nhận - Pyrosequencing cơng nghệ khởi đầu cho kỹ thuật giải trình tự tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS), tảng kỹ thuật giải trình tự gene hay cịn gọi kỹ thuật giải trình tự hệ (next generation sequencing) sau Ứng dụng: phát định lượng đột biến áp dụng quan trọng chẩn đoán, tiên đoán dự hậu định điều trị đích phân tử ung thư Bình thường: GCT GGT GGC G Đột biến: GCT GG/AT GGC G Kết phát hiện: G (50%), A (50% Bình thường: GCT GGT GGC G Đột biến: GCT GG/AT GGC G Kết phát hiện: G (67%), A (33% Kết phát định lượng đột biến gene KRAS với hình bên trái tỷ lệ đột biến codon 12 (GGT thành GAT) 50% cường độ phát quang G gấp 150% so với cường độ phát quang bình thường cịn cường độ phát quang A đạt 50% bình thường hình bên phải tỷ lệ đột biến 33% cường độ phát quang G gấp 167% so với cường độ phát quang bình thường cịn cường độ phát quang A đạt 33% bình thường Giải trình tự hệ - bước tiến nhảy vọt công nghệ -Công nghệ giải trình tự Sanger cho phép giải trình tự không 1500bps, - Pyrosequencing không 100bps, - Giải trình tự hệ cho phép giải từ 8Gbases đến 600Gbases, có nghĩa cho phép giải trình tự nguyên gene Nguyên tắc giải trình tự SBS Ba giai đoạn giải trình tự hệ (1) Tách rời tóm bắt mãnh DNA giải trình tự lên giá bám; (2) Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại mãnh DNA giá bám thành clone; (iii) Thực giải trình tự tổng hợp Giải trình tự hệ ứng dụng cách mạng chẩn đốn nghiên cứu - Thời gian để có kết kéo dài đến hàng năm mà vài ngày, or 24 Chi phí giá thành vài ngàn dolla Đối với giải trình tự gene vi khuẩn hay virus giải trình tự hệ thực cách dễ dàng với thiết bị có cơng suất nhỏ khoảng đến 10Gbases không cần phải đến hàng trăm Gbases - Để phát tác nhân nhiễm trùng bí mật, dễ dàng lơi ánh sáng trình tự nucleic acid tác nhân có mặt mẫu thử lấy từ vật chủ hay bệnh nhân - Phát đột biến cho dù tỷ lệ đột biến diện mẫu thử thấp, vài đột biến quần thể không đột biến, ứng dụng phát định lượng đột biến ung thư, bệnh di truyền - Chẩn đoán tiền sanh phát dị bội thai nhi phân tích DNA bào thai diện máu mẹ Chính nhờ ứng dụng mà tương lai chẩn đoán tiền sanh phát dị bội thai nhi khơng cịn xét nghiệm xâm lấn phải lấy mẫu chọc nước ối mà cần xét nghiệm máu mẹ CẢM ƠN SỰ CHÚ Ý LẮNG NGHE CỦA HỘI NGHỊ