TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN SẢN XUẤT BỘT ĐẠM TỪ ĐẦU CÁ LÓC (Channa striata) BẰNG KẾT HỢP ENZYME ALCALASE VÀ FLAVOURZYME 1. Giới thiệu Cá lóc là loài cá nước ngọt, có chất lượng thịt thơm ngon và giá trị dinh dưỡng cao. Nên cá lóc được nuôi nhiều ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Trà Vinh (Đỗ Minh Chung và Lê Xuân Sinh, 2011). Cùng với sự phát triển của nghề nuôi cá lóc thì các sản phẩm chế biến từ cá lóc như mắm, khô, chà bông, chả…cũng ngày càng gia tăng (Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười, 2019). Tuy nhiên, trong quá trình chế biến cá thì một lượng lớn phụ phẩm bị loại bỏ. Phụ phẩm cá lóc chứa hàm lượng protein khá cao 13,85% (Ung Minh Anh Thư, 2018), vì vậy cần được tận dụng để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao hơn như dịch đạm hay bột đạm thủy phân. Các sản phẩm thủy phân protein đã được các nhà nghiên cứu quan tâm từ nhiều năm qua vì chứa nhiều acid amin tự do có giá trị dinh dưỡng và các peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học đáp ứng chức năng sinh lý cho con người (Chalamaiah et al., 2012). Dịch đạm thủy phân là sản phẩm của quá trình thủy phân protein từ nguyên liệu hoặc phụ phẩm thủy sản bởi enzyme protease hoặc hóa chất (acid, kiềm) (Siddik et al., 2020). Trong đó, việc sử dụng enzyme để thủy phân protein từ thủy sản đã trở nên phổ biến do hiệu suất thu hồi protein và hiệu suất thủy phân cao (Trần Thanh Trúc và ctv., 2015). Có nhiều loại enzyme thủy phân protein được dùng phổ biến như Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex, và kojizyme (Nguyen et al., 2011). Do đó, Nguyễn Văn Mười và Hà Thị Thụy Vy (2018) đã khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme Alcalase thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ chân trắng cho ra kết quả hiệu suất thủy phân cao và hoạt tính chống oxy hóa tốt. Ung Minh Anh Thư (2018) đã nghiên cứu thủy phân protein từ phụ phẩm cá lóc bằng enzyme Alcalase cho ra kết quả dịch đạm giàu các acid amin và peptide mạch ngắn có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu quá trình tối ưu hóa điều kiện thủy phân từ phụ phẩm đầu cá lóc khi kết hợp enzyme Alcalase và Flavourzyme. Do vậy, đề tài “Tối ưu hóa điều kiện thủy phân sản xuất bột đạm từ đầu cá lóc (Channa striata) bằng kết hợp enzyme Alcalase và Flavourzyme” được thực hiện nhằm thu hồi protein có chất lượng tốt, nâng cao giá trị nguyên liệu và giảm ô nhiễm môi trường. 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Đầu cá lóc được thu mua tại Cơ sở khô cá lóc 7 chóp (Thoại sơn, An Giang) và được cấp đông ở nhiệt độ -20±2ºC, đóng thùng vận chuyển về phòng thí nghiệm Bộ môn Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ không quá 6 giờ. Đầu cá lóc được rửa sạch nhớt, máu bằng nước nuối loãng, loại bỏ vảy, mắt, nắp mang, mang. Đầu cá lóc sẽ được bảo quản đông ở nhiệt độ -20±2ºC. Khi tiến hành thí nghiệm, đầu cá lóc được rã đông sau đó được cắt nhỏ và xay bằng máy xay công nghiệp. Alcalase và flavourzyme là các enzyme protease được sản xuất bởi Công ty Novozyme, Đan Mạch. Enzyme Alcalase có hoạt độ là 2,4 AU (Anson Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp là nhiệt độ 55÷70 , pH = 6,5÷8,5. ℃ Enzyme Flavourzyme có hoạt độ là 3500 LAPU (Leucine Aminopeptidase Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp là 50÷55°C, pH = 5,0÷7,0 (Trương Thị Mộng Thu và Lê Thị Minh Thủy, 2020a). 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa ảnh hưởng của pH, thời gian, nồng độ enzyme so với cơ chất và nhiệt độ thủy phân khi sử dụng kết hợp Alcalase và Flavourzyme thủy phân protein từ đầu cá lóc Tiến hành thí nghiệm với 4 nhân tố X1-nhiệt độ (40-60℃), X2-thời gian (24-36giờ), X3-pH (6-8), X4-nồng độ enzyme (Alcalase và Flavourzyme: 120- 200 U/g protein) thích hợp để thủy phân. Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) - thiết kế Draper - Lin small composite design bố trí thí nghiệm 4 nhân tố. Các yếu tố chính được nghiên cứu ở 5 mức (-α, -1, 0, +1, +α) với 19 nghiệm thức. Trong đó có 3 nghiệm thức ở tâm phương án để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy. Thí nghiệm được thực hiện với các thông số thích hợp đã được lựa chọn theo nghiên cứu của Hà Thị Thùy Vy và ctv. (2019) và thí nghiệm thăm dò. Mẫu sau khi được xử lý và xay thô như mục 2.1, mẫu được cân định lượng 40 g được tiến hành thủy phân với pH, thời gian, nồng độ enzyme và nhiệt độ thủy phân được khảo sát như bố trí thí nghiệm theo 19 đơn vị thí nghiệm ở Bảng 1 với 3 lần lặp lại. Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 95ºC trong thời gian 10 phút, lọc qua vải lọc để tách riêng phần bã đầu và thu phần dịch lọc. Phần dịch lọc được ly tâm 7.500 vòng/phút ở 4ºC với thời gian 30 phút, thu được phần dịch đạm thủy phân. Tiến hành xác định độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ, đạm acid amin trong dịch đạm thủy phân tương ứng với từng điều kiện khảo sát. Dựa vào kết quả thu được cả hàm mục tiêu, Y1: độ thủy phân (%), Y2: đạm acid amin (%), Y3: hiệu suất thu hồi nitơ (%) để chọn điều kiện tối ưu nhất.
lOMoARcPSD|15547689 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH LỢI TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN SẢN XUẤT BỘT ĐẠM TỪ ĐẦU CÁ LÓC (Channa striata) BẰNG KẾT HỢP ENZYME ALCALASE VÀ FLAVOURZYME LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2021 lOMoARcPSD|15547689 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH LỢI TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN SẢN XUẤT BỘT ĐẠM TỪ ĐẦU CÁ LÓC (Channa striata) BẰNG KẾT HỢP ENZYME ALCALASE VÀ FLAVOURZYME LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS TRƯƠNG THỊ MỘNG THU 2021 lOMoARcPSD|15547689 Giới thiệu Cá lóc lồi cá nước ngọt, có chất lượng thịt thơm ngon giá trị dinh dưỡng cao Nên cá lóc ni nhiều tỉnh đồng sông Cửu Long An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Trà Vinh (Đỗ Minh Chung Lê Xuân Sinh, 2011) Cùng với phát triển nghề ni cá lóc sản phẩm chế biến từ cá lóc mắm, khơ, chà bơng, chả…cũng ngày gia tăng (Trần Thanh Trúc Nguyễn Văn Mười, 2019) Tuy nhiên, trình chế biến cá lượng lớn phụ phẩm bị loại bỏ Phụ phẩm cá lóc chứa hàm lượng protein cao 13,85% (Ung Minh Anh Thư, 2018), cần tận dụng để sản xuất sản phẩm có giá trị cao dịch đạm hay bột đạm thủy phân Các sản phẩm thủy phân protein nhà nghiên cứu quan tâm từ nhiều năm qua chứa nhiều acid amin tự có giá trị dinh dưỡng peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học đáp ứng chức sinh lý cho người (Chalamaiah et al., 2012) Dịch đạm thủy phân sản phẩm trình thủy phân protein từ nguyên liệu phụ phẩm thủy sản enzyme protease hóa chất (acid, kiềm) (Siddik et al., 2020) Trong đó, việc sử dụng enzyme để thủy phân protein từ thủy sản trở nên phổ biến hiệu suất thu hồi protein hiệu suất thủy phân cao (Trần Thanh Trúc ctv., 2015) Có nhiều loại enzyme thủy phân protein dùng phổ biến Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex, kojizyme (Nguyen et al., 2011) Do đó, Nguyễn Văn Mười Hà Thị Thụy Vy (2018) khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu enzyme Alcalase thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ chân trắng cho kết hiệu suất thủy phân cao hoạt tính chống oxy hóa tốt Ung Minh Anh Thư (2018) nghiên cứu thủy phân protein từ phụ phẩm cá lóc enzyme Alcalase cho kết dịch đạm giàu acid amin peptide mạch ngắn có giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu q trình tối ưu hóa điều kiện thủy phân từ phụ phẩm đầu cá lóc kết hợp enzyme Alcalase Flavourzyme Do vậy, đề tài “Tối ưu hóa điều kiện thủy phân sản xuất bột đạm từ đầu cá lóc (Channa striata) kết hợp enzyme Alcalase Flavourzyme” thực nhằm thu hồi protein có chất lượng tốt, nâng cao giá trị nguyên liệu giảm ô nhiễm môi trường Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu lOMoARcPSD|15547689 Đầu cá lóc thu mua Cơ sở khơ cá lóc chóp (Thoại sơn, An Giang) cấp đơng nhiệt độ -20±2ºC, đóng thùng vận chuyển phịng thí nghiệm Bộ mơn Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ khơng q Đầu cá lóc rửa nhớt, máu nước nuối loãng, loại bỏ vảy, mắt, nắp mang, mang Đầu cá lóc bảo quản đơng nhiệt độ -20±2ºC Khi tiến hành thí nghiệm, đầu cá lóc rã đơng sau cắt nhỏ xay máy xay công nghiệp Alcalase flavourzyme enzyme protease sản xuất Công ty Novozyme, Đan Mạch Enzyme Alcalase có hoạt độ 2,4 AU (Anson Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp nhiệt độ 55÷70 ℃, pH = 6,5÷8,5 Enzyme Flavourzyme có hoạt độ 3500 LAPU (Leucine Aminopeptidase Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp 50÷55°C, pH = 5,0÷7,0 (Trương Thị Mộng Thu Lê Thị Minh Thủy, 2020a) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa ảnh hưởng pH, thời gian, nồng độ enzyme so với chất nhiệt độ thủy phân sử dụng kết hợp Alcalase Flavourzyme thủy phân protein từ đầu cá lóc Tiến hành thí nghiệm với nhân tố X1-nhiệt độ (40-60℃), X2-thời gian (24-36giờ), X3-pH (6-8), X4-nồng độ enzyme (Alcalase Flavourzyme: 120200 U/g protein) thích hợp để thủy phân Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) - thiết kế Draper - Lin small composite design bố trí thí nghiệm nhân tố Các yếu tố nghiên cứu mức (-α, -1, 0, +1, +α) với 19 nghiệm thức Trong có nghiệm thức tâm phương án để kiểm tra ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy Thí nghiệm thực với thơng số thích hợp lựa chọn theo nghiên cứu Hà Thị Thùy Vy ctv (2019) thí nghiệm thăm dò Mẫu sau xử lý xay thô mục 2.1, mẫu cân định lượng 40 g tiến hành thủy phân với pH, thời gian, nồng độ enzyme nhiệt độ thủy phân khảo sát bố trí thí nghiệm theo 19 đơn vị thí nghiệm Bảng với lần lặp lại Sau kết thúc trình thủy phân, bất hoạt enzyme 95ºC thời gian 10 phút, lọc qua vải lọc để tách riêng phần bã đầu thu phần dịch lọc Phần dịch lọc ly tâm 7.500 vòng/phút 4ºC với thời gian 30 phút, thu phần dịch đạm thủy phân Tiến hành xác định độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ, đạm acid amin dịch đạm thủy phân tương ứng với điều kiện khảo sát Dựa vào kết thu hàm mục tiêu, Y 1: độ thủy phân (%), Y2: đạm acid amin (%), Y3: hiệu suất thu hồi nitơ (%) để chọn điều kiện tối ưu lOMoARcPSD|15547689 Bảng 1: Ma trận quy hoạch thực nghiệm điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc kết hợp alcalase flavourzyme NT X1 X2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 0 0 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 0 -1,68 -1 +1,68 0 0 -1 +1 +1 -1,68 +1 +1 -1 -1 +1,68 0 -1 0 Nhiệt độ (℃) 0 50 0 50 +1,68 50 0 50 -1 +1 40 -1 +1 60 +1 +1 60 0 33,18 -1 -1 60 +1 -1 60 +1 +1 40 +1 -1 40 -1,68 50 0 66,82 0 50 +1,68 50 -1 -1 40 0 50 -1,68 50 X3 X4 Thời gian (h) 30 30 30 30 36 24 24 30 36 36 36 24 30 30 19,91 30 24 40,10 30 pH 7 8,68 6 8 8 7 7 5,32 ES (UI/g protein) 160 160 160 160 200 200 200 160 120 120 200 120 92,72 160 160 227,29 120 160 160 2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian cô quay đến chất lượng dịch đạm đặc Tiến hành thí nghiệm: Từ thí nghiệm thu dịch đạm tối ưu đem cô đặc với nhân tố nhiệt độ (40, 45 50ºC) thời gian (10, 15 20 phút) với thơng số cố định cho q trình quay chân không chọn theo nghiên cứu Hà Thị Thùy Vy ctv (2019) áp suất cô quay 40 mbar, tốc độ quay vịng/giây thể tích dịch cô quay 50 ml/mẫu Dịch sau cô quay xác định mục tiêu như: Y1-hiệu suất thu hồi protein (%), Y2-đạm acid amin (%), Y3-đo màu (L*, a*, b*) Để xác định nhiệt độ thời gian đặc thích hợp để thu dịch đạm đặc có chất lượng thích hợp cho q trình sấy phun Từ thí nghiệm chọn dịch đạm đặc tốt sau tiến hành sấy phun thu bột đạm Bột đạm xác định thành phần hóa học tổng vi khuẩn hiểu khí 2.3 Phương pháp phân tích lOMoARcPSD|15547689 Phân tích thành phần hóa học nguyên liệu bột đạm bao gồm độ ẩm, protein, lipid khoáng xác định theo AOAC (2000) Xác định hoạt tính enzyme Alcalase Flavourzyme theo phương pháp Cupp-Enyard (2008) Xác định độ thủy phân - DH (%) phương pháp OPA (ophthalaldehyde), dựa nguyên tắc nhóm amin acid amin peptide phản ứng với Ortho-phthaldialdehyde với có mặt –SH dithiothreitol mercaptoethanol tạo hợp chất có khả hấp thụ bước sóng 340 nm (Nielsen et al., 2001) Xác định hàm lượng đạm acid amin theo TCVN 3708 – 90 (Bộ Khoa học Công nghệ, 1990) Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí theo TCVN 5165: 1990 (Bộ Khoa học Công nghệ 1990) Đo màu (L*, a*, b*): mẫu dịch trải đủ dày túi nilong tiến hành đo màu thiết bị Colorimeter PCE-CSM (Trung Quốc), giá trị L* (màu trắng đến màu đen), a* (màu đỏ xanh lá) b* (màu vàng màu xanh da trời) nhận Xác định hiệu suất thu hồi nitơ (nitrogen recovery - NR) theo phương pháp Wang et al (2018) Công thức: NR (%) = (Hàm lượng nitơ tổng số dịch thủy phân)*100/(Hàm lượng nitơ tổng số nguyên liệu đầu cá xay) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm lập lại lần kết thí nghiệm thể dạng giá trị trung bình Sử dụng phần mềm Statgraphics XVI để xử lý kết thí nghiệm thơng qua phân tích ANOVA để đánh giá khác biệt nghiệm thức (p