Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida, streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục i Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án x Thesis abstract xii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu giới bệnh viêm phổi lợn vacxin phòng bệnh 2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam bệnh viêm phổi lợn vacxin phòng bệnh 12 2.3 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae bệnh viêm phổi lợn 14 2.3.1 Vi khuẩn A pleuropneumoniae 14 2.3.2 Bệnh viêm phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae gây lợn 17 2.4 Vi khuẩn Pasteurella multocida bệnh viêm phổi lợn 19 2.4.1 Vi khuẩn P multocida 19 2.4.2 Bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn P multocida gây 21 i 2.5 Vi khuẩn Streptococcus suis bệnh vi khuẩn gây lợn 25 2.5.1 Vi khuẩn S suis 25 2.5.2 Bệnh vi khuẩn S suis gây lợn 29 2.6 Các chất bổ trợ thường dùng sản xuất vacxin 30 2.6.1 Chất bổ trợ vacxin 30 2.6.2 Muối khoáng 33 2.6.3 Chất nhũ tương 33 2.6.4 Cytokine 35 2.6.5 Saponin 35 2.6.6 Các chất cao phân tử 35 Phần Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 36 3.1 Địa điểm nghiên cứu 36 3.2 Thời gian nghiên cứu 36 3.3 Vật liệu nghiên cứu 36 3.4 Nội dung nghiên cứu 37 3.4.1 Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 37 3.4.2 Nghiên cứu đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 37 3.4.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 37 3.5 Phương pháp nghiên cứu 38 3.5.1 Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae, P mutocida S suis gây 38 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phòng bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 41 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 43 ii 3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 50 Phần Kết thảo luận 51 4.1 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 51 4.1.1 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn A pneumoniae gây 51 4.1.2 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn P multocida gây 54 4.1.3 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn S suis gây 56 4.2 Kết đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phịng bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 59 4.2.1 Kết đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phòng bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae gây 59 4.2.2 Kết đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phòng bệnh vi khuẩn P multocida gây 65 4.2.3 Kết đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phịng bệnh vi khuẩn S suis gây 70 4.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 75 4.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 75 4.3.2 Kết đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm 77 4.3.3 Kết so sánh khả sinh miễn dịch vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu chống lại vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis 83 4.3.4 Kết xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn 90 4.3.5 Kết xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn 92 iii 4.3.6 Kết xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn 99 Phần Kết luận và đề nghị 103 5.1 Kết luận 103 5.2 Đề nghị 104 Danh mục cơng trình khoa học cơng bố có liên quan đến luận án 105 Tài liệu tham khảo 106 Phụ lục .117 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ aa Amino acid A pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae BHI Brain Heart Infusion BNNPTNT Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Bp Base pair CI Confidence Interval CHLB Cộng hòa liên bang cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acide dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization HT Huyết KHKT Khoa học kỹ thuật M hyopneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae NAD Nicotinamide adenine dinucleotide NXB Nhà xuất OIE Office International des Epizooties P multocida Pasteurella multocida PCR Polymerase Chain Reaction PLLO Pleuropneumonia-like organism RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction S suis Streptococcus suis TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam THB Todd Hewitt Broth TN Thí nghiệm TSB Tryptic Soy Broth TT Thông tư v Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ TYE Tryptone Yeast Extract Broth TW Tryptone water USA United States of America USD United States dollar VNUA Vietnam National University of Agriculture vi DANH MỤC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang 3.1 Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA A pleuropneumoniae 39 3.2 Trình tự cặp mồi dùng để xác định serotype A, D Pasteurella multocida 40 3.3 Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh Streptococcus suis theo tiêu chuẩn quốc gia- TCVN 8400-2:2010 40 3.4 Thành phần phản ứng 40 3.5 Chu trình nhiệt 40 3.6 Trình tự cặp mồi dùng để xác định gen quy định sản sinh ba loại độc tố Apx A pleuropneumoniae 41 3.7 Trình tự cặp mồi dùng để xác định số gen mã hoá yếu tố độc lực Streptococcus suis 42 3.8 Trình tự mồi dùng để xác định serotype 1, 2, 7, Streptococcus suis 42 4.1 Kết đánh giá khả gây bệnh lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae 51 4.2 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm A pleuropneumoniae 52 4.3 Kết đánh giá khả gây bệnh lợn vi khuẩn P multocida 54 4.4 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm P multocida 55 4.5 Kết đánh giá khả gây bệnh lợn vi khuẩn S suis 56 4.6 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm S suis 58 4.7 Kết kiểm tra đặc tính sinh hóa giống sản xuất A pleuropneumoniae 61 4.8 Kết xác định gen sản sinh độc tố giống sản xuất A pleuropneumoniae 62 4.9 Kết đánh giá khả gây bệnh chuột vi khuẩn A pleuropneumoniae 65 4.10 Kết kiểm tra đặc tính sinh hóa giống sản xuất P multocida 67 4.11 Kết xác định yếu tố độc lực giống sản xuất P multocida 68 4.12 Kết đánh giá khả gây bệnh chuột vi khuẩn P.multocida 70 4.13 Kết kiểm tra đặc tính sinh hóa giống sản xuất S suis 72 4.14 Kết xác định yếu tố độc lực giống sản xuất S suis 73 4.15 Kết xác định serotype chủng S suis 74 vii 4.16 Kết đánh giá khả gây bệnh chuột vi khuẩn S suis 74 4.17 Kết nuôi cấy vi khuẩn phương pháp lên men sục khí 76 4.18 Kết kiểm tra đậm độ, khiết vô trùng lô giống đơn giá 77 4.19 Kết kiểm tra khiết vô trùng vacxin đa giá bán thành phẩm 78 4.20 Kết kiểm tra an toàn vacxin bán thành phẩm chuột nhắt trắng 79 4.21 Kết kiểm tra an toàn vacxin bán thành phẩm lợn 79 4.22 Kết thử hiệu lực vacxin chuột nhắt trắng phương pháp thay 80 4.23 Kết kiểm tra hiệu lực vacxin lợn phương pháp trọng tài 82 4.24 Kết kiểm tra kháng thể lợn tiêm vacxin vơ hoạt nhũ dầu phịng viêm phổi lợn kháng lại vi khuẩn A pleuropneumoniae (serotype 2, serotype 5a, serotype 5b), P multocida (serotype A, serotype B), S suis serotype 84 4.25 Kết so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A pleuropneumoniae vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu phương pháp ELISA 86 4.26 Kết so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P multocida vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu 88 4.27 Kết so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S suis vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu 89 4.28 Kết xác định kháng thể lợn tiêm vacxin với liều tiêm khác 90 4.29 Kết thử hiệu lực vacxin bảo quản nhiệt độ 18 - 25oC chuột nhắt trắng phương pháp thay (Canh trùng tiêm: A.pp + P multocida + S suis) 101 4.30 Kết thử hiệu lực vacxin bảo quản nhiệt độ 4o- 8oC chuột nhắt trắng phương pháp thay 102 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu 44 4.1 Một số bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm A.pleuropneumoniae 52 4.2 Sản phẩm kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn A pleuropneumoniae 53 4.3 Một số bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm P multocida 55 4.4 Sản phẩm kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn P multocida 56 4.5 Một số triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm S suis 58 4.6 Sản phẩm kỹ thuật PCR xác định S suis 59 4.7 Khuẩn lạc A pleuropneumoniae thái vi khuẩn soi kính hiển vi 60 4.8 Sản phẩm PCR xác định độc tố Apx A pleuropneumoniae 63 4.9 Vi khuẩn A1 A pleuropneumoniae có chứa gen apxIICA, apxIIICA, apxIBD apxIIIBD 63 4.10 Vi khuẩn A2 A peuropneumoniae có chứa gen apxICA, apxIICA apxIBD 63 4.11 Vi khuẩn A3 A pleuropneumoniae có chứa gen apxIIICA, apxIBD apxIIIBD 64 4.12 Khuẩn lạc P multocida thái vi khuẩn soi kính hiển vi 66 4.13 Sản phẩm phản ứng PCR xác định serotype P multocida 68 4.14 Mẫu P4 vi khuẩn P multocida thuộc Serotype A 69 4.15 Mẫu P5 vi khuẩn P multocida thuộc Serotype D 69 4.16 Khuẩn lạc S suis thái vi khuẩn soi kính hiển vi 71 4.17 Vi khuẩn St vi khuẩn S suis có chứa gen sly, mrp arcA 73 ix TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Đỗ Tất Đạt Tên luận án: Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý lợn mắc viêm phổi Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis sử dụng vacxin phòng bệnh Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định đặc điểm biến đổi bệnh lý lợn mắc bệnh viêm phổi vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida Streptococcus suis gây Xây dựng quy trình sản xuất quy trình sử dụng vacxin đa giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ dầu đạt hiệu cao phòng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida Streptococcus suis gây Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn giám định đặc tính sinh hóa - Phương pháp PCR xác định Actinobacillus pleuropneumoniaevà độc tố vi khuẩn - Phương pháp PCR xác định Pasteurella multocida serotype vi khuẩn - Phương pháp PCR xác định Streptococcus suis serotype độc tố vi khuẩn - Phương pháp đánh giá độc lực vi khuẩn chuột lợn - Phương pháp chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu - Phương pháp kiểm nghiệm vacxin - Phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh viêm phổi vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida Streptococcus suis gây Các chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida Streptococcus suis lựa chọn để gây bệnh thực nghiệm lợn có độc lực cao, gây chết lợn thời gian ngắn Các triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm Actinobacillus pleuropneumoniae bao gồm: sốt, khó thở, ho, hắt hơi, bỏ ăn, x Luận án tiến sĩ Y học 52 Halbur P., Thanawongnuwech R., Brown G., Kinyon J., Roth J., Thacker E & Thacker B (2000) Efficacy of antimicrobial treatments and vaccination regimens for control of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Streptococcus suis coinfection of nursery pigs Journal of clinical microbiology 38(3): 1156-1160 53 Heath P., Hunt B., Duff J & Wilkinson J (1996) Streptococcus suis serotype 14 as a cause of pig disease in the UK The Veterinary record 139(18): 450-451 54 Herczeg J., Brunier E., Szalai T., Tenk M & Thevenon J (2014) week onset of immunity of Coglapix® in swine originated from a farm naturally contaminated with Actinobacillus pleuropneumoniae 55 Higgins R., Lariviere S., Mittal K., Martineau G., Rousseau P & Cameron J (1985) Evaluation of a killed vaccine against porcine pleuropneumonia due to Haemophilus pleuropneumoniae The Canadian Veterinary Journal 26(2): 86 56 Hogg A., Amass S., Hoffman L., Wu C & Clark L (1996) A survey of Streptococcus suis isolations by serotype and tissue of origin Proc Am Assoc Swine Pract 79-81 57 Holt M., Enright M & Alexander T (1990) Immunisation of pigs with killed cultures of Streptococcus suis serotype Research in veterinary science 48(1): 23-27 58 Inzana T J., Todd J., Ma J & Veit H (1991) Characterization of a non-hemolytic mutant of Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype 5: role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection Microbial pathogenesis 10(4): 281-296 59 Inzana T J., Todd J & Veit H P (1993) Safety, stability, and efficacy of noncapsulated mutants of Actinobacillus pleuropneumoniaefor use in live vaccines Infection and immunity 61(5): 1682-1686 60 Iwamatsu S., Mukouhara Y & Sawada T (1991) Antibiotic susceptibility of Pasteurella multocida isolated from swine from 1983 to 1986 Journal of the Japan Veterinary Medical Association (Japan) 61 Jacques M & Foiry B (1987) Electron microscopic visualization of capsular material of Pasteurella multocida serotypes A and D labeled with polycationic ferritin Journal of bacteriology 169(8): 3470-3472 111 Luận án tiến sĩ Y học 62 Jansen R., Briaire J., Van Geel A., Kamp E M., Gielkens A & Smits M A (1994) Genetic map of the Actinobacillus pleuropneumoniaeRTX-toxin (Apx) operons: characterization of the ApxIII operons Infection and immunity 62(10): 4411-4418 63 John V S., Wilcock B & Kierstead M (1982) Streptococcus suis serotype infection in swine in Ontario: A review of clinical and pathological presentations The Canadian Veterinary Journal 23(3): 95 64 Jolie R A., Mulks M H & Thacker B J (1995) Cross-protection experiments in pigs vaccinated with Actinobacillus pleuropneumoniaesubserotypes 1A and 1B Veterinary microbiology 45(4): 383-391 65 Kataoka Y., Sugimoto C., Nakazawa M., Morozumi T & Kashiwazaki M (1993) The epidemiological studies of Streptococcus suis infections in Japan from 1987 to 1991 Journal of Veterinary Medical Science 55(4): 623-626 66 Kielstein P (1986) On the Occurrence of Toxin‐Producing Pasteurella‐multocida‐ Strains in Atrophic Rhinitis and in Pneumonias of Swine and Cattle Journal of Veterinary Medicine, Series B 33(1‐10): 418-424 67 Kilian M., Nicolet J & Biberstein E (1978) Biochemical and serological characterization of Haemophilus pleuropneumoniae (Matthews and Pattison 1961) Shope 1964 and proposal of a neoserotype strain International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 28(1): 20-26 68 Kobe K (1933) Die Aetiologie der Ferkelgrippe (enzootische Pneumonie des Ferkels) Z Bakt Parositenk Abt Orig 129: 161-76 69 Koehne G., Maddux R & Cornell W (1979) Lancefield group R streptococci associated with pneumonia in swine American journal of veterinary research 40(11): 1640-1641 70 Krejci R., Newberry J & Ceva Sante Animale F (2011) Pleuropneumonia in pigs– its importance and prevention Mortality 2(6.7): 0.0007 71 Lai RPJ, Seaman MS & Tonks P (2012) Mixed adjuvantformulations reveal a new combination that elicit antibodyresponse comparable to Freund’s adjuvants (a new potentadjuvant combination) PLoS One 2012;7:e35083 72 Lin R, Tarr P & Jones TC (1995) Present status of the use ofcytokines as adjuvants with vaccines to protect againstinfectious diseases Clin Infect Dis 1995;21:1439–1449 112 Luận án tiến sĩ Y học 73 Lun Z.-R., Wang Q.-P., Chen X.-G., Li A.-X & Zhu X.-Q (2007) Streptococcus suis: an emerging zoonotic pathogen The Lancet infectious diseases 7(3): 201-209 74 Maclennan M., Foster G., Dick K., Smith W & Nielsen B (1996) Streptococcus suis serotypes 7, and 14 from diseased pigs in Scotland British Medical Journal Publishing Group 75 Maré C & Switzer W (1965) New species: Mycoplasma hyopneumoniae A causative agent of virus pig pneumonia Veterinary Medicine60 841 76 Meeusen E N., Walker J., Peters A., Pastoret P.-P & Jungersen G (2007) Current status of veterinary vaccines Clinical microbiology reviews 20(3): 489-510 77 Mikael L G., Pawelek P D., Labrie J., Sirois M., Coulton J W & Jacques M (2002) Molecular cloning and characterization of the ferric hydroxamate uptake (fhu) operon in Actinobacillus pleuropneumoniae The GenBank accession number for the sequence of the fhuCDBA operon of Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype reference strain 4074 described in this study is AF351135 Microbiology 148(9): 2869-2882 78 Nielsen R (1984) Haemophilus pleuropneumoniae serotypes cross protection experiments Nordisk veterinaermedicin 36(7-8): 221-234 79 Nielsen R (1985) Haemophilus pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae) Serotypes 8, and Serological response and cross immunity in pigs Nordisk veterinaermedicin 37(4): 217-227 80 Park C., Ha Y., Kim S., Chae C & Ryu D.-Y (2009) Construction and characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype mutant lacking the Apx toxin secretion protein genes apxIIIB and apxIIID Journal of Veterinary Medical Science 71(10): 1317-1323 81 Pattison I., Howell D & Elliot J (1957) A haemophilus-like organism isolated from pig lung and the associated pneumonic lesions Journal of Comparative Pathology and Therapeutics 67: 320-IN37 82 Perry M B (1990) Structural analysis of the lipopolysaccharide of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae serotype 10 Biochemistry and Cell Biology 68(4): 808-810 83 Pijoan C & Fuentes M (1987) Severe pleuritis associated with certain strains of Pasteurella multocida in swine Journal of the American Veterinary Medical Association 191(7): 823-826 113 Luận án tiến sĩ Y học 84 Pijoan C., Lastra A., Ramirez C & Leman A (1984) Isolation of toxigenic strains of Pasteurella multocida from lungs of pneumonic swine Journal of the American Veterinary Medical Association 185(5): 522-523 85 Pijoan C & Trigo F (1990) Bacterial adhesion to mucosal surfaces with special reference to Pasteurella multocida isolates from atrophic rhinitis Canadian journal of veterinary research - Revue canadienne de recherche veterinaire 54: S16-21 86 Pohl S., Bertschinger H., Frederiksen W & Mannheim W (1983) Transfer of Haemophilus pleuropneumoniae and the Pasteurella haemolytica - like organism causing porcine necrotic pleuropneumonia to the genus Actinobacillus (Actinobacillus pleuropneumoniaecomb nov.) on the basis of phenoserotypeic and deoxyribonucleic acid relatedness International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33(3): 510-514 87 Prideaux C T., Pierce L., Krywult J & Hodgson A L (1998) Protection of mice against challenge with homologous and heterologous serovars of Actinobacillus pleuropneumoniaeafter live vaccination Current microbiology 37(5): 324-332 88 Quinn, P J., Markey, B K., Leonard, F C., FitzPatrick, E S., Fanning, S (2015) Concise review of veterinary microbiology John Wiley Sons 89 Ramjeet M., Cox A D., Hancock M A., Mourez M., Labrie J., Gottschalk M & Jacques M (2008a) Mutation in the LPS outer core biosynthesis gene, galU, affects LPS interaction with the RTX toxins ApxI and ApxII and cytolytic activity of Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype Molecular microbiology 70(1): 221-235 90 Ramjeet M., Deslandes V., Gouré J & Jacques M (2008b) Actinobacillus pleuropneumoniaevaccines: from bacterins to new insights into vaccination strategies Animal Health Research Reviews 9(1): 25-45 91 Reams R Y., Harrington D D., Glickman L T., Thacker H L & Bowersock T L (1996) Multiple serotypes and strains of Streptococcus suis in naturally infected swine herds Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 8(1): 119-121 92 Rohrbach B., Hall R & Hitchcock J (1993) Effect of subclinical infection with Actinobacillus pleuropneumoniaein commingled feeder swine Journal of the American Veterinary Medical Association 202(7): 1095-1098 114 Luận án tiến sĩ Y học 93 Sanford S & Tilker M (1982) Streptococcus suis serotype II-associated diseases in swine: observations of a one-year study Journal of the American Veterinary Medical Association 181(7): 673-676 94 Sanford S E (1987) Gross and histopathological findings in unusual lesions caused by Streptococcus suis in pigs I Cardiac lesions Canadian Journal of Veterinary Research 51(4): 481 95 Schaller A., Kuhn R., Kuhnert P., Nicolet J., Anderson T J., Maclnnes J I., Segers R P & Frey J (1999) Characterization of apxlVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae Microbiology 145(8): 2105-2116 96 Shakarji L., Mikael L G., Srikumar R., Kobisch M., Coulton J W & Jacques M (2006) Fhua and HgbA, outer membrane proteins of Actinobacillus pleuropneumoniae: their role as virulence determinants Canadian journal of microbiology 52(4): 391-396 97 Shope R E (1964) Porcine contagious pleuropneumonia: I Experimental Transmission, Etiology, and Pathology The Journal of experimental medicine 119(3): 357-368 98 Srikumar R., Mikael L G., Pawelek P D., Khamessan A., Gibbs B F., Jacques M & Coulton J W (2004) Molecular cloning of haemoglobin-binding protein HgbA in the outer membrane of Actinobacillus pleuropneumoniae Microbiology 150(6): 1723-1734 99 Sriskandan S & Slater J D (2006) Invasive disease and toxic shock due to zoonotic Streptococcus suis: an emerging infection in the East? PLoS Medicine 3(5) 100 Straw B., Maclachlan N J., Corbett W., Carter P & Schey H (1985) Comparison of tissue reactions produced by Haemophilus pleuropneumoniae vaccines made with six different adjuvants in swine Canadian journal of comparative medicine 49(2): 149 101 Torremorell M., Pijoan C., Janni K., Walker R & Joo H S (1997) Airborne transmission of Actinobacillus pleuropneumoniaeand porcine reproductive and respiratory syndrome virus in nursery pigs American journal of veterinary research 58(8): 828-832 102 Tumamao J., Bowles R., Van Den Bosch H., Klaasen H., Fenwick B., Storie G & Blackall P (2004) Comparison of the efficacy of a subunit and a live streptomycin‐dependent porcine veterinary journal 82(6): 370-374 115 pleuropneumonia vaccine Australian Luận án tiến sĩ Y học 103 Thacker B & Mulks M (1988) Evaluation of commercial Haemophilus pleuropneumoniae vaccines Proc Int Pig Vet Soc 87 104 Van Den Bosch H & Frey J (2003) Interference of outer membrane protein PalA with protective immunity against Actinobacillus pleuropneumoniaeinfections in vaccinated pigs Vaccine 21(25-26): 3601-3607 105 Van Overbeke I., Chiers K., Ducatelle R & Haesebrouck F (2001) Effect of endobronchial challenge with Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype of pigs vaccinated with a vaccine containing Apx toxins and transferrin‐binding proteins Journal of Veterinary Medicine, Series B 48(1): 15-20 106 Vecht U., Van Leengoed L & Verheijen E (1985) Streptococcus suis infections in pigs in the Netherlands (Part I) Veterinary quarterly 7(4): 315-321 107 Windsor R & Elliott S (1975) Streptococcal infection in young pigs: IV An outbreak of streptococcal meningitis in weaned pigs Epidemiology Infection 75(1): 69-78 108 Wisselink H., Vecht U., Smith H & Stockhofe-Zurwieden N (2001) Protection of pigs against challenge with virulent Streptococcus suis serotype strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine Veterinary Record 148(15): 473-477 109 Witte A., Wanner G., Sulzner M & Lubitz W (1992) Dynamics of PhiX174 protein E-mediated lysis of Escherichia coli Archives of microbiology 157(4): 381-388 110 Zhang Q., Young T F & Ross R (1995) Identification and characterization of a Mycoplasma hyopneumoniae adhesin Infection and immunity 63(3): 10131019 116 Luận án tiến sĩ Y học PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN A PLEUROPNEUMONIAE CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH I Giữ giống thạch lỏng Môi trường giữ giống Tryptone soy broth (TSB) bổ sung 20% glycerin Phương pháp giữ giống - Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae nuôi cấy môi trường thạch PPLO 370C điều kiện có 5% CO2 24 - Lấy tồn khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniaetrên thạch PPLO vào môi trường giữ giống (khuẩn lạc đĩa thạch đưa vào ml môi trường) - Chia eppendorf - Kiểm tra lại ống giữ giống cách nuôi cấy mơi trường thạch PPLO thạch máu có cấy kèm Staphylococcus aureus, đạt yêu cầu bảo quản - 800C II Giữ giống phương pháp đông khô Môi trường giữ giống Skim milk, hấp vô trùng, chia 1- 2ml mơi trường vào lọ nhỏ có nắp vặn Phương pháp giữ giống - Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae nuôi cấy môi trường thạch PPLO 370C điều kiện có 5% CO2 24 - Lấy toàn khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae thạch PPLO vào môi trường giữ giống (khuẩn lạc 3-4 đĩa thạch đưa vào ml môi trường) - Hút hỗn dịch vào ống đông khô hấp vô trùng, cho lượng hỗn dịch thấm ướt bơng đáy ống Lượng hỗn dịch cịn lại dùng để kiểm tra lại ống giữ giống cách cấy thạch PPLO thạch máu có cấy kèm Staphylococcus aureus - Sử dụng máy đông khô hút hết khơng khí, tạo mơi trường chân khơng ống đơng khơ - Hàn kín ống đơng khơ, kiểm tra chân khơng - Bao gói cẩn thận, tránh làm nứt, vỡ ống giống, bảo quản -200C -800C 117 Luận án tiến sĩ Y học B PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN A PLEUROPNEUMONIAE CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH I Tăng cường giống phương pháp tiêm chuột Chuẩn bị canh trùng - Lấy vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ thạch lỏng (hoặc ống giống đông khô) nuôi cấy môi trường thạch PPLO thạch máu có cấy kèm Staphylococcus aureus, ni cấy 370C điều kiện có 5% CO2 24 - Lấy toàn khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae thạch PPLO vào môi trường TYE (khuẩn lạc đĩa thạch đưa vào 100 ml TYE), nuôi cấy lắc 370C, - Chuyển canh trùng nuôi cấy lắc: từ 100 ml canh trùng chuyển vào bình có 200 ml TYE, ni cấy lắc 370C, 10 - Chuyển canh trùng nuôi cấy lắc: từ 300 ml canh trùng chuyển vào bình có 500 ml TYE, ni cấy lắc 370C, 20 - Đếm số vi khuẩn trước tiêm cho chuột (số lượng vi khuẩn trung bình sau nuôi cấy lắc đạt khoảng – x 108 vi khuẩn/ml) Tiêm chuột - Sử dụng chuột nhắt trắng khỏe mạnh, giống vi khuẩn tiêm cho chuột - Liều tiêm canh trùng: 0,5 ml - Đường tiêm: phúc xoang - Theo dõi chuột 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 sau tiêm - Phân lập lại vi khuẩn từ máu tim - Sau phân lập, nuôi cấy vi khuẩn, tiến hành giữ giống theo phương pháp II Tăng cường giống phương pháp tiêm động vật (lợn) Chuẩn bị canh trùng Cách làm tương tự tiêm chuột Tiêm lợn - Sử dụng lợn 30- 45 ngày tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm vacxin phòng viêm phổi Actinobacillus gây - Liều tiêm: ml 118 Luận án tiến sĩ Y học - Đường tiêm: vịnh tĩnh mạch cổ - Theo dõi lợn 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 sau tiêm - Phân lập lại vi khuẩn từ máu tim, gan, phổi, dịch họng lợn - Sau phân lập, nuôi cấy vi khuẩn, tiến hành giữ giống theo phương pháp C PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN P MULTOCIDA CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH Tăng cường giống vi khuẩn Pasteurella multocida chuột bạch: - Chuột bạch có trọng lượng 18-20 g/con, khỏe mạnh - Giống vi khuẩn: Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A D - Chủng vi khuẩn giữ từ thạch lỏng ria cấy lên đĩa thạch BHI 5% máu cừu, nuôi cấy 370C/ 24h, chọn khuẩn lạc điển hình đứng riêng lẻ - Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước BHI, bồi dưỡng 18 -20 nhiệt độ 370 C - Tiêm phúc xoang, liều tiêm canh trùng 0,2 ml/ chuột chủng tiêm chuột - Theo dõi thời gian chết chuột số chuột chết chủng vi khuẩn kiểm tra - Chuột chết mổ khám, lấy máu tim nuôi cấy môi trường nước thịt BHI thạch BHI 5% máu cừu để phân lập lại vi khuẩn - Lựa chọn chủng vi khuẩn gây chết 100% chuột thí nghiệm thời gian ngắn để giữ giống vi khuẩn Tăng cường giống vi khuẩn Pasteurella multocida lợn thí nghiệm: 2.1 Vi khuẩn gây bệnh: Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A D có đầy đủ đặc tính sinh vật hóa học điển hình vi khuẩn P multocida, tính kháng nguyên ổn định, có độc lực cao gây chết 100% động vật thí nghiệm, số lượng kháng nguyên đủ để tiến hành gây bệnh bệnh thực nghiệm lợn 2.2 Lợn thí nghiệm: Lợn thí nghiệm có trọng lượng 12- 15kg/ con, chưa tiêm loại vacxin có chứa loại vi khuẩn Pasteurella multocida dùng để gây bệnh 2.3 Chuẩn bị canh trùng gây bệnh: - Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida giữ từ thạch lỏng ria cấy lên đĩa thạch BHI 5% máu cừu, nuôi cấy 370C/ 24h, chọn khuẩn lạc điển hình đứng riêng lẻ 119 Luận án tiến sĩ Y học - Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước BHI, để tủ ấm 370C /18 -20h - Xác định liều gây bệnh chủng vi khuẩn Pasteurella multocida dùng để gây bệnh thực nghiệm phương pháp đếm số thạch đĩa 2.4 Tiến hành thí nghiệm: Mỗi chủng vi khuẩn cần gây bệnh tiêm cho 02 lợn thí nghiệm với liều tiêm 6ml/ lợn đường tiêm tĩnh mạch cổ Và 05 lợn đối chứng không tiêm Theo dõi thời gian 7- 10 ngày - Các lợn thí nghiệm chết mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy lấy máu tim ni cấy môi trường nước thịt BHI thạch BHI 5% máu cừu để phân lập lại vi khuẩn Lựa chọn chủng vi khuẩn gây chết 100% lợn thí nghiệm thời gian ngắn để giữ giống vi khuẩn D PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH Chuẩn bị: - Giống vi khuẩn Pasteurella multocida - Thạch BHI 5% máu cừu - Nước thịt BHI (Brain heart infusion) - Effendorf vô trùng - Pipet tip vô trùng - Pipetman - Glycerol vô trùng Tiến hành - Cấy giống vi khuẩn Pasteurella multocida cần giữ lên môi trường thạch BHI 5% máu cừu (chú ý cấy tách khuẩn lạc riêng rẽ), nuôi tủ ấm 370C/18- 20h - Chọn khuẩn lạc điển hình vi khuẩn (đứng tách riêng) cấy vào môi trường nước thịt BHI Để tủ ấm 370C từ – 10h - Sau – 10h bổ sung Glycerol (theo tỷ lệ BHI:85% Glycerol: 15%) vào canh trùng nuôi cấy - Lắc canh trùng với Glycerol - Dùng pipetman hút canh trùng chia vào Effendorf (1-1,5ml/tube) - Dán nhãn - Giữ nhiệt độ âm sâu – 20 đến – 800C 120 Luận án tiến sĩ Y học Kiểm tra độ khiết tính chất mọc vi khuẩn giữ giống Sau chia canh trùng vào Effendorf Dùng que cấy chọc vào phần canh trùng thừa lọ BHI, ria lại thạch máu, cất tủ ấm 370C/24h Sau 24 h, kiểm tra đĩa thạch vi khuẩn mọc trình giữ giống thạch lỏng đảm bảo đạt yêu cầu Quy trình đơng khơ giớng vi khuẩn I Chuẩn bị giống vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A D II Chuẩn bị dụng cụ môi trường để đông khô Môi trường: - Thạch BHI 5% máu bê cừu - Skim milk (2gram/100ml nước cất) Dụng cụ: - Ống đơng khơ (có nút bơng) vơ trùng - Pipet Pasteur - Serotype có nút vặn - Tăm bơng vơ trùng - Đèn khị - Máy hút chân không - Máy kiểm tra chân không Cách tiến hành: Cấy chủng vi khuẩn Pasteurella multocida cần đông khô lên môi trường thạch BHI 5% máu, với điều kiện khuẩn lạc phải (370C/ 18 giờ) Pha Skim milk nước cất chia nhỏ vào serotype có nút vặn (1ml/serotype), hấp vô trùng 1210C/15 phút Dùng tăm vô trùng thu hoạch hết khuẩn lạc có đĩa thạch máu, sau gạt tăm bơng vào serotype Skim milk (mỗi chủng vi khuẩn sử dụng serotype Skim milk) Dùng pipet Pasteur hút Skim milk vào ống đơng khơ, tùy mục đích sử dụng mà dùng hay nhiều serotype đông khô Chú ý dùng pipet Pasteur hút lên hút xuống Skim milk phần đáy ống thấm Skim milk Dùng kéo cắt phần thừa nút ống đông khô Đồng thời dùng que nhọn đẩy nút xuống phía dưới, gần chạm vào phần bơng đáy ống đông khô 121 Luận án tiến sĩ Y học Bật đèn khò Cho lửa đèn khò vào vị trí ống đơng khơ, xoay trịn, nhiệt độ nóng chảy thích hợp, dùng hai tay kéo bên ống đông khô Giữ ống đông khô ngăn đá tủ lạnh 12 Cắm ống đông khô vào máy hút chân khơng, bật máy hút vịng 12 Sau 12 giờ, thu hoạch ống đông khô Kiểm tra ống đông khô Dùng máy kiểm tra chân khơng, thấy ống đơng khơ có màu sáng xanh chứng tỏ khơng có khơng khí ống Ngược lại, ống đơng khơ có khơng khí bên trong, ống đông khô không đảm bảo chất lượng Bảo quản: Ống đông khô bảo quản nhiệt độ thường, tránh để lẫn với vật nặng hay sắc nhọn E PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH Quy trình giữ giớng vi khuẩn thạch lỏng 1.1 Chuẩn bị - Giống vi khuẩn - Thạch máu cừu 5% - Nước thịt BHI (Brain heart infusion) - Effendorf vô trùng - Pipet tip vô trùng - Pipetman - Glycerol vô trùng 1.2 Tiến hành - Cấy giống vi khuẩn cần giữ lên môi trường thạch máu cừu 5% (chú ý cấy tách khuẩn lạc riêng rẽ), nuôi tủ ấm 370C/24h - Chọn khuẩn lạc điển hình vi khuẩn (đứng tách riêng) cấy vào môi trường nước thịt BHI - Để tủ ấm 370C từ – 10h 122 Luận án tiến sĩ Y học - Sau – 10h bổ sung Glycerol (theo tỷ lệ BHI:85% Glycerol: 15%) vào canh trùng nuôi cấy - Lắc canh trùng với Glycerol - Dùng pipetman hút canh trùng chia vào Effendorf (1-1,5ml/tube) - Dán nhãn - Giữ nhiệt độ âm sâu 1.3 Kiểm tra độ khiết tính chất mọc vi khuẩn giữ giống Sau chia canh trùng vào Effendorf Dùng que cấy chọc vào phần canh trùng thừa lọ BHI, ria lại thạch máu, cất tủ ấm 370C/24h Sau 24 h, kiểm tra đĩa thạch vi khuẩn mọc trình giữ giống thạch lỏng đảm bảo đạt u cầu Quy trình đơng khơ giớng vi khuẩn III Chuẩn bị giống vi khuẩn IV Chuẩn bị dụng cụ môi trường để đông khô Môi trường: - Thạch máu bê cừu - Skim milk (2 gram/100ml nước cất) Dụng cụ: - Ống đơng khơ (có nút bơng) vơ trùng - Pipet Pasteur - Serotype có nút vặn - Tăm bơng vơ trùng - Đèn khị - Máy hút chân khơng - Máy kiểm tra chân không V Cách tiến hành: 10 Cấy chủng vi khuẩn cần đông khô lên môi trường thạch máu, với điều kiện khuẩn lạc phải 11 Pha Skim milk nước cất chia nhỏ vào serotype có nút vặn (1ml/serotype), hấp vô trùng 1210C/15 phút 123 Luận án tiến sĩ Y học 12 Dùng tăm vô trùng thu hoạch hết khuẩn lạc có đĩa thạch máu, sau gạt tăm vào serotype Skim milk (mỗi chủng vi khuẩn sử dụng serotype Skim milk) 13 Dùng pipet Pasteur hút Skim milk vào ống đông khô, tùy mục đích sử dụng mà dùng hay nhiều serotype đông khô Chú ý dùng pipet Pasteur hút lên hút xuống Skim milk phần đáy ống thấm Skim milk 14 Dùng kéo cắt phần thừa nút ống đông khô Đồng thời dùng que nhọn đẩy nút bơng xuống phía dưới, gần chạm vào phần đáy ống đông khô 15 Bật đèn khò Cho lửa đèn khò vào vị trí ống đơng khơ, xoay trịn, nhiệt độ nóng chảy thích hợp, dùng hai tay kéo bên ống đông khô 16 Giữ ống đông khô ngăn đá tủ lạnh 12 17 Cắm ống đông khô vào máy hút chân khơng, bật máy hút vịng 12 18 Sau 12 giờ, thu hoạch ống đông khô VI Kiểm tra ống đông khô Dùng máy kiểm tra chân khơng, thấy ống đơng khơ có màu sáng xanh chứng tỏ khơng có khơng khí ống Ngược lại, ống đơng khơ có khơng khí bên trong, ống đông khô không đảm bảo chất lượng VII Bảo quản: Ống đông khô bảo quản nhiệt độ thường, tránh để lẫn với vật nặng hay sắc nhọn 124 Luận án tiến sĩ Y học G PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH Tăng cường qua động vật thí nghiệm: - Chuột bạch: trọng lượng 20gram/con - Nước thịt BHI (Brain Heart Infusion) bổ sung 2% huyết ngựa - Vi khuẩn S suis cấy đĩa thạch máu bê - Vét khuẩn lạc vi khuẩn S suis vào 10ml BHI bổ sung 2% huyết ngựa - Để tủ ấm 370C/24 - Tiêm phúc xoang chuột với liều tiêm 0,5ml/con, chủng vi khuẩn tiêm 02 chuột - Theo dõi chuột - Nếu chuột chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm máu tim, ria cấy lại thạch máu nước thịt BHI Để tủ ấm 370C/24 Kiểm tra hình thái khuẩn lạc, làm phản ứng sinh hóa test để khẳng định lại vi khuẩn S suis - Giữ giống vi khuẩn S suis từ máu tim chuột Tăng cường giống vi khuẩn S suis động vật - Lợn có trọng lượng 10-12kg/con - Cấy giống S suis giữ từ thạch lỏng thạch máu đĩa, để tủ ấm 370C/24 Sau 24h, cấy chuyển sang thạch máu đĩa lần 2, chủng vi khuẩn cấy lên đĩa thạch máu - Chuẩn bị 200ml nước BHI bổ sung 2% huyết ngựa - Vét toàn khuẩn lạc vi khuẩn S suis cấy đĩa thạch máu vào 200ml nước BHI - Để tủ ấm 370C/24 - Sau 24h, đếm số lượng vi khuẩn S suis có 1ml canh trùng nuôi cấy - Tiêm 30ml canh trùng/01 lợn với đường tiêm tĩnh mạch cổ - Theo dõi triệu chứng bệnh lợn sau tiêm canh trùng - Lợn chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm gồm: não, dịch khớp, máu tim phổi - Ria cấy lại thạch máu nước THB - Phân lập lại vi khuẩn S suis từ bệnh phẩm lợn chết - Giữ giống S suis 125