Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long

Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.Phân lập vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ và nội sinh cây bắp trên nền đất phù sa Đồng bằng sông Cửu Long.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ THÁI THÀNH ĐƯỢC PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG VÙNG RỄ VÀ NỘI SINH CÂY BẮP TRÊN NỀN ĐẤT PHÙ SA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62420201 NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ THÁI THÀNH ĐƯỢC MÃ SỐ NCS: P0916001 PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG VÙNG RỄ VÀ NỘI SINH CÂY BẮP TRÊN NỀN ĐẤT PHÙ SA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 62420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận văn này, với đề tựa “Phân lập vi khuẩn cố định đạm vùng rễ nội sinh bắp đất phù sa đồng sông Cửu Long”, học viên Thái Thành Được thực theo hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp Luận văn báo cáo Hội đồng chấm luận văn thông qua ngày: … ./… /……… Thư ký (ký tên) Nghiên cứu sinh (ký tên) Thái Thành Được Người hướng dẫn (ký tên) Chủ tịch Hội đồng (ký tên) LỜI CẢM ƠN Tôi thật may mắn hạnh phúc thực luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học hướng dẫn Phó Giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp nguyên giảng viên cao cấp Viện Nghiên cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Trường đại học Cần Thơ Để hồn thành luận án này, tơi nhận động viên liệt, giúp đỡ to lớn hỗ trợ nhiệt tình thật quý báu nhiều người Xin bày tỏ lòng tri ân chân thành sâu sắc! Lời cảm ơn xin gửi đến thầy tôi, PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp Thầy tận tình hướng dẫn dạy phương pháp tiếp cận khoa học lĩnh vực nghiên cứu, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi với trình học tập Thầy dành nhiều thời gian để khơi dậy nỗ lực, cố gắng khơng ngừng, khơng nãn lịng trước khó khăn, vấp ngã suốt q trình thực luận án sống Em xin chân thành cảm ơn tri ân sâu sắc đến thầy Trân trọng cảm ơn thầy PGS TS Nguyễn Văn Thành dạy động viên nên cố gắng học thực hoàn thành luận án Xin cảm ơn đến quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh học truyền thụ cho tơi nhiều kiến thức q báu, phục vụ q trình nghiên cứu viết báo cáo khoa học Chân thành cảm ơn Tiến sĩ Trương Thị Bích Vân, Viện Nghiên cứu Phát Triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ hỗ trợ hướng dẫn nhiệt tình trình thủ tục hồ sơ luận án thông tin quý giá trình thực luận án Xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát Triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Khoa Sau Đại học phòng ban khác Trường Đại học Cần Thơ hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi suốt q trình học tập nghiên cứu trường Tôi chân thành biết ơn Tiến sĩ Huỳnh Văn Tiền hỗ trợ giúp đỡ, động viên tơi tiếp tục thực hồn thành luận án Xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Định Thành, Trung tâm kiểm nghiệm kiểm định giống Bình Đức thuộc cơng ty Lộc Trời tạo điều kiện máy, thiết bị, phịng thí nghiệm giúp thực luận án Xin cảm ơn Ông Nguyễn Văn Chánh xã Long Khánh B, huyện Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp, Ông Nguyễn Văn Lời xã Vĩnh Trường, huyện An Phú tỉnh An Giang hỗ trợ đất ruộng triển khai thực thí nghiệm trồng chậu đồng Chân thành cảm ơn em sinh viên thuộc Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học cộng tác thời gian thực luận án Sau xin cảm ơn cha mẹ, người thân gia đình Thái An An nguồn lực lớn tiếp sức đến tơi suốt q trình học tập làm việc hoàn thành luận án Chân thành cảm ơn! Thái Thành Được TÓM TẮT Bắp lương thực quan trọng kinh tế toàn cầu Bắp chứa nhiều dinh dưỡng nguồn thức ăn người Bắp nguồn nguyên liệu công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi Để tăng suất bắp, nông dân sử dụng nhiều phân đạm hóa học Điều dẫn đến nhiều tác hại làm thay đổi tính chất lý hóa đất, giảm độ phì nhiêu, gây nhiễm mơi trường thất nitrate gây ảnh hưởng xấu lên hệ sinh thái Đặc biệt, phân đạm hố học có giá thành cao làm tăng chi phí sản xuất Hướng sản xuất nông nghiệp nâng cao độ phì nhiêu đất, giảm lượng phân hóa học, tăng cường phân sinh học để giảm chi phí sản xuất, giảm nhiễm mơi trường, góp phần tạo sản phẩm an tồn phát triển nơng nghiệp sinh thái bền vững Phân bón vi sinh bắp từ dòng vi khuẩn địa giải pháp cần thiết Do vậy, Phân lập vi khuẩn cố định đạm vùng rễ nội sinh bắp thực với mục tiêu tìm chủng vi khuẩn đất vùng rễ nội sinh bắp, có khả cố định đạm cao, sản xuất phân vi sinh cho bắp trồng vùng ĐBSCL Từ 190 mẫu bắp 38 mẫu đất thu từ địa điểm, 120 dòng vi khuẩn đất vùng rễ 635 dịng vi khuẩn nội sinh có khả cố định đạm phân lập Hai mươi chín dịng vi khuẩn tuyển chọn dựa gene 16S rDNA định danh thuộc chi Bacillus, Klebsiella, Pseudomonas Enterobacter Các dòng vi khuẩn tuyển chọn tổng hợp NH4+ từ 2,51-5,64 (mg/L) sản xuất IAA cao từ 6,63-26,75 (mg/L) Năm dòng vi khuẩn tuyển chọn cung cấp đạm tốt cho bắp môi trường Yoshida khơng đạm Năm dịng vi khuẩn AAL1, AMR1, ADR3, DNL14 DNR5 theo thứ tự có quan hệ gần với loài: Paenibacillus wenxiniae, Bacillus megaterium, Bacillus aryabhattai, Enterobacter sp, Klebsiella pneumoniae Thí nghiệm nhà lưới ngồi đồng bắp bón 75% NPK, chủng vi khuẩn dịng ADR3 (Bacillus aryabhattai) DNR5 (Klebsiella pneumoniae) giúp tăng tỷ lệ mầm, kích thích sinh trưởng bắp cho suất tương đương bón 100% NPK tiết kiệm 25% NPK Từ khóa: Bacillus aryabhattai ADR3, bắp lai NK7328, Klebsiella pneumoniae DNR5, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn nội sinh ABSTRACT Corn is an important food crop in world economic Corn has a lot of nutrient that is a good source of food for human Corn is also a source of industrial material for production animal feed To have high yield of corn, farmers use a lot of chemical nitrogen fertilizer This leads to many bad effects such as changing chemical and physical characteristics of soil, decreasing soil fertility, causing environmental pollution because of extra lost of nitrate and affecting ecological conditions Especially, the price of chemical nitrogen fertilizer is very high made high production cost Recently, agriculture production based on increasing soil fertility, minimizing chemical fertilizer, increasing bio-fertilizer to decrease production cost, minimizing environmental pollution in order to have safe products ecological and the development of stable agriculture Bio-fertilizer for corn consisting of indigenous bacteria is an urgent technique Thus, the study of insolation of nitrogen fixing bateria of the rhizophere and endophytic bacteria of cultivated corn was done to find out good strains of rhizopheric bateria and endophytic bateria which could fix nitrogen well for the production of biofertilizer for corn cultivated in Mekong Delta From 190 samples of corn plant and 38 soil samples, 120 rhizophere bacterial strains and 635 endophytic bateria strains which could fix nitrogen were isolated Twenty nine selected strains identified by molecular technique based on 16S rDNA, were similar to Bacillus, Klebsiella, Pseudomonas, and Enterobacter These strains could synthesized NH4+ (2.51-5.64 mg/L) and produced high IAA (6.63-26.75 mg/L) Five good strains which could fix high amount of nitrogen for corn were cultured in nitrogen free Yoshida medium These five bacterial strains, AAL1, AMR1, ADR3, DNL14 and DNR5 have closed relationship with Paenibacillus wenxiniae, Bacillus megaterium, Bacillus aryabhattai, Enterobacter sp and Klebsiella pneumoniae, respectively Greenhouse and field tests showed that when applied 75% NPK and inoculated corn either with ADR3 (Bacillus aryabhattai) or DNR5 (Klebsiella pneumoniae), the germination rate of corn increased, the growth of corn was stimulated and yield of corn was equivalent to the yield of corn applied 100% of chemical NPK fertifizer and 25% NPK fertilizer were saved Keywords: Bacillus aryabhattai ADR3, endophytic bacteria, hybrid corn NK7328, Klebsiella pneumoniae DNR5, nitrogen fixing bacteria, rhizopheric bacteria LỜI CAM ĐOAN Luận án Tiến sĩ, chun ngành Cơng nghệ sinh học, khố 2016-2020, với cơng trình nghiên cứu “Phân lập vi khuẩn cố định đạm vùng rễ nội sinh bắp đất phù sa Đồng sông Cửu Long”, nghiên cứu sinh Thái Thành Được thực hướng dẫn khoa học Phó Giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Bộ môn Công nghệ sinh học Vi sinh vật, Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ, Việt Nam; Liên hiệp Hội Khoa học Kỹ thuật thành phố Cần Thơ Tôi xin cam kết luận án hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác Tơi xin lấy danh dự uy tín thân để đảm bảo cho lời cam đoan Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh Thái Thành Được MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .2 1.3 Nội dung nghiên cứu .2 1.4 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 1.6 Tính cấp thiết, đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án .3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên Đồng sông Cửu Long 2.2 Đặc điểm đất phù sa, diện tích trồng suất bắp ĐBSCL 2.2.1 Đặc điểm đất phù sa .6 2.2.2 Diện tích đất trồng suất bắp 2.3 Sơ lược bắp 2.3.1Phân loại, nguồn gốc .7 2.3.2 Đặc điểm sinh thái .7 2.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng bắp 2.3.4Giá trị bắp 2.3.5Đặc điểm giống bắp NK 7328 .9 2.3.6 Kỹ thuật trồng bắp .9 2.4 Tổng quan vi khuẩn cố định đạm 10 2.4.1Chu trình nitơ định nghĩa vi khuẩn cố định đạm 10 2.4.2Quá trình cố định đạm vi sinh vật 11 2.4.3Vi khuẩn cố định đạm 15 2.4.4Cơ chế xâm nhập nội sinh mô thực vật vi khuẩn 22 2.5 Đặc điểm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh vai trò thực vật 25 2.5.1 Vi khuẩn đất vùng rễ thực vật 25 2.5.2 Vi khuẩn nội sinh thực vật .25 2.5.3 Vai trò vi khuẩn thực vật 26 2.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn 28 2.6.1 Khái niệm đa dạng vi sinh vật .28 2.6.2Phương pháp phân tích đa dạng di truyền dựa vào đoạn gene 16S rDNA 28 2.6.3Phân tích đa dạng di truyền dựa vào đoạn gene NifH 29 2.7 Hiện trạng sử dụng phân bón cho bắp ĐBSCL 32 2.7.1 Phân bón hố học 32 2.7.2 Phân bón vi sinh 35 i 2.8 Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn cố định đạm 35 2.8.1Các nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm 35 2.8.2Thành tựu ứng dụng phân vi sinh vật nông nghiệp 37 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 3.1 Phương tiện nghiên cứu 38 3.1.1 Thời gian địa điểm 38 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 38 3.1.3 Thiết bị thí nghiệm, dụng cụ hoá chất 39 3.2 Phương pháp nghiên cứu 40 3.2.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có khả cố định đạm đất vùng rễ nội sinh bắp trồng ĐBSCL 41 3.2.2 Nội dung 2: Tuyển chọn số dòng vi khuẩn cố định đạm IAA cao .45 3.2.3 Nội dung 3: Nhân gene 16S rDNA đánh giá tương đồng với sở liệu gene vi khuẩn NCBI 48 3.2.4 Nội dung 4: Khảo sát đa dạng di truyền dựa vào gene NifH số dòng vi khuẩn cố định đạm cao 51 3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu dòng vi khuẩn cố định đạm tổng hợp IAA lên khả nẩy mầm sinh trưởng bắp điều kiện phịng thí nghiệm 53 3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu dòng vi khuẩn bắp 30 NSG điều kiện nhà lưới 56 3.2.7 Nội dung 7: Hiệu dòng vi khuẩn đến bắp trồng chậu 59 3.2.8 Nội dung 8: Hiệu dòng vi khuẩn đến bắp trồng đồng 62 3.3 Phương pháp xử lý số liệu 65 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .66 4.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có khả cố định đạm đất vùng rễ nội sinh bắp trồng ĐBSCL 66 4.1.1 Kết thu mẫu đất vùng rễ bắp .66 4.1.2 Kết phân tích pH mẫu đất .66 4.1.3 Kết phân lập vi khuẩn cố định đạm 68 4.2 Nội dung 2: Tuyển chọn số dòng vi khuẩn cố định đạm IAA cao 78 4.2.1 Kiểm tra khả cố định đạm dòng vi khuẩn 78 4.2.2 Kiểm tra sinh tổng hợp IAA dòng vi khuẩn cố định đạm cao 80 4.2.3 Đặc tính cố định đạm tổng hợp IAA cao 29 dòng vi khuẩn đất vùng rễ nội sinh tuyển chọn 82 4.3 Nội dung 3: Nhân gene 16S rDNA đánh giá tương đồng với sở liệu gene vi khuẩn NCBI 85 4.3.1 Kết khuếch đại gene 16S r DNA 29 dòng vi khuẩn 86 4.3.2 Kết dị tìm dịng tương đồng trình tự gene 16S rRNA NCBI 86 4.3.3 Đa dạng di truyền gene 16S rRNA dòng vi khuẩn đất vùng rễ 88 4.3.4 Đa dạng di truyền gene 16S rRNA 23 dòng vi khuẩn nội sinh 90 ii 4.3.5 Đa dạng di truyền gene 16S rRNA 29 dòng vi khuẩn đất vùng rễ nội sinh bắp 91 4.4 Nội dung 4: Khảo sát đa dạng di truyền dựa vào gene NifH số dòng vi khuẩn cố định đạm cao 95 4.4.1 Khuếch đại gene NifH dòng vi khuẩn tuyển chọn 95 4.4.2 Giải trình tự gene NifH dòng vi khuẩn 95 4.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu dòng vi khuẩn cố định đạm tổng hợp IAA lên khả nẩy mầm sinh trưởng bắp điều kiện phịng thí nghiệm……….98 4.5.1 Ảnh hưởng mật số dòng vi khuẩn đến tỷ lệ nẩy mầm hạt bắp 98 4.5.2 Khả kích thích nẩy mầm hạt bắp dòng vi khuẩn mật số 108CFU/mL .100 4.5.3 Khảo sát dịng vi khuẩn kích thích sinh trưởng đến bắp trồngtrong phịng thí nghiệm………………………………………………………………………………… 101 4.5.4 Đánh giá khả sống sót dịng vi khuẩn chất mang 103 4.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu dòng vi khuẩn bắp 30 NSG điều kiện nhà lưới .104 4.6.1 Vụ (04/05/2018-03/06/2018) 104 4.6.2 Vụ (08/06/2018-08/07/2018) 106 4.6.3 Tổng hợp hiệu dòng vi khuẩn bắp 30 NSG qua vụ108 4.7 Nội dung 7: Hiệu dòng vi khuẩn đến bắp trồng chậu 110 4.7.1 Hiệu dòng vi khuẩn đến bắp trồng chậu tỉnh An Giang 110 4.7.2 Hiệu dòng vi khuẩn đến bắp trồng chậu tỉnh Đồng Tháp 117 4.7.3 Phân tích tương quan dòng vi khuẩn ảnh hưởng đến số tiêu nông học suất bắp trồng chậu An Giangvà Đồng Tháp 123 4.8 Nội dung 8: Hiệu dòng vi khuẩn đến bắp trồng đồng 124 4.8.1 Hiệu dòng vi khuẩn đến bắp trồng đồngtại An Giang 124 4.8.2 Hiệu dịng vi khuẩn đến bắp trồng ngồi đồngtại tỉnh Đồng Tháp 130 4.8.3 Hiệu kinh tế dịng vi khuẩn đến bắp trồng ngồi đồng .138 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 144 5.1 Kết luận 144 5.1 Đề nghị .144 TÀI LIỆU THAM KHẢO 146 iii