Nghien cuu nuoi cay te bao ria giac mac va ung 128092

ĐẶT VẤN ĐỀ Tổn thương giác mạc bệnh lý thường gặp nhãn khoa Nguyên nhân gây tổn thương giác mạc khác làm độ giác mạc gây giảm thị lực nhiều mức độ khác Trong số trường hợp, vùng rìa giác mạc - nơi cư trú tế bào gốc biểu mô giác mạc bị tổn thương, di chứng để lại cho bệnh nhân hội chứng suy giảm tế bào gốc biểu mô giác mạc Hậu hội chứng làm độ giác mạc màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giác mạc, lt biểu mơ giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mơ giác mạc tái phát [12, 15, 34, 41, 46] Để điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc biểu mô giác mạc, nhà nhãn khoa sử dụng phương pháp khác nhau: Ghép kết mạc rìa tự thân, ghép giác - củng mạc rìa từ giác mạc tử thi, ghép màng ối Kết điều trị tốt, đặc biệt với trường hợp tổn thương mắt Tuy nhiên với kỹ thuật này, mảnh mô dùng để ghép lấy từ bên mắt lành từ mắt tử thi cần có diện tích lớn cần tồn giác mạc Trong vài năm gần đây, y – sinh học đại đạt thành tựu lớn việc đổi mô ghép tế bào gốc Trong nhãn khoa, công nghệ tạo biểu mô giác mạc từ việc ni cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc thực nghiệm người có thành công định Ghép biểu mô giác mạc nuôi cấy mang lại hiệu tốt cho việc phục hồi cấu trúc chức giác mạc Xuất phát từ nhu cầu thực tế nước, nhiều bệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cần điều trị với mong muốn đưa phương pháp đại điều trị hội chứng này, tiến hành đề tài “Nghiên cứu ni cấy tế bào rìa giác mạc ứng dụng điều trị số tổn thương giác mạc” Mục tiêu đề tài là: Xây dựng qui trình ni cấy, nhận dạng tế bào gốc biểu mơ vùng rìa giác mạc thỏ màng ối người, tạo biểu mô giác mạc nuôi cấy Ghép thành công biểu mô nuôi cấy mắt thỏ Tạo biểu mô giác mạc người nuôi cấy, phục vụ ghép tự thân cho số bệnh nhân tổn thương giác mạc Mục tiêu cụ thể: Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý bảo quản màng ối người làm giá đỡ cho biểu mô giác mạc nuôi cấy từ tế bào gốc biểu mô vùng rìa Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế bào gốc BMVR tạo biểu mô giác mạc nuôi cấy Đánh giá chất lượng tế bào BMVR nuôi cấy Tạo mơ hình thực nghiệm gây tổn thương khu trú giác mạc thỏ Ghép biểu mô giác mạc nuôi cấy Xây dụng tiêu chuẩn đánh giá hiệu ghép mắt thỏ Bước đầu tạo biểu mô giác mạc nuôi cấy, ghép tự thân cho số bệnh nhân tổn thương giác mạc CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc bề mặt nhãn cầu [2] Bề mặt nhãn cầu (BMNC) vùng giới hạn hai đường xám mi mi BMNC gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc ngăn biểu mơ vùng rìa giác mạc (VRGM) 1.1.1 Giác mạc Giác mạc chiếm 1/6 vỏ ngồi nhãn cầu, hình bầu dục, dày 0,8 – 0,9 mm vùng trung tâm 11,7 mm chu biên Giác mạc cấu trúc vô mạch, gồm lớp: Biểu mô giác mạc, màng Bowman, chân bì giác mạc, màng Descemet nội mơ giác mạc (Hình 1.1) Hình 1.1 Ảnh vi thể giác mạc bình thường ( H.E x 250) Biểu mô trước giác mạc Nhu mô Màng Desmert Nội mô giác mạc  Biểu mô giác mạc: biểu mơ lát tầng khơng sừng hố, gồm 4-6 hàng tế bào, chiếm khoảng 10% bề dày giác mạc Biểu mô chia thành lớp: lớp đáy, lớp tế bào hình cánh, lớp bề mặt Các tế bào lớp đáy hình trụ có khả phân chia, tế bào liên kết với thể liên kết liên kết với màng đáy thể bán liên kết, tế bào sinh phát triển lên phía Các tế bào lớp (tế bào hình cánh) có nhân trịn dài, tế bào liên kết với thể liên kết mộng liên kết Các tế bào bề mặt có hình đa diện dẹt, liên kết với vịng dính, dải bịt thể liên kết, bề mặt tế bào có vi nhung mao ngắn phủ lớp glycocalyx Lớp glycocalyx liên kết với mucin phim nước mắt giúp dàn làm phim nước mắt bền vững để bảo vệ toàn vẹn BMNC Trong bào tương tế bào biểu mô giác mạc có nhiều loại keratin khác nhau, nhiên K3 K12 coi dấu ấn tế bào biểu mơ giác mạc biệt hóa Đặc biệt K12 dấu ấn tốt có lớp đáy biểu mơ giác mạc  Màng Bowman: Gồm màng đáy biểu mô màng Bowman thức Màng Bowman lớp ngồi chân bì giác mạc (nhu mơ giác mạc), gồm sợi collagen xếp theo hướng khác Màng Bowman dai lớp bảo vệ quan trọng nhãn cầu  Chân bì giác mạc: Chiếm 90% bề dày giác mạc, gồm sợi collagen chủ yếu type I, III, collagen type IV V Xen sợi collagen tế bào sợi dẹt gọi giác mạc bào (keratocyte) khoảng gian sợi gian bào chứa chất giàu glycosaminoglycan  Màng Descemet: Dày 5-10µm, đáy tạo từ chất tiết nội mô giác mạc  Nội mô giác mạc: Là biểu mô lát đơn gồm hàng tế bào đa diện dẹt xếp đặn phủ mặt sau giác mạc Các tế bào nội mơ giác mạc khơng có khả phân chia 1.1.3 Kết mạc nhãn cầu Kết mạc trải từ vùng rìa củng mạc đến đường xám bờ mi, chia thành phần: kết mạc mi, kết mạc đồ kết mạc nhãn cầu Biểu mô kết mạc nhãn cầu biểu mô trụ tầng Các tế bào liên kết với lỏng lẻo, khoảng gian bào rộng Trong biểu mơ có khoảng 5-10% tế bào hình đài tiết nhày Lớp đệm kết mạc mô liên kết thưa, chứa mạch máu, mạch bạch huyết loại tế bào: lympho, dưỡng bào, tương bào bạch cầu đa nhân 1.1.3 Vùng rìa giác mạc tế bào gốc vùng rìa giác mạc * Vùng rìa giác mạc: Vùng rìa giác mạc chỗ nối tiếp giác mạc suốt phía trước củng mạc trắng đục phía sau Biểu mơ vùng rìa (BMVR) vùng tế bào biểu mô chuyển đổi mặt hình thái chức từ biểu mơ lát tầng khơng sừng hố biểu mơ giác mạc sang biểu mơ có tế bào hình trụ, tế bào hình đài tiết nhày biểu mơ kết mạc Biểu mơ vùng rìa gồm 7-10 hàng tế bào Lớp tế bào đáy biểu mơ hình trụ có khả phân chia Những tế bào gọi tế bào gốc biểu mơ giác mạc, đóng vai trò quan trọng việc đổi tái tạo biểu mơ giác mạc Khi soi vùng rìa kính hiển vi thấy khía dọc xếp theo hình nan hoa, đục tổ chức bao quanh Hình ảnh gọi hàng rào Vogt Hàng rào Vogt nơi tập trung nhiều sắc tố vùng rìa coi biểu lâm sàng toàn vẹn tế bào gốc biểu mô giác mạc Sự tồn phát triển tế bào gốc cịn phụ thuộc vào nhu mơ vùng rìa Nhu mơ vùng rìa coi mơi trường ức chế kích thích tăng trưởng tế bào gốc biểu mô * Tế bào gốc vùng rìa giác mạc: Trong thể người, biểu mơ giác mạc đổi Các tế bào gốc vùng rìa phân chia biệt hóa tế bào để bù lại mặt số lượng chất lượng tế bào Tế bào gốc biểu mô giác mạc tế bào hình trụ, nằm màng đáy lớp biểu mơ vùng rìa, có khả phân chia mạnh Từ cuối thập kỷ 80, tồn tế bào gốc biểu mô giác mạc vùng rìa củng giác mạc nhiều nhà nhãn khoa giới nêu nghiên cứu chứng minh tồn phương pháp khác Davanger Evansen (1971) người mô tả đặc điểm tế bào biểu mơ thuộc vùng rìa giác mạc [9] Sau đó, nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học tiến hành chứng minh tồn tế bào gốc giác mạc [11, [41], [42] Với phương pháp đánh dấu tế bào đồng vị phóng xạ, nhiều tác giả chứng minh hoạt động gián phân biệt hố tế bào xảy vùng rìa Mặt khác, tế bào biểu mô giác mạc chứa lọai keratin khác tuỳ theo mức độ biệt hoá tế bào Sự có mặt keratin K3 keratin K12 chứng tỏ mức độ biệt hoá cao tế bào biểu mô giác mạc Các loại kêratin không thấy tế bào đáy thuộc vùng rìa Tính chất phù hợp với tính chất tế bào gốc Sự biểu mơ hố phía chu vi giác mạc, có xu hướng phía trung tâm giác mạc Bình thường, kiểu hình biểu mơ giác mạc trì nhờ cân tế bào biểu mô bị bong bề mặt thay gián phân tế bào lớp đáy biểu mô di cư phía trung tâm giác mạc tế bào đáy sinh từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc Thoft cộng có cơng trình nghiên cứu chứng minh tồn hoạt động phân chia tế bào gốc BMGM phương pháp nhuộm, đánh dấu phóng xạ, quan sát q trình biểu mơ hố Q trình đổi biểu mô bề mặt giác mạc tuân theo phương trình X + Y = Z (Hình 1.2) Trong đó:X tăng sinh tế bào từ lên Y di chuyển tế bào từ chu biên vào Z tế bào lớp nông [42], [43] Hình 1.2 Sơ đồ trình đổi tế bào bề mặt giác mạc Tseng S C G cộng ghép màng ối chia nhóm: Một nhóm ghép màng ối đơn thuần, nhóm kết hợp ghép vùng rìa dị thân 31 mắt, kết nghiên cứu cho thấy trường hợp có ghép vùng rìa thị lực tăng biểu mơ hố bề mặt nhãn cầu tốt [48] Thành cơng phẫu thuật ghép vùng rìa bệnh nhân tổn thương bề mặt nhãn cầu nặng lần chứng cho tồn tế bào gốc vai trò quan trọng hàn gắn biểu mô bề mặt nhãn cầu Hơn nữa, mạch máu kết mạc kết thúc đổ vào đám rối mạch vùng rìa, đám rối mạch có vai trò quan trọng cung cấp chất dinh dưỡng oxy cho trình gián phân tế bào gốc Những nghiên cứu quan sát trước cho thấy biểu mơ hóa ln xuất phát từ phía chu vi giác mạc hướng trung tâm Trong nghiên cứu thực nghiệm động vật tạo tổn thương biểu mô vĩnh viễn không phá hủy vùng rìa Hiện nay, việc phân biệt tế bào gốc biểu mơ vùng rìa vấn đề khó khăn Nhưng tồn tế bào có khả gián phân vùng rìa phân lập loại Keratin từ tế bào chứng xác đáng Hơn thế, thành công phẫu thuật ghép biểu mơ vùng rìa củng giác mạc phẫu thuật ghép tổ chức có ni cấy tế bào lấy từ vùng rìa chứng minh tồn tế bào gốc biểu mô giác mạc người Tế bào gốc giác mạc lúc biệt hóa theo hai đường Con đường thứ để bù lại mặt số lượng tế bào biểu mơ giác mạc, q trình bắt đầu việc di chuyển hướng tâm theo chiều ngang tế bào gốc Các tế bào nhanh chóng tăng sinh biệt hóa thành tế bào sau gián phân di chuyển dần lên phía trên, cuối biệt hóa thành tế bào trưởng thành tróc bề mặt biểu mơ giác mạc Liên tiếp nhiều q trình gián phân, biệt hóa tăng sinh tế bào gốc làm đổi liên tục lớp tế bào biểu mô giác mạc Con đường biệt hóa tế bào thứ hai tế bào gốc biệt hóa tăng sinh tế bào theo chiều đứng biểu mơ vùng rìa Các nhà nghiên cứu cho đường đóng vai trò quan trọng rào chắn để tách biệt biểu mô kết mạc biểu mô giác mạc Chức tế bào gốc vùng rìa nhiều nhà nhãn khoa nghiên cứu kết luận có chức bản: (1) Bù đắp mặt số lượng tế bào biểu mô giác mạc; (2) Biệt hóa thành tế bào biểu mơ giác mạc với chức cấu trúc tế bào biểu mô trưởng thành; (3) Ngăn chặn không cho biểu mô kết mạc xâm lấn lên bề mặt giác mạc Tóm lại BMVR có chứa tế bào gốc biểu mơ giác mạc nhiều cơng trình khoa học chứng minh Những tế bào đóng vai trị quan trọng trình tái tạo sinh lý trình tái tạo hồi phục sau tổn thương biểu mô giác mạc 1.1.4 Các yếu tố liên quan đảm bảo toàn vẹn BMNC [36] 1.1.4.1 Mi mắt Mi mắt có tác dụng bảo vệ BMNC khỏi sang chấn mặt học từ môi trường bên Quan trọng cấu trúc mềm mại bờ tự mi mắt giúp cho dàn trải phim nước mắt BMNC giúp cho BMNC ln nhẵn bóng đủ độ ẩm cần thiết Bệnh nhân bỏng mắt, bờ tự mi hay bị tổn thương nhiều mức độ khác Nhẹ mềm mại bờ tự do, nặng có biến dạng tồn bờ mi gây nên hở mi, trễ mi Do đó, ảnh hưởng đến bền vững phim nước mắt gây ảnh hưởng đến toàn vẹn BMNC 1.1.4.2 Màng phim nước mắt Sự toàn vẹn bề mặt nhãn cầu đảm bảo mối quan hệ mật thiết biểu mô bề mặt nhãn cầu màng phim nước mắt Các rối loạn bề mặt nhãn cầu làm màng phim nước mắt bền vững ngược lại, màng phim nước mắt bền vững góp phần làm rối loạn bề mặt nhãn cầu nặng Những tế bào hình đài thuộc bề mặt nhãn cầu tiết mucin, thành phần quan trọng màng phim nước mắt Hai đặc tính biểu mô bề mặt nhãn cầu biểu mơ khơng sừng hố tiết mucin, đóng vai trị quan trọng để đảm bảo bền vững màng phim nước mắt Mặt khác, bề mặt nhãn cầu hỗ trợ thành phần có nước mắt vitamin A, yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal Growth FactorEGF), yếu tố phát triển chuyển dạng ß1, ß2 (Transforming Growth Factor-TGF- ß1, ß2), yếu tố phát triển nguyên bào sợi (basic Fibroblast Growth Factor-FGFb) 1.1.4.3 Các tuyến lệ Thành phần không quan trọng màng phim nước mắt nước mắt chất điện phân loại protein tuyến lệ tuyến lệ phụ tiết Nước mắt quan trọng mặt chất lượng mà quan trọng số lượng Trong trường hợp bỏng mắt toàn hệ thống tuyến lệ phụ bị tổn hại với biểu mơ bề mặt nhãn cầu, màng phim nước mắt bị phá huỷ hồn tồn, gây tình trạng khơ mắt nặng nề 1.1.4.4 Sự tồn vẹn hai cung phản xạ điều tiết nước mắt Sự khởi phát hai cung phản xạ điều tiết nước mắt bắt nguồn từ cảm giác bề mặt nhãn cầu, gây ảnh hưởng tới trình điều tiết nước mắt chớp mi mắt Trên mắt bị bỏng, toàn bề mặt nhãn cầu bị tổn thương kèm theo nhánh thần kinh cảm giác cho bề mặt nhãn cầu bị tổn thương Do vậy, tình trạng khô mắt ngày nặng nề giảm sút trầm trọng số lượng chất lượng nước mắt tần số chớp mắt 1.1.4.5 Chức tế bào biểu mô BMNC hỗ trợ nguyên bào sợi nhu mô chất Sự suốt giác mạc phụ thuộc vào xếp sợi collagen đồng kích thước sợi khoảng cách sợi Trong q trình hàn gắn biểu mơ giác mạc, chất ngoại bào có chứa thành phần Fibronectin, enzym protease, yếu tố phát triển có vai trị định kết dính di chuyển bề mặt chân bì giác mạc tế bào biểu mô 1.2 Màng ối phương pháp xử lý màng ối làm nuôi cấy 1.2.1 Màng ối Màng bọc thai gồm màng liên kết với nhau: màng ối, màng đệm, màng rụng Màng ối lớp tiếp giáp với buồng ối có độ dày khác tuỳ theo vị trí Màng ối gồm: Biểu mô, màng đáy tiếp đến tổ chức liên kết mỏng, khơng có mạch máu (Hình 1.3) [19] }Màng ối Hình 1.3 Cấu tạo màng rau thai người Biểu mô; Màng đáy; Lớp đặc; Màng đệm nhẵn; Màng rụng tử cung Màng ối có nhiều đặc điểm vượt trội so với màng sinh học khác là: tính chun giãn, tính suốt, mềm mại, nhẵn bóng, mỏng, khó rách Theo nghiên cứu tác giả Fukuda K cộng (1999), màng đáy màng ối hoàn toàn giống với màng đáy kết mạc có chứa collagen typ IV, V, fibronectin, laminin-1, laminin-5, màng ối sử dụng để thay kết mạc [12] Các thành phần đóng vai trị quan trọng biệt hoá tăng sinh tế bào biểu mô