Đánh giá hoạt tính estrogen của một số dịch chiết trong dung môi ethanol từ một số cây thuốc bằng phương pháp in vitro và in vivo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - HOÀNG MINH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ESTROGEN CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TRONG DUNG MƠI ETHANOL TỪ MỘT SỐ CÂY THUỐC BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP IN VITRO VÀ IN VIVO LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - HOÀNG MINH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ESTROGEN CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT TRONG DUNG MÔI ETHANOL TỪ MỘT SỐ CÂY THUỐC BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP IN VITRO VÀ IN VIVO CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN BÁ TIẾP HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Hồng Minh Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngồi cố gắng thân, tơi nhận quan tâm giúp đỡ tổ chức, quan, nhà khoa học, thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp người thân gia đình Nhân dịp này, tơi xin cảm ơn giúp đỡ giảng viên khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam giảng dạy suốt thời gian học tập Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc hướng dẫn, giúp đỡ chân tình, đầy trách nhiệm hết lịng khoa học TS Nguyễn Bá Tiếp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình, đồng nghiệp quan tâm, động viên giúp hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Hoàng Minh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vi Danh mục hình viii MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hệ nội tiết chất gây rôi loạn nội tiết 1.1.1 Hệ nội tiết 1.1.2 Estrogen 1.1 Chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine disruptor coumpounds – EDCs) 1.2 Cơ chế ảnh hưởng đến hệ nội tiết EDCs 10 1.3 Ảnh hưởng EDCs 11 1.3.1 Ảnh hưởng đến sinh sản 11 1.3.3 Ảnh hưởng đến não 13 1.3.4 Tác động gây ung thư phụ thuộc hóc-mơn 13 1.3.5 Bisphenol A ảnh hưởng đến nội tiết Bisphenol A 14 1.4 Các hợp chất thiên thiên tác động đến hệ nội tiết 16 1.4.1 Khái niệm phytoestrogen 16 1.4.2 Tác động phytoestrogen 16 Chương 2: NGUYÊN LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Vật liệu nghiên cứu 26 2.3.1 Nấm men tái tổ hợp (recombinant yeast) tế bào dòng (cell line) 26 2.3.2 Các loại môi trường dung dịch đệm 27 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page iv C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.3.3 Hóa chất, dụng cụ 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Phương pháp dùng nấm tái tổ hợp (recombinant yeast asay): 28 2.4.2 Phương pháp kiểm tra khả kích thích nhân lên tế bào ung thư vú người (MCF-7 cell proliferation asay hay E- screen) 29 2.4.3 Phương pháp nhiễm gen dùng tế bào ung thư gan người (transient transfection assay in HepG2 human hepatoma cancer cells) 29 2.4.4 Thí nghiệm đánh giá tác động chất chiết đến tử cung chuột chưa trưởng thành 30 2.4.5 Làm tiêu vi thể theo quy trình tẩm đúc mẫu parafin sau nhuộm HE (Haematoxilin - Eosin) 30 2.4.6 Phương pháp phân tích thống kê 31 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Khả gắn với estrogen receptor chất chiết 32 3.2 Khả gắn với androgen receptor chất chiết 36 3.3 Khả kích thích phân bào MCF – chất chiết từ cát 38 3.4 Kết kiểm tra tế bào ung thư gan người nhiễm gen 40 3.5 Ảnh hưởng chất chiết từ cát chuột thí nghiệm 41 KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page v C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CD : Thạch hộc MT : Thông thảo RC : Hương phụ PZ : Bạch hoa xà RP : Cát RPG : Tam thất V : Ethanol E : 17β-estradiol T : Testosteron BPA : Bisphenol A Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page vi C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Phân nhóm thí nghiệm 30 3.1 Ảnh hưởng chất chiết cát đến khối lượng tử cung âm đạo 42 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page vii C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH STT 1.1 Tên hình Trang Cấu trúc phân tử estradiol (trái) GEN (phải) Estradiol có phân tử lượng 272,38196 (g/mol); công thức phân tử C18H24 O2 Genistein có phân tử lượng 270,2369 (g/mol), cơng thức phân tử C15H10O5 18 1.2 Các chế tác động phytoestrogen 21 2.1 Hoàng thảo (trái) vị thuốc Thạch hộc (phải) 22 2.2 Cây thơng vị thuốc Thông thảo 23 2.3 Cỏ gấu vị thuôc Hương phụ 23 2.4 Cây Bạch tuyết hoa vị thuốc Bạch hoa xà 24 2.5 Sắn dây vị thuốc Cát 25 2.6 Cây Tam thất bắc vị thuốc Tam thất 25 Ảnh hưởng chất chiết nồng độ khác đến estrogen receptor 34 Ảnh hưởng nồng độ chất chiết đến estrogen receptor nấm tái tổ hợp 35 3.3 Ảnh hưởng chất chiết đến nấm tái tố hợp mang androgen 37 3.4 Ảnh hưởng chất chiết từ Cát đến nhân lên tế bào ung thư 38 Ảnh hưởng chất chiết từ Cát đến tế bào ung thư gan (HepG2 cells) nhiễm gen 40 3.6 Tử cung chuột nhóm đối chứng 44 3.7 Tử cung chuột nhóm cho uống chất chiết Cát (100 mg/kg.ngày) 3.8 44 Tử cung chuột nhóm đối chứng dương (tiêm BPA) có biểu tăng sinh biểu mơ tuyến, phù tổ chức liên kết (mũi tên trái); tăng sinh biểu mô phủ biểu mô tuyến (mũi tên xanh, phải), tăng tuần hoàn (mũi tên đen phải) thành mạch máu (mũi tên đậm phải) Tiêu nhuộm HE Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 45 Page viii C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Trong hai thập kỷ gần đây, nhiều nghiên cứu chất hoá học gây rối loạn nội tiết tố người động vật công bố (Kang cs., 2002) Những hoá chất gây rối loạn sinh sản cách bắt chước ức chế hormon sinh dục 17β-estradiol testosteron cách gắn với quan thụ cảm hormon (estrogen receptor androgen receptor) từ gây ảnh hưởng đến biểu gen phụ thuộc hormon (Vinggaard, 1999) Ở phụ nữ mãn kinh, tượng giảm estrogen nội sinh dẫn đến nhiều biểu không mong muốn chứng bốc hỏa, bệnh loãng xương, tăng nguy mắc bệnh tim mạch, rối loạn trương lực bàng quang gây tiểu rắt Trong thời gian dài, liệu pháp thay hormone (bổ sung estrogen bù đắp cho thiếu hụt hormone nội sinh) xem giải pháp hữu hiệu hạn chế biểu không mong muốn hội chứng mãn kinh Tuy nhiên, dùng estrogen dẫn đến tác dụng khơng mong muốn làm tăng nguy ung thư tử cung, tăng tỷ lệ bệnh tim mạch, tăng nguy ung thư vú Chính vậy, nhiều nghiên cứu tìm kiếm chất thay hormone khơng phải estrogen hay hormone thuộc nhóm steroid khác Trong nguồn nguyên liệu , hợp chất thiên nhiên chủ yếu chất từ thực vật coi nguồn nguyên liệu tiềm Đến nay, nhiều sản phẩm dùng dạng thực phẩm chức năng, mỹ phẩm dược phẩm lưu hành thị trường phát triển từ nghiên cứu Các hợp chất thực vật có hoạt tính hormone sinh dục gọi phytoestrogen sử dụng liệu pháp thay hormon (Johnson cs., 2001) Cũng estrogen tự nhiên, phytoestrogen tiềm tàng nguy gây tác dụng không mong muốn Tại nước phát triển, việc chứng nhận sản phẩm phytoestrogen thực chặt chẽ Các nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm sản phẩm lý tưởng với ảnh hưởng phụ nguy gây “tác động xấu” thấp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an thể Hương phụ có hoạt tính progesterone Tuy nhiên, giả thuyết cần chứng minh thí nghiệm khác Tam thất làm tăng khối lượng tử cung động vật thí nghiệm (Đỗ Tất Lợi, 2000) Tăng khối lượng tử cung tác động chất có hoạt tính tương tự estrogen Trong thí nghiệm này, chất chiết với dung môi ethanol vị thuốc khơng có khả gắn với ER Điều cho thấy số khả Tam thất: (1) có hoạt tính ngược estrogen, (2) có hoạt tính tương tự progesteron, (3) có hoạt tính tương tự estrogen khơng qua đường tác động cần bước gắn receptor, (4) tác động đến tử cung không qua chế hormone – receptor - tế bào đích Tất khả cần chứng minh Chất chiết từ cát (RP) làm tăng hoạt tính enzym nồng độ 1µg/ml Mức tăng đạt cao so với tất chất chiết lại nồng độ thử Giá trị biểu hoạt tính Cát nồng độ 1µg/ml cịn cao đối chứng dương (estradiol) Hoạt tính giảm nồng độ thử 5µg/ml Khi nồng độ tăng lên 10 lần (10µg/ml) chất chiết khơng cịn ảnh hưởng đến hoạt tính β-galactosidase Trong chế tương tác chất - receptor, nồng độ chất số lượng receptor yếu tố định trình kết hợp Nếu tỷ lệ hai yếu tố không đảm bảo giá trị tối ưu, hoạt tính chất giảm Trong thí nghiệm này, nồng độ 1µg/ml nồng độ tối ưu chất chiết Cát Chansakaow (2000) nghiên cứu hoạt tính hormon Pueraria mirifica, loài thực vật họ với Pueraria thompsoni chứng minh chất chiết từ Pueraria mirifica có hoạt tính estrogen Trong nghiên cứu Cát lựa chọn để kiểm tra hoạt tính estrogen mơi trường nội bào 3.2 Khả gắn với androgen receptor chất chiết Androgen receptor estrogen receptor thuộc nhóm receptor nhân (nuclear receptor) có chế kích hoạt tương tự Trong nghiên cứu hóa chất gây rối loạn sinh sản, với hoạt tính estrogen, đánh giá tính chất tương tự hay đối kháng androgen thường quan tâm Hoạt tính androgen tiêu có tính chất ‘chỉ điểm” cho nghiên cứu nhóm gây rối loạn hay kích thích khả sinh sản đực nam giới (Meeker, 2010; Salazar-Arredondo cs, 2008) Bước sàng lọc kiểm tra khả gắn với androgen Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page 36 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an receptor Hệ thống nấm men tái tổ hợp receptor chuyển vào nấm men enzym điểm sử dụng nghiên cứu để đánh giá khả gắn với androgen receptor chất chiết từ Thạch hộc, Thông thảo, Hương phụ, Bạch hoa xà Tam thất Kết thể hình 3.3 Ở bước kiểm tra này, hai mức nồng độ 1µg/ml 10µg/ml chất chiết sử dụng Khả gắn với androgen receptor đánh giá qua hoạt tính β-galactosidase Khơng chất chiết làm thay đổi hoạt tính β-galactosidase đo bước sóng 450 nm (so với đối chứng âm) Trong testosterone làm tăng rõ rệt hoạt tính β-galactosidase Tuy nhiên kết chưa đủ để khẳng định chất chiết có hoạt tính hormone sinh dục đực hay khơng chúng cịn tác động theo chế khơng phụ thuộc receptor Nhiều nghiên cứu chứng minh chất có hoạt tính estrogen làm giảm hoạt tính androgen từ ảnh hưởng đến q trình hình thành thành thục tinh trùng số động vật thí nghiệm (Cocco, 2002; Kojima cs., 2004, Vinggaard cs., 1999) Hấp thụ ánh sáng bưc sóng 415nm 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 C V CD CD10 MT1 MT10 RC1 RC10 PZ1 PZ10 PPG1 PPG10 T Hình 3.3 Ảnh hưởng chất chiết đến nấm tái tố hợp mang androgen receptor (C, đối chứng; V, EtOH 1%; CD1, MT1, RC1, PZ1, RP1& RPG1,1µg/ml; CD10, MT10, CR10, PZ10, RP10 & RPG10,10µg/ml; T, Testosteron 5x 10-9 M.) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page 37 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.3 Khả kích thích phân bào MCF – chất chiết từ cát Phương pháp dùng nấm men tái tổ hợp xác định chất có khả gắn với estrogen receptor khơng xác định chất có tác động tương tự estrogen hay đối kháng estrogen Phương pháp xác định mức độ kích thích q trình phân bào MCF – giúp trả lời câu hỏi Trong chất chiết kiểm tra nấm men tái tổ hợp, Cát thể hoạt tính cao lựa chọn cho bước nghiên cứu Các nồng độ chất chiết Cát dùng để kiểm tra gồm 10; 20; 50; 100 1000 µg/ml Các hộp cấy thêm ethanol đối chứng (V) Hộp cấy bổ sung estradiol dùng làm đối chứng dương (E) Trong y khoa, 4-hydroxytamoxifen (OHT) sử dụng làm thuốc điều trị ung thư vú Các đĩa cấy bổ sung hỗn hợp chất chiết cát 4hydroxytamoxiifen (RP4+OHT) nhằm xác định khả cạnh tranh/đối kháng với thuốc chất chiết tế bào ung thư vú TỈỉ lệ nhân lên tế bào so với đối chứng (%) 400 350 300 250 200 150 100 50 V E RP1 RP2 RP3 RP4 RP5 Hình 3.4 Ảnh hưởng chất chiết từ Cát đến nhân lên tế bào ung thư vú (MCF-7 cells) ( V, EtOH 0,l%; RP1, 10µg/ml; RP2,20µg/ml; RP3,100µg/ml; RP4, 200µg/ml; RP5 1000 µg/ml; OHT,10-6M 4-hydroxytamoxiifen (*, p < 0,05)) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page 38 RP4 + OHT C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tế bào MCF mang estrogen receptor Do đó, chất có hoạt tính estrogen coi tế bào đích Sau gắn với receptor, phức hợp chất – receptor di chuyển vào nhân tế bào, tác động đến yếu tố tương tác hormone DNA dẫn đến biểu gene đích (target genes) Với MCF-7 cell, estrogen tác động làm tăng trình phân chia tế bào môi trường nuôi cấy (Diel cs., 1999; Farina cs., 2006) Kết (hình 4.4) cho thấy chất chiết từ Cát kích thích phân bào MCF-7 nồng độ 10µg/ml, 20 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml so với đối chứng (V) (p < 0,05) Như vậy, nồng độ này, chất chiết Cát có hoạt tính tương tự estrogen tế bào MCF-7 Hoạt tính estrogen Cát nồng độ cao (1000 µg/ml) Có hai khả sảy ra: (1) Cát nồng độ cao phá vỡ cân chất – receptor (2) Cát nồng độ cao gây chết tế bào ung thư qua chế gây độc tế báo (cytotoxic) Khả thứ loại trừ tế bào ung thư vú có khả phân chia vơ hạn cung cấp đủ chất dinh dưỡng mơi trường ni cấy khó có tượng “thiếu receptor” để tiếp nhận chất Như vậy, khả thứ hai dễ chấp nhận hơn, nồng độ cao Cát làm giảm số lượng tế bào ung thư qua chế gây độc tế bào Nhiều nghiên cứu gần cho thấy phytoestrogen có hoạt tính estrogen tế bào ung thư vú, hoạt tính phụ thuộc vào nhiều yếu tố đặc điểm hợp chất, tình trạng receptor, diện hormone môi trường nội bào, yếu tố tăng trưởng, yếu tố dịch mã (Benassayag cs.,2002; Hu cs.,2000) Kết cho tế bào ung thư vú thích nghi nhân lên mơi trường có nồng dộ phytoestrogen thấp nồng độ cao có ảnh hưởng ngược lại tác dụng độc hoá chất Hoạt tính estrogen Cát tăng dần từ cồng độ 10 µg/ml đến 200 µg/ml cho thấy khoảng nồng độ này, hoạt tính tỷ lệ thuận với nồng độ Khi kết hợp chất chiết từ Cát (200 µg/ml với OHT nổng độ 10-6M), tác dụng kích thích phân bào cát bị chất kháng estrogen ức chế Kết minh chứng chất chiết Cát hạn chế tác dụng thuốc điều trị ung thư vú Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page 39 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tamoxifen điều kiện in vitro Điều góp phần khẳng định hoạt tính tương tự estrogen chất chiết Cát Trong điều trị ung thư vú, yếu tố dinh dưỡng đóng vai trị quan trọng Từ khái niệm phytoestrogen đời, bác sĩ điều trị ung thư vú tư vấn bệnh nhân tránh thức ăn hay loại thuốc kích thích tương tự estrogen Vậy, để hạn chế nguy ung thư vú đảm bảo tác dụng thuốc điều trị ung thư vú, Cát đưa vào danh mục khuyến cáo 3.4 Kết kiểm tra tế bào ung thư gan người nhiễm gen Phương pháp có độ nhạy cảm thấp so với hai phương pháp lại có khả nghiên cứu ảnh hưởng trình trao đổi chất nội bào đến hoạt tính estrogen hợp chất (Lei cs., 2002) Kết cho thấy chất chiết từ Cát làm tăng hoạt tính luciferase nồng độ 10 µg/ml,20 µg/ml 100 µg/ml so với đối chứng mức nồng độ 200 µg/ml khơng làm thay đổi hoạt tính luciferase so với đối chứng âm (C) đối chứng bổ sung ethanol (V) Nồng độ 20 µg/ml cho hoạt tính luciferase cao (tương đương đối chứng dương estrdiol) nồng độ 200 100µg/ml khơng làm tăng hoạt tính enzym thị (p < 0,05) (hình 3.5) 1200 1000 Hoạt hóa Luciferase 800 600 400 200 C V E RP1 RP2 RP3 RP4 RP5 Hình Ảnh hưởng chất chiết từ Cát đến tế bào ung thư gan (HepG2 cells) nhiễm gen Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Page 40 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an ( C, đối chứng; V, EtOH 0,1%; RPl, 10µg/ml; RP2,20µg/ml; RP3, 100µg/ml, RP4, 200µg/ml; RP5 1000µg/ml (* p