Nghiên cứu khả năng xử lý các hợp chất chứa nitơ, phốtpho trong nước thải bằng sự kết hợp giữa vi tảo chilorella vugaris và vi khuẩn azospirillum sp được phân lập từ rễ lúa

ại Đ c họ Đ g ẵn N ại Đ c họ Đ g ẵn N ại Đ c họ Đ g ẵn N ại Đ c họ Đ g ẵn N ại Đ c họ Đ g ẵn N ại Đ c họ Đ g ẵn N ại Đ c họ Đ g ẵn N ại Đ c họ Đ g ẵn N MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bước vào kỉ XXI, ngành chăn nuôi nước ta tăng trưởng nhanh chóng, góp phần quan trọng vào phát triển kinh tế cùa đất nước Trong cấu ngành nông nghiệp Việt Nam, giá trị sản xuất sản phẩm chăn nuôi chiếm 24,6% Bên cạnh ích lợi mang lại, ngành chăn ni khiến cho môi trường bị ô nhiễm cách trầm trọng, làm ảnh hưởng đến sức khỏe người phá hủy hệ sinh thái tự nhiên nước thải từ trang trại đổ chưa qua xử lý xử lý biện pháp đơn giản, không đạt tiêu chuẩn xả thải Trong số đó, phải kể đến nguồn nước thải từ trang trại chăn nuôi heo với hàm lượng chất thải rắn, chất dinh dưỡng (nitơ, phốtpho…), vi sinh vật (VSV) gây bệnh cao gấp nhiều lần so với tiêu chuẩn cho phép Trên thực tế, nước ta vấn đề xử lý nguồn nước thải ô nhiễm thường ại Đ bị bỏ qua Do đó, việc xử lý khối lượng lớn nước thải phát sinh từ ngành chăn nuôi gia súc nhu cầu cấp thiết ngành công nghiệp môi trường (Nguyễn Thị Đông Phương, 2017) Với mục đích hướng đến mơi trường sinh thái bền vững năm gần họ việc xử lý nước thải chăn nuôi vi sinh vật nhiều nhà khoa học quan c tâm Nguyên lý phương pháp sử dụng chất khống chất hữu có sẵn nước thải tạo môi trường sống cho vi sinh vật biến đổi hợp chất khó phân giải thành chất đơn giản (Lê Thị Siêng, 2009) Trong trình vi sinh vật tiếp thu chất làm vật liệu để xây dựng tế bào, từ phát triển sinh sản làm cho sinh khối tăng lên Đ g ẵn N Trong số vi sinh vật, vi tảo đối tượng ứng dụng rộng rãi (Gonzalez cs., 1997) Phương pháp xử lý sinh học vi tảo ý đặc biệt nhờ vào khả quang hợp nó, chuyển đổi lượng mặt trời vào trình tích lũy sinh khối sử dụng hợp chất dinh dưỡng nitơ phốtpho để sinh trưởng (Abdel-Raouf cs., 2012) Được khai thác nhiều tất lồi tảo Chlorella vulgaris (C vulgaris) Tuy nhiên, bên cạnh hiệu loại bỏ số chất hữu tế bào tảo sản phẩm phụ, làm tái nhiểm nguồn nước Có số phương pháp để thu tế bào tảo từ nguồn nước đông tụ - kết bông, làm chúng lên khí hịa tan, tự kết bơng phương pháp địi hỏi thêm chi phí đầu tư với giá thành cao cần kỹ thực Sự kết hợp vi khuẩn nội sinh chủng Azospirillum sp vi tảo C vulgaris cách cố định hạt alginate xem công cụ việc tạo phương pháp xử lý nước thải Tương tác vi khuẩn vi tảo làm kích thích phát triển vi tảo C vulgaris nhờ phytohormone chủng vi khuẩn Azospirillum sp tiết ra, từ đó, làm tăng khả loại bỏ chất dinh dưỡng nước thải ((Bashan and Levanony, 1990; Dao cs., 2018; De-Bashan cs., 2008; Han cs., 2018; Peng cs., 2020; Raffi and Charyulu, 2021; Zhang cs., 2021) Bên cạnh đó, việc cố định vi khuẩn vi tảo hạt alginate giúp trình thu gom sản phẩm sau xử lý trở nên thuận tiện Xuất phát từ lí luận thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu khả xử lý nitơ, phốtpho nước thải kết hợp vi tảo Chlorella vulgaris vi khuẩn Azospirillum sp phân lập từ rễ lúa” Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài khảo sát hiệu xử lý hợp chất nitơ, phốtpho nước thải chăn nuôi kết hợp vi khuẩn Azospirillum sp vi tảo C vulgaris cố định hạt alginate, từ đó, tạo liệu khoa học cho việc nghiên cứu mơ hình xử lý nước thải ứng dụng thực tiễn Đ ại Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn Azospirillum sp từ mẫu rễ lúa địa bàn huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam họ - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa tuyển chọn chủng c Azospirillum sp phân lập - Nghiên cứu định danh chủng phân lập thuộc chi Azospirillum sp phương pháp PCR giải trình tự - Xây dựng đường cong sinh trưởng khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng loài vi khuẩn định danh Đ g ẵn N - Khảo sát ảnh hưởng chủng vi khuẩn Azospirillum sp đến sinh trưởng vi tảo C vugaris đồng cố định hạt alginate - Đánh giá hiệu loại bỏ hợp chất chứa nitơ, phốtpho nước thải chăn nuôi kết hợp vi tảo C vugaris vi khuẩn Azospirillum sp Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết thực đề tài chứng tỏ việc đồng cố định vi khuẩn Azospirillum sp vi tảo C vulgaris hạt alginate để xử lý nước thải có tải trọng chất nhiễm cao nước thải chăn nuôi khả quan sở khoa học để triển khai thực tế 4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết nghiên cứu đề tài khoa học cho việc ứng dụng mơ hình xử lý nước thải ứng dụng thực tiễn địa phương - Góp phần tạo cơng nghệ cải tạo, nâng cấp hệ thống xử lý nước thải có, đảm bảo hiệu xử lý, đáp ứng tiêu chuẩn xả thải Cách tiếp cận Đề tài tiến hành dựa nghiên cứu tổng quan sử dụng vi tảo C vulgaris đồng cố định với vi khuẩn Azospirillum sp hạt alginate để xử lý ô nước thải dựa vào đặc điểm sinh học loài sinh vật ại Đ c họ Đ g ẵn N CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát ngành chăn nuôi heo nước thải chăn ni 1.1.1 Tình hình phát triển chăn nuôi heo Việt Nam Chăn nuôi hai ngành sản xuất chủ yếu nông nghiệp bên cạnh trồng trọt, với đối tượng loại động vật nuôi nhằm cung cấp sản phẩm đáp ứng nhu cầu người Việc hình thành phát triển trang trại chăn nuôi heo nước ta đem lại hiệu kinh tế cao, tăng suất, chất lượng lao động người nông dân Tuy nhiên nhiều vấn đề phải lưu ý đặc biệt chất thải từ trang trại cần có biện pháp xử lý thích hợp để khơng gây ảnh hưởng xấu đến môi trường tự nhiên sức khỏe người ại Đ 1.1.2 Tổng quan nước thải chăn nuôi Nước thải chăn nuôi hỗn hợp nước bao gồm nước tiểu, nước rửa chuồng, nước tắm vật ni Trong nước thải chăn ni ln chứa phần hay toàn lượng phân thải Nước thải dạng chất thải chiếm khối lượng lớn chăn nuôi Thành phần chất thải chủ yếu trang trại chăn ni gồm có: phân, nước tiểu họ gia súc chất độn chuồng; nguyên liệu, thức ăn chăn nuôi dư thừa; xác gia súc, gia c cầm chết; hoá chất thất thoát (hoá chất tiêu độc, khử trùng); phụ phẩm nông nghiệp (thân cây, cành, lá, vỏ, hạt)… Trong thành phần chất thải nêu trên, đối tượng cần quan tâm đặc biệt phân nước tiểu vật nuôi Thành phần N, P VSV gây hại có phân nước tiểu từ vật nuôi gây ô nhiễm khơng khí mà cịn làm nhiễm đất, nước mặt nguồn nước ngầm Chính vấn đề xử lý nước thải Đ g ẵn N chăn nuôi heo trước xả thải môi trường u cầu có tính cấp thiết cao 1.2 Tổng quan vi tảo Chlorella vulgaris vi khuẩn Azospirillum sp 1.2.1 Sơ lược vi tảo Chlorella vulgaris C vulgaris loài tảo xanh cây, thuộc phân loại khoa học sau đây: tên miền: Eukaryyota, giới: Protista, nhóm: Chlorophyta, lớp: Trebouxiophyceae, bộ: Chlorellales, họ: Chlorellaceae, chi: Chlorella, lồi: C vulgaris (Safi cs., 2014) Hình 1.1 Vi tảo C vulgaris (Lim cs., 2010) ại Đ C vulgaris nhà nghiên cứu Hà Lan tên Martinus Willem Beijerinck phát vào năm 1890 Chlorella xuất phát từ “Cholos” có nguồn gốc tiếng Hy Lạp, có nghĩa màu xanh hậu tố “ella” tiếng La Tinh nghĩa có kích thước nhỏ Đây loài vi tảo đơn bào phát triển nước có mặt từ thời kỳ tiền Cambri cách họ ngày 2,5 tỷ năm c 1.2.2 Sơ lược vi khuẩn Azospirillum brasilense Vi khuẩn A brasilense phân loại sau: Lớp (Class): Alphaproteobacteria; Bộ (Ordo): Rhodospirillales; Họ (Familia): Rhodospirillaceae; Chi (Genus): Azospirillum; Loài: A brasilense Đ g ẵn N Hình 1.2 Vi khuẩn A brasilense (Bashan cs., 2004) Vi khuẩn A brasilense loại vi khuẩn cố định nitơ điều kiện kị khí Ban đầu vi khuẩn phân lập từ đất nghèo nitơ Hà Lan vào năm 1925 Sau đó, tìm thấy rộng rãi khắp thân rễ cỏ khắp giới nơi thúc đẩy phát triển 1.1.3 Sự kết hợp vi tảo vi khuẩn hạt alginate Nuôi cấy vi khuẩn A brasilense kết hợp với vi tảo điều kiện nuôi cấy tổng hợp nước thải bán liên tục làm tăng đáng kể việc loại bỏ ion amoni phốtpho hịa tan chúng làm tăng khả sinh trưởng phát triển tảo Sự phát triển vi tảo vi khuẩn tiên tiến phục vụ công cụ việc tạo phương pháp xử lý nước thải lạ (de-Bashan LE cs., 2002) Một số kết hợp chúng cố định hạt alginate 1.3 Một số nghiên cứu nước nước xử lí nước thải vi tảo C vulgaris Sự kết hợp vi khuẩn nội sinh nhóm Azospirillum sp vi tảo C vulgaris công cụ việc tạo phương pháp xử lý nước thải Tương tác vi khuẩn vi tảo làm kích thích phát triển vi tảo C vulgaris nhờ ại Đ phytohormone chủng vi khuẩn Azospirillum sp tiết ra, từ làm tăng khả loại bỏ nitơ (chủ yếu amoni) phốtpho xử lí nước thải đặc biệt nước thải chăn nuôi c họ Đ g ẵn N CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn Azospirilum sp phân lập từ mẫu rễ lúa thu nhận khu vực xã Đại Cường, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam Chủng vi tảo C vulgaris cung cấp phòng thí nghiệm thuộc Khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học sư phạm Đà Nẵng Hạt alginate đồng cố định vi khuẩn ại Đ A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris Nước thải chăn nuôi thu thập từ số trang trại chăn ni heo Hịa Hình 2.1: Hạt alginate đồng cố Bắc, Hòa Vang định A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris c họ Đ 2.2 Phạm vi nghiên cứu 2.2.1 Phạm vi không gian - Phịng thí nghiệm (PTN) Vi sinh - Sinh lý thực vật - Hóa sinh, PTN Cơng nghệ sinh học, PTN Sinh học phân tử, PTN công nghệ tảo thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng - Địa điểm thu thập nước thải ngồi thực địa: số trang trại chăn ni heo g ẵn N Hòa Bắc, Hòa Vang - Địa điểm thu mẫu rễ lúa: Xã Đại Cường, Huyện Đại Lộc, Tỉnh Quảng Nam 2.2.2 Phạm vi thời gian Nghiên cứu thực từ tháng 9/2019 đến tháng 12/2021 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Môi trường sử dụng để phân lập môi trường vô đạm NFb bán lỏng (MT1) Tất lồi vi khuẩn Azospirillum sp phát triển môi trường MT1 phát triển chúng hình thành lớp váng mỏng phía bề mặt mơi trường, phản ứng vi hiếu khí (Nguyễn Lân Dũng cs., 1976) 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng phân lập a) Đặc điểm hình thái Khuẩn lạc vi khuẩn sau ngày nuôi cấy môi trường Dobereiner quan sát kính lúp nhằm ghi nhận hình dạng, kích thức màu sắc khuẩn lạc b) Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa Thử nghiệm catalase Thử nghiệm Oxidase Thử nghiệm khả sinh Indole (AA) Khả di động 2.3.3 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn kỹ thuật sinh học ại Đ phân tử Phương pháp định danh chủng vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử bao gồm bước sau đây: a) Nuôi cấy sinh khối vi khuẩn chọn lọc b) Tách chiết tinh DNA tổng số họ c) Khuếch đại vùng gen c d) Điện di sản phẩm ADN e) Đọc trình tự đoạn gen định danh loài Azospirillum sp Sản phẩm PCR gửi đến “Công ty TNHH Phát Triển Công Nghệ Ứng Dụng Việt Nam” để đọc trình tự đoạn gen Kết đọc trình tự so sánh ngân hàng gen NCBI để định danh loài vi Đ g ẵn N khuẩn 2.3.4 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn định danh Tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lý chúng việc khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường (pH, nhiệt độ) đến trình sinh trưởng a Nhiệt độ Chuẩn bị môi trường tăng sinh Dobereiner, tiến hành nuôi cấy lắc với tốc độ 200 vòng/phút dãy nhiệt độ 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C Sau ngày, tiến hành đếm số lượng CFU b pH Chuẩn bị môi trường Dobereiner, khảo sát dãy pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, Tiến hành nuôi cấy lắc với tốc độ 200 vòng/phút nhiệt độ chọn mục a Sau ngày, tiến hành đếm số lượng CFU Xác định khoảng pH mà số CFU đạt giá trị cao (số lượng vi sinh vật nhiều nhất) khoảng pH tối ưu cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật 2.3.5 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn định danh Tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn môi trường Dobereiner với giá trị pH mục b nuôi điều kiện nhiệt độ mục a Sau tiến hành khảo sát tăng trưởng chủng vi khuẩn thời gian 120h Sau 6h tiến hành thu mẫu cấy sang mơi trường NFb có bổ sung dung dịch congo đỏ 0.25% ủ ngày điều kiện nhiệt độ mục a đếm số lượng CFU 2.3.6.Phương pháp cố định vi khuẩn vi tảo hạt alginate Để thu nhận tế bào, tiến hành ly tâm 100ml dịch nuôi cấy vi tảo C vulgaris (26,6.106 tế bào/ml) 100ml dịch nuôi A brasilense Azo09 (7.106 CFU/ml) 4000 ại Đ vòng 20 phút Sau ly tâm rửa lần dung dịch muối NaCl 0,85% khử trùng, sau tái huyền phù tế bào tảo 20ml dung dịch NaCl 0,85% , tương tự vi khuẩn 10ml dung dịch NaCl 0,85% Để cố định hai vi sinh vật hạt alginate, môi trường nước họ muối tái huyền phù tảo vi khuẩn, lấy 10ml trộn với Sau bổ sung 80ml c dung dịch alginate 2% vô trùng, dùng đũa khuấy chậm 15 phút Dùng ống xi lanh có chứa dung dịch dịch CaCl2 2% cho nhỏ giọt vào môi trường, trộn Các hạt tạo hành sau 1h ủ rửa với dung dịch nước muối khử trùng (Bashan, Y., 1986) Đ N g ẵn 2.3.7 Phương pháp đếm vi tảo C vulgaris Tiến hành đếm vi tảo C vulgaris hạt alginate buồng đếm hồng cầu Neubauer sau cho alginate tan dung dịch NaHCO3 4% (de-Bashan LE cs., 2002) 2.3.8 Phương pháp xác định tốc độ sinh trưởng vi tảo C vulgaris Tốc độ sinh trưởng tảo C vulgaris xác định theo cơng thức µ= 𝑙𝑛𝑁𝑡−𝑙𝑛𝑁0 𝑡 với Nt - mật độ tảo mẫu sau thời gian t ngày; No – mật độ tảo mẫu ngày đầu tiên; t thời gian kết thúc thí nghiệm (Krzeminska cs., 2014) 2.3.9 Phương pháp xác định tiêu hóa sinh nước thải a) Phương pháp xác định NH4+ phenat b) Phương pháp xác định PO43- nước theo TCVN 6202:2008 c) Phương pháp xác định T-N (tổng nitơ) – LR theo TCVN 6638:2008 d) Phương pháp xác định phốtpho tổng số e) Phương pháp xác định BOD5 theo TCVN 6001-2:2008 2.3.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm a) Thí nghiệm khảo sát khả kích thước sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 lên tảo C vulgaris đồng cố định hạt alginate Tiến hành đồng cố định chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris hạt alginate Vi khuẩn trước cố định nuôi môi trường LB với điều kiện thiết lập Sinh khối vi khuẩn trước cố định phải đạt mật độ ~109CFU/ml vi tảo ~6.106 tế bào/ml Lô đối chứng: vi tảo cố định mình; Lơ thí nghiệm: vi tảo đồng cố định với vi khuẩn hạt alginate Tiến hành nuôi môi trường BBM thời gian 15 ngày đếm mật độ vi tảo phát triển hạt alginate ngày thời gian 15 ngày b) Thí nghiệm thử nghiệm hiệu xử lý hợp chất chứa nitơ phốtpho Đ nước thải chăn nuôi không tiệt trùng hạt alginate đồng cố định vi khuẩn vi tảo ại vào họ Nước thải lấy từ trang trại chăn nuôi heo sau lọc cặn, để lắng sau 3-5 ngày, đưa xác định thông số NH4+-N, PO43 P, TN, TP BOD5 đầu c Bố trí lơ thí nghiệm xử lý nước thải: Lơ ĐC: Nước thải không bổ sung vi tảo; Lô TN1: Nước thải xử lý hạt alginate cố định vi tảo C vulgaris ; Lơ TN2: Nước thải xử lý hạt alginate đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris Tỉ lệ hạt alginate cố định vi tảo đồng cố định vi tảo vi khuẩn bổ sung vào lơ thí nghiệm 10% Thí nghiệm bố trí theo điều kiện: Tỉ lệ N/P= 10:1 (được điều chỉnh Đ g ẵn N cách cố định nồng độ P, điều chỉnh nồng độ N NH4Cl), pH 6,5 đường kính hạt alginate 6mm (Rhee and Gotham, 1980) Các lơ thí nghiệm xử lý nước thải điều kiện: ánh sáng 1000 lux, nhiệt độ 300C ± 2, chu kì sáng tối 16-8 có sục khí, xác định giá trị BOD5, TN, TP, NH4+N PO43 P đầu sau 12 ngày xử lý 2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập phân tích thống kê mơ tả phần mềm MS - Excel 2010 Sự sai khác có ý nghĩa thống kê nhóm nghiệm thức khảo sát phân tích phương sai ANOVA phân tích hậu định Tukey’s Test 10 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum sp từ mẫu rễ lúa Từ mẫu rễ lúa thu nhận khu vực Xã Đại Cường, Huyện Đại Lộc, Tỉnh Quảng Nam, phân lập 09 chủng vi khuẩn (kí hiệu Azo01 → Azo09) có khả sinh trưởng môi trường NFb bán lỏng Quan sát ống nghiệm chứa môi trường NFb sau ngày nuôi cấy chủng vi khuẩn phân lập nhận thấy màu sắc chuyển từ xanh sang xanh dương tạo vịng trắng đục (pellicle) cách mặt mơi trường khoảng 3-6mm Điều chứng tỏ dịng vi khuẩn Azospirillum tăng trưởng phát triển làm cho pH ại Đ môi trường NFb thay đổi, làm màu môi trường NFb chuyển dần từ màu xanh (pH trung tính) sang màu xanh dương (pH kiềm) Các nghiên cứu Azospirillum sp khẳng định vi khuẩn họ phát triển làm pH môi trường thay đổi nhanh c (Johanna Dobereiner cs., 1995) Đ Hình 3.1 Sinh khối vi khuẩn môi trường NFb bán lỏng Sau đó, nhóm tiến hành lấy khuẩn lạc vịng trắng đục (pellicle) tạo bề mặt ni cấy sang mơi trường NFb rắn có bổ sung dung dịch congo đỏ 0,25% chủng quan sát màu sắc khuẩn lạc Hình ảnh khuẩn lạc mơ tả hình 3.2 bảng 3.1 g ẵn N 11 ại Đ c họ Đ g ẵn N Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc chủng vi khuẩn (Azo01→Azo09) phân lập từ mẫu rễ lúa 12 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập từ rễ lúa mô tả bảng 3.1 Bảng 3.1 Đặc tính khuẩn lạc 09 dòng vi khuẩn phân lập STT Tên kí Vị trí hiệu phân lập Đặc tính khuẩn lạc Màu sắc Đặc điểm Đường kính Azo01 Rễ Đỏ đậm Trịn, bìa ngun, độ cao 1,00 Azo02 Rễ Hồng đậm Trịn, bìa ngun, nhầy, độ 0,90 cao Azo03 Rễ Đỏ tươi Trịn, bìa ngun, độ cao 2,1 Azo04 Rễ Đỏ tươi Trịn, bìa ngun, độ cao 1,10 Azo05 Rễ Hồng đậm Tròn, bìa nguyên, nhầy, độ lồi 1,20 Azo06 Rễ Đỏ tươi Trịn, bìa ngun, nhầy, độ lồi 1,30 Azo07 Rễ Đỏ tươi Trịn, bìa ngun, nhầy, độ cao 0,90 Azo08 Rễ Trịn, bìa ngun, độ cao 1,10 Azo09 Rễ ại Đ c họ Hồng Đ Hồng đậm 1,00 Trịn, bìa ngun, nhầy, độ lồi g ẵn N Đường kính khuẩn lạc trung bình dịng vi khuẩn 1,18mm Quan sát đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập nhận thấy, khuẩn lạc chúng có dạng trịn, bìa ngun, độ cao; số có nhầy lồi với nhiều màu sắc như: đỏ đậm (Azo01 Azo02), đỏ tươi (Azo03, Azo04, Azo06 Azo07), hồng đậm (Azo05, Azo08 Azo09) (do khả bắt màu đỏ congo đặc trưng chủng) Đường kính khuẩn lạc dịng vi khuẩn biến thiên khoảng 0,902,10mm, với đường kính trung bình 1,18mm Vì sử dụng mơi trường phân lập đặc trưng khuẩn lạc có sắc tố hồng, đỏ tươi nên nhóm nghiên cứu nhận định chủng vi khuẩn phân lập có xác suất cao thuộc chi Azospirillum (Brenner, D.J cs., 2005) Nhằm khẳng định điều này, tiến hành định danh đến tên chi chủng vi khuẩn, sử dụng phối hợp phương pháp nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào kính hiển vi, thử nghiệm catalase thử nghiệm oxidase khả sinh Indole-3-acetic acid (IAA) 13 3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Xác định Gram Quan sát kính hiển vi vật kính 100 cho thấy chủng vi khuẩn (Azo01 → Azo09) bắt màu hồng nhuộm gram Điều chứng tỏ chủng vi khuẩn thuộc nhóm gram âm (hình 3.3) Vi khuẩn gram âm lớp màng bao bọc tế bào chất cịn có thêm lớp màng khác cấu tạo phospholipid lipopolysaccharide Màng ngồi có chức lọc để chặn lại phân tử có kích thước lớn từ 600 đến 1000 Da Màng ngồi cịn có tính chọn lọc cao các hợp chất kỵ nước màng có phân tử lipophilic (Johanna Dobereiner cs., 1995) ại Đ c họ Đ g ẵn N Hình 3.3 Tế bào kính hiển vi chủng vi khuẩn (Azo01→Azo09) 14 Quan sát hình thái tế bào kính hiển vi cho thấy, ghi nhận tế bào chủng vi khuẩn có dạng hình que ngắn, nằm riêng rẽ nhau, không sinh bào tử b) Thử nghiệm oxidase Tiến hành thử nghiệm oxidase chủng vi khuẩn Azo01, Azo02, Azo03, Azo04, Azo05, Azo06, Azo07, Azo08, Azo09 (hình 3.4) ại Đ Hình 3.4 Thử nghiệm oxidase chủng vi khuẩn (Azo01→Azo09) (Chú thích: Đối chứng 1: mẫu trước thử hoạt tính, đối chứng 2: vi khuẩn E.coli) họ Kết thử nghiệm hình 3.4 cho thấy, chủng vi khuẩn (Azo01, Azo02, c Azo07, Azo08, Azo09) cho kết dương tính (thuốc thử Tetramethyl-pphenylenediamine dihydrochloride (TMPD) bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương) chủng lại (Azo03, Azo04, Azo05, Azo06) cho kết âm tính (khơng có tượng đổi màu) Đ g ẵn N c) Thử nghiệm catalase Nhóm nghiên cứu tiến hành thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Azo01, Azo02, Azo07, Azo08, Azo09 kết thí nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn Azo01, Azo08, Azo09 cho kết dương tính (có tượng sủi bọt nhỏ H2O2 3% lên khuẩn lạc vi khuẩn) chủng lại cho kết âm tính (khơng có tượng sủi bọt) (hình 3.5) 15 ại Đ c họ Đ Hình 3.5 Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Azo01, Azo02, Azo07, Azo08, Azo09 N g ẵn c) Thử nghiệm khả sinh Indole-3-acetic acid (IAA)  Định tính Tiến hành ni cấy vi khuẩn (Azo01, Azo08, Azo09) mơi trường Dobereiner rắn có bổ sung 0,01% tryptophan Đặt giấy lọc vô trùng lên vết cấy đưa ủ 30oC Sau ngày, lấy giấy lọc đặt lên giấy lọc khác bão hòa thuốc thử Salkowski Tiến hành đọc kết sau thời gian 30 phút Vi khuẩn có khả sinh tổng hợp IAA màu hồng với thuốc thử Kết thể hình 3.6 3.7 Hình 3.6 Mẫu ni cấy mơi trường chứa tryptopan chủng vi khuẩn Azo01, Azo08, Azo09 (ĐC - giấy lọc đặt đĩa mơi trường khơng có vi khuẩn) 16 Hình 3.7 Khả sinh IAA chủng vi khuẩn Azospirillum Đ (ĐC - IAA chuẩn nồng độ 1000ppm) Dựa vào kết thử nghiệm hình 3.6 3.7 nhận thấy chủng vi khuẩn thử nghiệm chủng Azo09 có khả sinh IAA (có phản ứng với thuộc ại thử Salkowski tạo màu hồng nhạt) (Templeman W G and Marmoy C J., 2008); (Tiwari, SB cs., 2004) Chúng tiếp tục tiến hành định lượng IAA chủng vi họ khuẩn Azo09 sinh c  Định lượng Tiến hành ni cấy lắc vi khuẩn 150 vịng/phút 32 ± 2oC ngày Mỗi ngày ly tâm thu dịch hòa với thuốc thử Salkowski theo tỷ lệ 1:4 So màu bước song 530nm Phản ứng màu hàm lượng IAA tạo thành thể hình 3.8 hình 3.9 Đ g ẵn N Hình 3.8 Phản ứng màu IAA với thuốc thử Salkowski chủng vi khuẩn Azo09 qua ngày 17 Azo09 Hàm lượng IAA (µg/ml) 35 30 25 20 15 10 0 Thời gian (ngày) Đ Hình 3.9 Hàm lượng IAA dịch ni cấy (µg/ml) theo thời gian ại Qua kết ghi nhận hình 3.8 cho thấy chủng vi khuẩn Azo09 sinh tổng hợp IAA có khuynh hướng tăng dần theo thời gian cao vào ngày thứ với hàm lượng đạt 31,82µg/ml Theo Azeem cộng (2001) nghiên cứu chủng họ c vi sinh vật từ vùng rễ lúa gạo chủng có khả sinh IAA cao đạt 12,1µg/ml (Azeem K.M., et all, 2001) Trong nghiên cứu khác Patten cộng Đ (2002) cho kết rằng, bổ sung tryptophan với nồng độ 500µg/ml vào mơi trường ni cấy vi khuẩn vi khuẩn sản sinh lượng IAA 32,7±2,9µg/ml (Patten C.L and Glick B.R., 2002) Tuy nhiên tiếp tục tăng thời gian nuôi cấy nhận thấy lượng IAA sinh giảm dần Điều giải thích sau: vi khuẩn tiết IAA điều kiện bất lợi (sau ngày ni cấy nguồn dinh dưỡng cạn kiệt) có ý nghĩa to lớn g ẵn N việc hình thành tổ hợp “thực vật – vi sinh vật”, cách giải vấn đề dinh dưỡng, đảm bảo cho phát triển vi khuẩn, kết chúng loài áp đảo so với chủng loại vi khuẩn khác quần thể vi sinh vật vùng rễ (Malhotra and Srivastava, 2009; Molina R cs., 2018) d) Thử nghiệm khả di động Chúng tơi tiến hành thí nghiệm khả di dộng chủng vi khuẩn Azo09 Sau 3-7 ngày nuôi cấy, quan sát tượng ống nghiệm chủng vi khuẩn mẫu đối chứng nhận thấy: 18 - Đối với mẫu chủng vi khuẩn phân lập + Vi khuẩn làm đục môi trường + Vi khuẩn phát triển lan khỏi đường cấy - Đối với mẫu đối chứng vi khuẩn Lactobacillus casei + Môi trường không bị đục + Vi khuẩn phát triển quanh đường cấy Những đặc điểm mô tả chứng minh chủng vi khuẩn phân lập có khả di động nhờ sử dụng tiên mao Kết quan sát hình dạng khả chuyển Hình 3.10 Khả di động động vi khuẩn phù hợp với kết nghiên cứu trước vi khuẩn Azospirilum sp Krieg, chủng vi khuẩn Azo09 Đ ại N R and J Dobereiner, 1984 (Krieg, N R and J Döbereiner, 1984), (Breenner, D.J cs., 2005) Từ kết nghiên cứu đây, nhóm nghiên cứu tổng hợp đặc họ c tính sinh hóa chủng vi khuẩn Azo09 (bảng 3.2) Bảng 3.2 Tổng hợp đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Azo09 Đ Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc Kích thước (mm) Azo 09 1,00 Màu sắc Hồng đậm Hình thái Trịn, bìa ngun, nhầy, độ lồi Chú thích: Hình dạng g ẵn N Tên Đặc điểm sinh hóa Gram Que (+): dương tính - Di động + Catalas e Oxidase IAA + + + (-): âm tính Từ kết thu từ bảng 3.2, cho thấy chủng vi khuẩn Azo09 có hình thái khuẩn lạc dạng trịn, bìa ngun, nhầy, độ lồi, có màu hồng đậm, tế bào có hình que, có khả di động, dương tính với phản ứng catalase, oxidase, có khả sinh IAA vi khuẩn Gram âm Với đặc điểm đây, dựa vào khóa phân loại Bergey nghiên cứu nhà khoa học khác vi khuẩn 19 Azospirilum sp (Breenner, D.J cs., 2005), nhận thấy chủng Azo09 phân lập từ mẫu rể lúa địa bàn tỉnh Quảng Nam thuộc chi Azospirilum Với mục đích để khẳng định chắn chủng vi khuẩn tuyển chọn thuộc chi Azospirilum đồng thời xác định tên lồi chúng nhóm nghiên cứu tiến hành định danh đến lồi chủng kỹ thuật sinh học phân tử 3.3 Định danh chủng vi khuẩn Azo09 kỹ thuật sinh học phân tử Sau phân lập tuyển chọn, chủng vi khuẩn Azo09 định danh sơ thuộc chi Azospirilum Nhằm định danh chúng đến tên lồi, chúng tơi chọn phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm tách chiết, tinh DNA tổng số, khếch đại vùng gen sản phẩm PCR gửi tại: “Công ty TNHH Phát Triển Cơng Nghệ Ứng Dụng Việt Nam” để đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA Kết đọc trình tự 16S – rRNA so sánh ngân hàng gen NCBI để định danh loài chủng Azo09 ại Đ DNA tổng số mẫu chủng vi khuẩn Azo09 sau tách thành công khuyếch đại kỹ thuật PCR Sản phẩm PCR điện di gel cho kết sau: Giếng (mẫu Azo09): xuất băng kích thước khoảng 1500 bp c họ Đ g ẵn N Hình 3.11 Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn (Azo09) (Giếng 2: Azo09, M: Marker phân tử) 20 Trình tự đoạn gen 16S-rRNA chủng Azo09 giải sau: CGTGGTTGGCTGCCTCCGTTGCCGGTTAGCGCACCACCTTCGGGTAA AGCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTA TTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAC CCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTGGGGATTGGCTCC ATCTTGCGACTTCGCATCCCACTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGC CCAACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGGC TTGTCACCGGCAGTTCCACCAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTGGCG GTAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGC TGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCCACCCAGCCGAACTGAAAGCCC GATCTCTCGAGCCGGTAGTGGACATGTCAAGGGTTGGTAAGGTTCTGCGCG TTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAAT ại Đ TCCTTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATG CGTTAGCGGCGACACCGAAGTGCATGCACCCCAGCGTCTAGCATTCATCGT TTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCG CGCCTCAGCGTCAGTGTCCGTCCAGATGGCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCT họ TCCCAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTGGGAATTCCACCATCCTCTCC c GGAACTCAAGCCCGACAGTATCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGG CTTTCACATCTGACTGATCGGGCCGCCTACGCGCCCTTTACGCCCAGTAAT TCCGAACAACGCTCGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTT AGCCGGGGCTTCTTCTCACGCTACCGTCATCATCGTCGCGTGCGAAAGAGC TTTACAACCCTAAGGCCTTCATCACTCACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTT Đ g ẵn N GCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC GTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCT Hình 3.12 Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn Azospirillum 21 Chủng vi khuẩn Azo09 có trình tự vùng gen 16S – rRNA tương đồng 100% với lồi A brasilense (hình 3.12) Cho phép kết luận chủng vi khuẩn Azo09 loài A brasilense Azo09 Như vậy, qua bước định danh cấp độ lồi, nhóm nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn Azo09 vi khuẩn loài A brasilense Do đó, bước tiếp theo, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đối tượng 3.4 Khảo sát đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense AZo09 Chúng tiến hành nuôi chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 môi trường Dobereiner với pH = 6,8 t°C = 32 ± 2°C thời gian 120h Để khảo sát thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại, tiến hành đếm khuẩn lạc dịch nuôi cấy thời điểm khác nhau, Từ xây dựng đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn (hình 3.13) ại Đ họ c Đ 0 12 24 36 48 g ẵn N CFU/ml (106) A brasilense 60 72 84 96 108 120 Thời gian (h) Hình 3.13 Đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 sau 120h nuôi cấy Dựa vào đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense Azo09, nhận thấy thời điểm nồng độ vi khuẩn ổn định đạt giá trị cực đại sau 72h (8.3·106CFU/ml) Tuy nhiên, tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào giảm dần, bắt đầu pha suy vong hàm lượng chất dinh dưỡng môi trường cạn kiệt, cạnh tranh chất dinh dưỡng vi khuẩn diễn ra, với sản phẩm trình trao đổi chất ức chế phát triển vi khuẩn nên số lượng tế bào sinh số lượng tế bào (Nguyễn Lân Dũng cs., 1998) 22 Như vậy, theo đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 môi trường Dobereiner thời điểm thu sinh khối cực đại 72h 3.5 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH đến trình sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Sự sinh trưởng vi sinh vật đặc biệt nhạy cảm với tác động nhiệt độ (Nguyễn Lân Dũng cs., 1998) Thí nghiệm tiến hành môi Dobereiner pH=6.8, nuôi dải nhiệt độ 20 - 50C Kết thể hình 3.14 A brasilense Đ ại họ CFU/ml (106) c Đ 25 30 35 40 g ẵn 20 N 45 50 Nhiệt độ ◦C Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 Kết nghiên cứu hình 3.14 cho thấy chủng vi khuẩn A brasilense sinh trưởng tốt vùng nhiệt độ từ 30 - 35C, cao 32 ± 2C Tiếp tục tăng nhiệt độ nhận thấy số lượng tế bào vi khuẩn giảm Điều chứng tỏ nhiệt độ cao (t0 > 450C) kìm hãm sinh trưởng phát triển tế bào vi sinh vật Bên cạnh đó, nhiệt độ thấp tác động lên khả chuyển hóa hợp chất, làm ức chế hoạt động hệ enzyme, làm thay đổi khả trao đổi chất chúng Do làm vi sinh vật khả phát triển sinh sản Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu nước (Baldani V.L.D cs.,1987; Bashan and Levanony, 1990; Becking J.H., 1982) Như khoảng nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng chủng A brasilense Azo09 30-35C 23 3.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh lý vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng cs., 1998) Thí nghiệm tiến hành mơi trường dịch thể Dobereiner có pH thay đổi khoảng từ – 9, nuôi 32 ± 2C Sự ảnh hưởng pH thể hình 3.15 A brasilense Đ CFU/ml (106) họ ại 5,5 6,5 7,5 8,5 c pH Đ Hình 3.15 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 Qua đồ thị hình 3.15 cho thấy chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 có khả sinh trưởng phổ pH rộng (từ 5,5 – 8,5), pH tối ưu cho sinh trưởng chủng dao động từ 6,5 – 7.0 (đều thuộc khoảng trung tính) Chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 thu sinh khối cực đại giá trị pH = 6,5 với mật độ tế bào đạt 8·106 Điều g ẵn N phù hợp với kết nghiên cứu trước khoảng pH tối ưu cho sinh trưởng vi khuẩn thuộc chi Azospirilum Theo nghiên cứu Becking J.H (1982), Akbari, G.A cộng (2007) vi khuẩn Azospirillum sp sinh trưởng môi trường với pH tối ưu 6,5-7 (Becking J.H., 1982; Akbari, G.A cs., 2007) Từ kết nghiên cứu đây, nhận thấy chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 sinh trưởng môi trường Dobereiner pH 6,5-7, nhiệt độ 30-35C 3.6 Đánh giá khả kích thích sinh trưởng chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 lên vi tảo C vulgaris đồng cố định hạt alginate Hạt aginate đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris nuôi môi trường BBM thời gian 15 ngày để theo dõi trình sinh trưởng vi tảo Khả kích thích sinh trưởng vi khuẩn A brasilense Azo09 lên vi tảo C vulgaris xác định thông qua tốc độ sinh trưởng vi tảo (Luz E 24 Gonzalez Yoav Bashan., 2000) Tiến hành đếm vi tảo C vulgaris hạt alginate (bao gồm lơ thí nghiệm: tảo cố định tảo đồng cố định vi khuẩn) buồng đếm hồng cầu Neubauer sau cho alginate tan dung dịch NaHCO3 4% Kết hình 3.16 Mật độ tế bào vi tảo (tế bào/ml) 20000000 VT VKVT 18000000 16000000 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 2000000 họ ại Đ 4000000 10 11 12 13 14 15 Thời gian (ngày) c Hình 3.16 Mật độ vi tảo C vulgaris hạt alginate 15 ngày cố định Đ Kết nghiên cứu hình 3.16 cho thấy, có mặt chủng vi khuẩn A brasilense Azo09 tác động tích cực đến tăng trưởng mật độ vi tảo C vulgaris đồng cố định alginate Ở lơ thí nghiệm đồng cố định vi khuẩn vi tảo hạt alginate, nhận thấy mật độ vi tảo C vulgaris tăng nhanh, cao hẳn so với lơ thí nghiệm tảo cố định Tại thời điểm ban đầu vừa cố định mật độ vi g ẵn N tảo hai lơ thí nghiệm xấp xỉ nhau, sau 01 ngày nuôi mật độ tảo lô cố định đạt 4,42.105 ±0,208.103 tế bào/ml cao gấp 1,2 lần so với mật độ tảo cố định Tiếp đến sau 07 ngày, mật độ tảo lô đồng cố định đạt 6,83.106 ± 1,53.103 tế bào/ml cao gấp 2,85 lần so với mật độ vi tảo lơ cố định Tiếp tục nuôi cấy hai lô môi trường BBM ngày tiếp theo, ghi nhận mật độ tế bào vi tảo lô đồng cố định cao lơ cịn lại Sau 15 ngày ni cấy môi trường BBM, vi tảo lô đồng cố định đạt 1,69.107± 3,157.104 tế bào/ml cao gấp 1,7 lần so với lơ cịn lại (mật độ vi tảo 9,88.106 ±0,493.103 tế bào/ml) Kết xác định tốc độ sinh trưởng trung bình sau 15 ngày ni vi tảo C vulgaris lơ thí nghiệm đồng cố định đạt µ = 0.07, cao gấp 2,2 lần so với tốc độ tăng trưởng vi tảo lơ cịn lại (µ-0.032), điều chứng tỏ vai trị hỗ trợ tích cực vi khuẩn A brasilense vi tảo Kết phù hợp với số kết nghiên 25 cứu nhà khoa học khác Luz E Gonzalez Yoav Bashan (2000), tiến hành đồng cố định vi tảo C vulgaris vi khuẩn A brasilense hạt alginate nuôi nước thải nhân tạo, nhận thấy mật độ tế bào vi tảo lô đồng cố định cao lô tảo cố định Ngồi kết nghiên cứu hai nhà khoa học cho thấy tổng số tế bào vi tảo, kích thước tế bào vi tảo hạt, số lượng tế bào vi tảo hạt alginate sắc tố vi tảo tăng lên đáng kể (Luz E Gonzalez and Yoav Bashan., 2000) Trong nghiên cứu khác Luz E de-Bashan cộng (2004) cho kết vi tảo C vulgaris đồng cố định vi khuẩn A brasilense hạt alginate nuôi nước thải nhân tạo nhận thấy sau ngày mật độ tế bào vi tảo đạt 4.106 tế bào/ml cao nhiều so với mật độ lô vi tảo cố định (De-Bashan LE cs., 2004) Sở dĩ có tăng nhanh mật độ vi tảo C vulgaris lô cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 phytohormon IAA ại Đ sản xuất A brasilense Azo09 đóng vai trị kích thích phát triển vi tảo làm tăng mật độ sinh khối vi tảo Bên cạnh đó, L-tryptophan vi tảo tiết vi khuẩn hấp thụ góp phần tiếp tục sản xuất IAA (Palacios cs., 2016; Peng H cs., 2020) họ c 3.7 Khảo sát hiệu loại bỏ hợp chất chứa nitơ, phốtpho nước thải chăn nuôi hạt alginate đồng cố định vi tảo C vugaris vi khuẩn A brasilense Azo09 3.7.1 Đặc tính nước thải chăn ni heo khu vực nghiên cứu Nước thải sau thu thập từ trang trại chăn ni heo Hịa Bắc, Hòa Vang lọc để loại bỏ cặn, chất thải rắn Sau đem pha lỗng với nước cất 10 lần đưa Đ g ẵn N xác định tiêu chất lượng nước Kết phân tích cho giá trị sau: TN 540,7 mg/l; TP – 185,7 mg/l, hàm lượng NH4+-N – 157,5 mg/l, hàm lượng PO43—P – 19,3 mg/l, BOD5 – 189,4 mg/l Kết phân tích cho thấy so với cột A của Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia nước thải chăn nuôi gia súc (QCVN 01-79:2011/BNNPTNT) nước thải chăn nuôi heo khu vực nghiên cứu ô nhiễm cao: Cụ thể NH4+-N cao gấp 15,7 lần, TN cao gấp 18 lần, TP cao gấp 30,9 lần So với cột B Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia nước thải chăn ni (QCVN 62-MT:2016/BTNMT) nước thải chăn ni heo khu vực nghiên cứu có TN gấp 3,6 lần Nước thải tiến hành thí nghiệm chứa lượng lớn chất dinh dưỡng dễ tiêu PO43-, NH4+ dạng dinh dưỡng mà tảo sử dụng cho trình sinh trưởng tăng sinh khối mình, phù hợp để xử lý phương pháp đồng cố định 26 3.7.2 Hiệu xử lý hợp chất chứa nitơ, phốtpho nước thải chăn nuôi hạt alginate đồng cố định vi tảo vi khuẩn a Hiệu xử lý NH4+-N Nitơ tồn nước thải chăn nuôi chủ yếu dạng NH4+ Hiệu loại bỏ NH4+-N nước thải sau thời gian 12 ngày xử lý thể hình 3.17 VT K 100 90 80 70 60 50 40 30 Đ 20 10 ại Hiệu suất xử lý NH4+-N (%) VTVK họ 10 12 14 Thời gian (ngày) c Hình 3.17 Hiệu loại bỏ NH4+-N sau 12 ngày xử lý Đ (VTVK – lô TN xử lý hạt alginate cố định VT VK; VT - lô TN xử lý hạt alginate cố định VT; K - lô TN không bổ sung hạ alginate) N g ẵn Kết hình 3.17 cho thấy, sau 12 ngày xử lý hàm lượng NH4+ -N mẫu nước thải giảm, nhiên mức giảm không giống Ở lơ thí nghiệm đối chứng nước thải khơng xử lý hiệu suất loại bỏ NH4+ -N đạt 11,1% Sự giảm hàm lượng NH4+ -N trình chuyển hóa nitơ vi sinh vật có sẵn nước thải Sục khí kèm theo khuấy trộn liên tục tạo điều kiện để NH4+ nước thải chuyển hoá hết sang dạng NO2-, NO3- theo phản ứng: NH4+ + O2 → NO2- NO2-+ O2 → NO3(Nguyễn Lân Dũng, 1998) Hiệu suất xử lý NH4+ -N cao lơ thí nghiệm xử lý hạt alginate đồng cố định vi khuẩn vi tảo Sau 12 ngày xử lý hàm lượng NH4+ N giảm 9,71 mg/l tương ứng với hiệu suất đạt 93,8% lơ thí nghiệm vi tảo cố định hiệu suất đạt 77,8% (34,1mg/l) Nước thải đầu có tiêu NH4+ -N đạt điều kiện xả thải loại B Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia nước thải chăn nuôi gia súc (QCVN 01-79:2011/BNNPTNT) Kết phù hợp với số kết nghiên cứu trước Trong nghiên cứu Luz Estela Gonzálezvà cộng (1997) cho thấy tảo C.vulgaris (thả tự do) có khả hấp thu 95% NH4+ nước thải (Luz Estela González cs., 1997) De-Bashan LE cộng (2002) khảo 27 sát khả xử lý nước thải đô thị vi tảo C vulgaris đồng cố định với vi khuẩn A brasilense alginate, kết cho thấy loại bỏ 100% NH4+ cịn cố định vi tảo xử lý 75% NH4+ (De-Bashan LE et al, 2002) Từ kết nhận thấy tảo C vulgaris có khả xử lý hiệu nhiễm amoni b Hiệu xử lý Nitơ tổng số Đây yếu tố quan trọng nước thải chăn nuôi heo, hàm lượng nitơ nước thải khó loại bỏ biện pháp xử lý thơng thường, tốt cho phát triển thực vật thủy sinh (Nguyễn Sáng, 2016) Tiến hành đo hàm lượng nitơ tổng số sau ngày thời gian 12 ngày xử lý, kết thu tiến hành xây dựng biểu đồ để thể hiệu xử lý nitơ tổng số lô thí nghiệm khác (Hình 3.18 hình 3.19) 100 VTVK 70 60 50 c 40 K họ 30 Đ 20 Hiệu suất xử lý TN (%) 80 VT ại Đ 90 10 g ẵn N 12 Thời gian (ngày) Hình 3.18 Hiệu suất xử lý nitơ tổng số (VTVK – lô TN xử lý hạt alginate cố định VT VK; VT - lô TN xử lý hạt alginate cố định VT; K - lơ TN khơng bổ sung hạ alginate) Kết nghiên cứu bảng 3.18 cho thấy, sau 12 ngày xử lý hiệu suất xử lý nitơ tổng số lơ thí nghiệm khác Ở lơ thí nghiệm đối chứng, sau 12 ngày xử lý, hàm lượng nitơ tổng số lại 452.56± 19.18 mg/l, tương ứng hiệu suất đạt 16,3% Trong đó, lơ thí nghiệm nước thải xử lý vi tảo cố định sau 12 xử lý, hiệu loại bỏ nitơ tổng số đạt 68,75% cao gấp 4,2 lần so với lô đối chứng Sự thay đổi hàm lượng nitơ tổng số thể rõ rệt lơ thí nghiệm nước thải xử lý hạt alginate đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris, hàm lượng sau 12 ngày xử lý lại 76,24±14,33 mg/l, tương ứng hiệu suất xử lý đạt 28 85,9% Kết này, mặt thể vai trò vi khuẩn A brasilense việc kích thích sinh trưởng vi tảo C vulgaris đồng cố định hạt alginate, mặt khác chứng minh chúng có vai trị góp phần việc xử lý nitơ hữu thành nitơ vô để thúc đẩy trình hấp thụ vi tảo dẫn đến hiệu suất xử lý nhanh lơ thí nghiệm cịn lại So với kết cơng bố trước Fallowfield cs (1985), sau - ngày nuôi tảo C vulgaris với bùn thải từ q trình chăn ni lợn pha lỗng làm giảm nitơ tổng đến 54-98% (Fallowfield H.J and Garrett M.K.,1985; Aziz cs., 1992) sau 15 ngày ni tảo C pyrenoidosa chất thải nước thải từ trại chăn nuôi lợn công nghiệp, hàm lượng nitơ tổng giảm 60-70% (Aziz cs., 1992) Còn Võ Thị Kiều Thanh cộng sau ngày nuôi tảo C vulgaris nước thải chăn ni pha lỗng nhận thấy hàm lượng nitơ tổng giảm 87,4-90,18% (Võ Thị Kiều Thanh, 2002) ại Đ Như mẫu nước thải chăn nuôi heo sau 12 ngày xử lý hạt alginate đồng cố định vi khuẩn vi tảo có tiêu nitơ tổng đạt đạt điều kiện xả thải theo cột B của Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia nước thải chăn nuôi (QCVN 62MT:2016/BTNMT) họ c Hiệu xử lý PO43 P c VT K Đ 90 70 g ẵn N Hiệu suất xử lý PO43- -P (%) VTVK 50 30 10 -10 -30 10 12 14 Thời gian (ngày) Hình 3.19 Hiệu loại bỏ PO43 P sau 12 ngày xử lý (VTVK – lô TN xử lý hạt alginate cố định VT VK; VT - lô TN xử lý hạt alginate cố định VT; K - lô TN không bổ sung hạ alginate) Kết nghiên cứu hình 3.19 cho thấy, thay đổi hàm lượng PO43 P lơ thí nghiệm khác Ở lơ thí nghiệm nước thải khơng xử lý PO43 P giảm dần, nhiên mức giảm không đáng kể, hàm lượng 17,01 mg/l, đạt hiệu suất 11,9% sau 12 29 ngày Sự giảm hàm lượng PO43 P lô TN chủng vi sinh vật có sẵn nước thải hấp thụ phốtpho cho trình sinh trưởng minh (Nguyễn Lân Dũng cs., 1998) Ở hai lơ thí nghiệm cịn lại nhận thấy sau ngày hàm lượng PO43 P có xu hướng tăng lên, nhiên ngày giảm nhiều, đặc biệt lơ thí nghiệm nước thải xử lý hạt alginate đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 với vi tảo C vulgaris Sau 12 ngày hàm lượng hiệu suất xử lý PO43 P đạt 77,7% Trong lô TN nước thải xử lý vi tảo cố định hiệu suất đạt khoảng 51,9% Kết thí nghiệm lần khẳng định vai trị vi khuẩn A brasilense Azo09, việc đồng cố định vi khuẩn vi tảo hạt alginate kích thích sinh trưởng vi tảo, dẫn đến hiệu xử lý PO43 P tăng lên Trong công bố trước Luz E Bashan nghiên cứu xử lý nước thải nhân tạo phịng thí nghiệm hạt alginate đồng cố định vi khuẩn A brasilense với vi tảo C vulgaris cho kết hiệu ại Đ suất xử lý PO43 P đạt 80% sau ngày Tuy nhiên nước thải thí nghiệm hai nhà khoa học nước thải nhân tạo, khơng có vi sinh vật mức độ nhiễm phốtpho thấp nên thời gian xử lý ngắn (B Y de-Bashan LE, 2002) d Hiệu xử lý phốtpho tổng số họ Sự thay đổi hàm lượng phốtpho tổng số lơ thí nghiệm khác sau 12 c ngày xử lý xây dựng biểu đồ thể hiệu xử lý phôtpho tổng số lơ thí nghiệm khác (hình 3.20) Đ VTVK K N 80 g ẵn Hiệu suất xử lý TP (%) VT 70 60 50 40 30 20 10 Thời gian (ngày) 12 Hình 3.20 Hiệu suất xử lý phốtpho tổng số (VTVK – lô TN xử lý hạt alginate cố định VT VK; VT - lô TN xử lý hạt alginate cố định VT; K - lơ TN khơng bổ sung hạ alginate) 30 Kết nghiên cứu hình 3.20 cho thấy, lơ thí nghiệm hiệu suất xử lý phốtpho tổng số sau 12 ngày tăng, nhiên mức tăng khác Ở lơ thí nghiệm đối chứng – sau 12 ngày hiệu suất xử lý đạt 6,86%, tương ứng với hàm lượng photpho tổng số cịn 170,842±4,52 mg/l Sự giảm hàm lượng phơtpho tổng số nước thải trình hoạt động vi sinh vật có sẵn nước thải (Nguyễn Lân Dũng cs., 1998) Hiệu suất xử lý cao lơ thí nghiệm nước thải xử lý hạt alginate đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 vi tảo C.vulgaris, đạt 66% (tương ứng hàm lượng – 61,57±5,21 mg/l), cao gấp 1,23 lần so với lô nước thải xử lý vi tảo cố định Sở dĩ có khác biệt đồng cố định với vi khuẩn, vi tảo sinh trưởng mạnh nên hiệu suất xử lý cao Mặt khác vi khuẩn A brasilense góp phần xử lý phốtpho hữu thành phốtpho vô cơ, làm tăng cường hấp thu phốtpho ại Đ vi tảo Kết chúng tơi thu có khác biệt lớn với kết công bố trước Hernadez cs (2006), sau 4-5 ngày nuôi tảo C vulgaris với bùn thải từ q trình chăn ni lợn pha lỗng, hàm lượng phốtpho tổng số giảm 42-98% (Hernandez J P cs., 2006) theo công bố N Malick and L C họ Rai (1994) sau 15 ngày nuôi tảo C pyrenoidosa nước thải từ trại chăn nuôi lợn c công nghiệp, hàm lượng phốtpho tổng giảm 50-60% (N Malick and L C Rai, 1994), Như vậy, thí nghiệm hiệu xử lý phốtpho tổng số hạt alginate đạt 66 % hàm lượng phốtpho tổng số mẫu nước thải 61,57±5,21 mg/l chưa đạt điều kiện xả thải loại B theo QCVN 0179:2011/BNNPTNT Sau xử lý hạt alginate đồng cố định vi khuẩn vi tảo, Đ g ẵn N nước thải chăn nuôi heo đạt số sau (bảng 3.3) Bảng 3.3 Đặc điểm nước thải chăn nuôi heo sau xử lý QCVN 0179:2011/B NNPTNT Giá trị Thông số Đơn vị QCVN 62MT:2016/BTNMT NH4+-N mg/l Nước thải đầu vào 157,5 Nước thải đầu Cột B Cột A Cột B 9,84±2,583 10 - - TN mg/l 540,7 76,24±14,33 30 50 150 TP mg/l 185,7 58,57±0,018 - - - PO43 P mg/l 19,3 4,3±0,585 - - BOD5 mg/l 214,4 67,345±3,78 50 40 100 31 Từ kết khảo sát thể bảng 3.3 nhận thấy, sau 12 ngày xử lý hạt alginate đồng cố định A brasilense Azo09 với vi tảo C vulgaris tiêu chất lượng BOD5, TN nước thải chăn nuôi heo đảm bảo yêu cầu nước thải đầu cột B theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia nước thải chăn nuôi (QCVN 62MT:2016/BTNMT), tiêu NH4+-N, TN, PO43 P BOD5 đạt điều kiện xả thải loại B QCVN 01-79:2011/BNNPTNT sở chăn nuôi gia súc, gia cầm – quy trình kiểm tra, đánh giá điều kiện vệ sinh thú y ại Đ c họ Đ g ẵn N 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên sở kết thu được, rút số kết luận sau đây: - Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Azo09 (Azospirillum brasilense) từ mẫu rễ lúa địa bàn tỉnh Quảng Nam Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng môi trường Dobereiner nhiệt độ 32°C ± 2°C, pH= 6.8 - Đã xây dựng đường cong sinh trưởng cho chủng A brasilense, xác định thời gian thu sinh khối sau 72h nuôi cấy - Đã tiến hành đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris hạt alginate nhận thấy sau 15 ngày nuôi cấy môi trường BBM nhận thấy tốc độ sinh trưởng trung bình vi tảo C vulgaris đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 hạt alginate tăng gấp 2,2 lần so với cố định ại Đ - Sau 12 ngày xử lý nước thải chăn nuôi hạt alginate đồng cố định C vulgaris A brasilense Azo09 cho kết quả: hàm lượng NH4+ -N giảm 93,8%; PO43 P giảm 77,7% TN giảm 85,9%; TP giảm 66% BOD5 giảm 68,5% Nước thải đầu có giá trị NH4+-N, PO43 P, BOD5, TN đạt điều kiện xả thải theo cột B QCVN họ 01-79:2011/BNNPTNT sở chăn nuôi gia súc, gia cầm – quy trình kiểm tra, đánh c giá điều kiện vệ sinh thú y Đ Kiến nghị Qua kết thu q trình nghiên cứu, tơi đưa số định hướng nghiên cứu tương lai sau: - Tối ưu hóa yếu tố để nâng cao hiệu suất xử lý ô nhiễm dinh dưỡng nước g ẵn N thải chăn nuôi heo hạt alginate đồng cố định vi khuẩn A brasilense Azo09 vi tảo C vulgaris - Tiếp tục nghiên cứu khả xử lý ô nhiễm loại nước thải khác 33