Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới mức độ thoái hóa của chủng nhộng trùng thảo (cordyceps militaris)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆPVIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ BẢO QUẢN TỚI MỨC ĐỘ THỐI HĨA CỦA CHỦNG NHỘNG TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) HÀ NỘI– 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆPVIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ BẢO QUẢN TỚI MỨC ĐỘ THỐI HĨA CỦA CHỦNG NHỘNG TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS)” Sinh viên thực : TỐNG QUỐC TRỌNG Lớp : K63CNSHD Mã sinh viên : 637369 Giảng viên hướng dẫn : PGS TS ĐỒNG HUY GIỚI TS ĐỖ TIẾN PHÁT Bộ môn : SINH HỌC Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết trình bày khố luận hồn toàn trung thực Kết thu thập dựa vào q trình nghiên cứu khoa học trực tiếp tơi hướng dẫn TS Đỗ Tiến Phát – Phịng cơng nghệ tế bào Thực vật – Viện Cơng nghệ sinh học – Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Tôi xin cam đoan thông tin tham khảo khoá luận ghi rõ nguồn gốc mục tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Tống Quốc Trọng i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, lãnh đạo khoa Công nghệ sinh học lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt trình học tập, rèn luyện, nghiên cứu Viện Công nghệ sinh học Để báo cáo khóa luận tốt nghiệp hồn thành, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Đồng Huy Giới TS Đỗ Tiến Phát theo sát hướng dẫn giúp em tơi tận tình suốt thời gian tơi thực khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới Ths Tạ Thị Đơng Ths Nguyễn Thị Hồng Hà toàn thể anh, chị cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn suốt trình nghiên cứu, thực hồn thành khố luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, anh chị, bạn bè dạy, góp ý, động viên suốt q trình thực tập khố luận Trong q trình thực tập khố luận, nhận thấy vốn hiểu biết kinh nghiệm nhiều hạn chế nên nghiên cứu chưa thể hoàn thiện cách tốt Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy để báo cáo hoàn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Tống Quốc Trọng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỀU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng Hạ Thảo 1.2 Tổng quan nấm Nhộng trùng thảo (Cordyceps Militaris) 1.2.1 Vị trí phân loại đặc điểm lồi nấm Cordyceps Militaris 1.2.3 Phương thức sinh sản nấm nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) 1.2.4 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học nấm Cordyceps militaris 10 1.3 Tác dụng dược lý nấm Cordyceps Militaris 14 1.4 Thoái hóa giống nấm Nhộng trùng thảo ( Cordyceps Militaris) 16 1.4.1 Ngun nhân thối hóa giống nấm Nhộng trùng thảo 16 1.4.2 Các kiểu hình thối hóa Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) 19 1.5 Tình hình nghiên cứu Nhộng trùng thảo giới Việt Nam 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Lưu trữ bảo quản chủng nấm 24 2.2.3 Phân lập phát triển dòng bào tử đơn 25 2.2.4 Kiểm tra thành phần biến đổi gen MAT 25 2.2.5 Đánh giá hình thái sinh trưởng phát triển chủng nấm Cordycep militaris môi trường nhân giống cấp 27 iii 2.2.6 Đánh giá hình thái sinh trưởng phát triển chủng nấm Cordyceps militaris môi trường nhân giống cấp 27 2.2.7 Đánh giá hình thái sinh trưởng phát triển chủng nấm Cordyceps militaris môi trường chất tạo thể 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 29 3.1 Xác định loài chủng nấm S1 phân lập 29 3.1.1 Kết tách chiết DNA chủng nấm S1 30 3.1.2 Định danh loài với chủng nấm S1 31 3.1.3 Đặc điểm thành phần tỷ lệ gen MAT chủng nấm Cordyceps militaris S1 32 3.2 Quá trình phát triển hệ sợi môi trường nhân giống cấp 32 3.3 Nhân sinh khối môi trường nuôi giống cấp 39 3.4 Đánh giá phát triển môi trường tạo thể 41 3.4.1 Sự hình thành thể hệ T1 42 3.4.2 Sự hình thành thể hệ T2 44 3.4.3 Sự hình thành thể hệ T3 47 3.4.4 Đặc điểm hình thái thể chủng nấm Cordyceps militaris S1 sau 60 ngày nuôi cấy qua hệ 49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 57 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 3.1 Nồng độ DNA độ tinh mẫu DNA chủng nấm S1 30 Bảng 3.2 Mức độ tương đồng gen ITS với trình tự chủng nấm S1 GenBank 31 Bảng 3.3: Tỷ lệ gen MAT chủng nấm Cordyceps militaris S1 32 Bảng 3.4 Kích thước (KT), tốc độ phát triển đặc điểm hình thái sinh trưởng phát triển hệ nuôi môi trường tối 33 Bảng 3.5 Kích thước (KT) chủng, tốc độ phát triển đặc điểm hình thái hệ ni ngồi sáng 36 Bảng 3.6 Đánh giá tốc độ phát triển tốc độ phát triển hệ nuôi môi trường 39 Bảng 3.7 Sự phát triển hệ sợi nấm, tạo mầm thể nấm đặc điểm hình thái chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T1 42 Bảng 3.8 Đặc điểm hình thái, chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T1 43 Bảng 3.9 Sự phát triển hệ sợi nấm, tạo mầm đặc điểm hình thái chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T2 45 Bảng 3.10 Đặc điểm hình thái, chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T2 46 Bảng 3.11 Sự phát triển hệ sợi nấm, tạo mầm đặc điểm hình thái chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T3 47 Bảng 3.12 Đặc điểm hình thái, chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T3 49 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Nấm Cordyceps militaris môi trường tự nhiên hoang dại Hình 1.2: Nấm Cordyceps militaris ni trồng mơi trường nhân tạo Hình 1.3 Phương thức sinh sản nấm nhộng trùng thảo C militaris Hình 1.4: Cơng thức hóa học cơng dụng hợp chất Cordycepin 11 Hình 1.5: Cơng thức hóa học cơng dụng hợp chất Adenosine 12 Hình 1.6 Hiện tượng thối hóa giống nhộng trùng thảo nuôi cấy nhân tạo 20 Hình 1.7 Màu sắc sợi nấm nhộng trùng thảo chủng giống khác 20 Hình 2.1: Chu kì nhiệt phản ứng PCR 26 Hình 3.1: Bào tử đơn phân lập sau 15 ngày nuôi cấy 29 Hình 3.2: Kết điện di kiểm tra tách DNA tổng số 30 Hình 3.3: Sản phẩm PCR khuếch đại ITS chủng Cordyceps militaris S1 31 Hình 3.4: Hình thái hệ nuôi môi trường nhân giống cấp sau nuôi tối ngày 35 Hình 3.5: Hình thái hệ ni mơi trường nhân giống cấp sáng 15 ngày 38 Hình 3.6: Hình thái bào tử nấm hệ nuôi môi trường nhân giống cấp 40 Hình 3.7: Mầm thể hệ T1 nuôi môi trường chất tạo thể 43 Hình 3.8 Mầm thể hệ T2 nuôi môi trường chất tạo thể 46 Hình 3.9 Mầm thể hình thành hệ T3 nuôi môi trường tạo thể 48 Hình 3.10 Hình ảnh sợi thể đặc trưng hệ sau 60 ngày nuôi cấy 50 Hình 3.11 Hình ảnh thể đặc trưng hệ sau ni bình chất sau 60 ngày 50 vi DANH MỤC VIẾT TẮT C.militaris Cordyceps militaris PDA Potato dextrose agar KT Kích thước SL Số lượng KL Khối lượng DNA Acid Deoxyribonucleic PCR Polymerase Chain Reaction SDAY Sabouraud Dextrose Agar plus Yeast extract Mix 2X Master mix 2X M Marker ITS Internal Trancribed Spacer CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide vii TĨM TẮT Đơng trùng Hạ Thảo (Chinese caterpillar fungus), cịn gọi trùng thảo, Hạ Thảo Đơng trùng hay Đơng trùng Thảo, loại đơng dược q có chất dạng ký sinh loài nấm Cordyceps sinensic (thuộc nhóm Ascomycetes) thể sâu Hepialus fabricius Phần dược tính đơng trủng hạ thảo chứng minh chất chiết xuất từ nấm Cordyceps sinensic Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris lồi nấm ký sinh trùng có giá trị dược liệu quý tương tự nấm Cordyceps sinensis sử dụng nhiều y học cổ truyền nhiều năm qua Khác với nấm Cordyceps sinensis với sản lượng mọc tự nhiên, lồi nấm Cordyceps militaris ni trồng điều kiện nhân tạo Tuy nhiên, thối hóa tần số cao Cordyceps militaris q trình ni cấy bảo quản hạn chế nghiêm trọng phát triển ngành Cordyceps militaris Yếu tố môi trường nhiệt độ bảo quản chủng ảnh hưởng tới độ ổn định di truyền giống nấm Trong khóa luận chúng tơi lấy chủng nấm Cordyceps militaris S1 bảo quản từ điều kiện nhiệt độ khác 80℃, -20℃, 4℃ điều kiện nhiệt độ phịng (22℃-25℃) để làm vật liệu thí nghiệm Từ xác định lồi, thành phần tỷ lệ gen MAT Chủng nấm Cordyceps militaris S1 Đánh giá hình thái chủng nấm Cordyceps militaris S1 sau bảo quản điều kiện nhiệt độ khác giai đoạn nhân giống cấp 1, nhân giống cấp 2, nuôi tạo thể hệ liên tiếp Qua giai đoạn nhân giống nuôi thể bước đầu xác định nhiệt độ tối ưu để bảo quản chủng nấm Cordyceps militaris S1 -20℃, phát triển mạnh qua hệ cấy thu thể to, mọc dày viii Thời gian mầầm nhiệt độ tương đương từ t 10-11 ngày có khác biệtt v hình thái, màu sắc, số lượng mầm m Sau 25-30 25 ngày, nhiệt độ -80℃ ℃ cho màu cam đậm, nhiệt độ lại l màu cam nhạt Ở nhiệt độ -80℃ -20℃ cho thể nhọn, n, thân to mọc m thưa Nhiệt độ 4℃ nhiệt độ phòng cho qu thể thân nhỏ, mọc dày Hình 3.7: Mầm thể hệ T1 nuôi môi trường ng chất ch tạo thể Bảng 3.8 Đặc điểm hình thái, thái chủng nấm C.millitaris bảoo quản qu nhiệt độ khác nuôi môi trường trư chất th hệ T1 Nhiệt độ SL mầm thể KL thể/ phần chất -80℃ 116,73 ± 2,84 57,15 ± 2,4 -20℃ 76 ± 2,27 55,15 ± 2,37 Quả thể to nhọn, mọc thưa, ưa, màu cam, ăn sâu phần ph chất, hướng ớng quang mạnh Đặc điểm ểm hình thái Quả thể to nhọn, mọc thưa, hưa, màu cam, ăn sâu phần chất, hướng ớng quang mạnh 4℃ 131,09 ± 2,57 61,26 ± 2,09 Quả thể trịn kích thước ớc trung bình, bình sợi mảnh, mọc dày, màu cam đậm, ậm, hướng h quang mạnh, có tượng xẻ thùy, ăn sâu phần ph chất 22℃-25℃ 130,45 ± 2,97 55,54 ± 2,69 Quảả thể tròn nhỏ, xẻ thùy, mọc dày, màu cam nhạt, hướng ớng quang mạnh, ăn sâu phần chất Ghi chú: số lượng ng (SL); (SL) khối lượng (KL) 43 Hình thái kích thước nấm ngồi phụ thuộc nhiều vào thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy chủng giống yếu tố quan định đến hình thái khối lượng kích thước thể nấm Trong trình phát triển thể, mầm thể hướng quang mạnh phát triển nhanh giai đoạn 20 ngày đầu Khối lượng thể giai đoạn thu hoạch phụ thuộc vào yếu tố lượng mầm, kích thước thể hình thái thể Số lượng mầm thu lớn nhiệt độ 4℃ khoảng 131 mầm, lớn thứ nhiệt độ 22℃ 25℃ khoảng 130 mầm Hai nhiệt độ có số lượng 80℃ khoảng 116 mầm -20℃ có số lượng mầm khoảng 76 mầm Khối lượng thu nặng 4℃ với số lượng mầm lớn, thể trịn nhỏ, mọc dày khối lượng trung bình chất khoảng 61g Nhiệt độ -20℃ có số lượng mầm lại có thân to, chắc, mọc thưa, nên khối lượng trung bình chất khoảng 55g Nhiệt độ 22℃ - 25℃ có số lượng mầm lớn sau nhiệt độ 4℃ khối lượng lại nhỏ với 55,5g trung bình chất thể mọc thưa nhỏ Còn lại nhiệt độ -80℃ khối lượng trung bình chất vào khoảng 57g Qua số lượng mầm khối lượng nhiệt độ cho thấy khối lượng phụ thuộc vào số lượng mầm mọc giá thể thể nhiệt độ -80℃ -20℃ thân to, nên khối lượng khơng có chênh lệch lớn so với nhiệt độ 4℃; nhiệt độ 22℃ - 25℃ có thể nhỏ nên khối lượng nhiệt độ -20℃ 3.4.2 Sự hình thành thể hệ T2 - Đánh giá đặc điểm thời gian mọc hệ T2 44 Bảng 3.9 Sự phát triển hệ sợi nấm, tạo mầm đặc điểm hình thái chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T2 Nhiệt độ bảo Thời gian mọc Thời gian tạo quản chủng kín chất mầm ( ngày) Đặc điểm hình thái (ngày) -80℃ 7,45 ± 0,52 12,45 ± 0,52 Hệ sợi mọc màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Mầm thể mọc rõ sau 11 ngày thể màu cam đậm, mầm thể to mọc thưa -20℃ 6,45 ± 0,52 11,45 ± 0,52 Hệ sợi mọc màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Mầm thể mọc rõ sau 11 ngày, màu cam, mầm thể to mọc dày 4℃ 7±0 12 ± Hệ sợi mọc đều, màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Mầm thể mọc rõ sau 12 ngày, màu cam, mầm thể mọc dày nhỏ, đầu thể xuất màu trắng 22℃ - 25℃ 7,64 ± 0,5 12,64 ± 0,5 Hệ sợi mọc đều, màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Mầm thể mọc rõ sau khoảng 12 ngày, màu cam nhạt, thể mọc thưa thân to Ở hệ T2 nuôi môi trường chất giai đoạn ươm sợi chủng nấm xuất hệ sợi nấm màu trắng, mịn phủ kín bề mặt có tạo vân Chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ -20℃ có tốc độ phủ nhanh khoảng ngày; tiếp đến 4℃ với ngày; nhiệt độ lại -80℃ nhiệt độ phòng ( 22℃ - 25℃) có tốc độ phủ kín khoảng - ngày Đưa ngồi chiếu sáng để kích thích nảy mầm sau thời gian 2-3 ngày hệ sợi từ màu trắng chuyển sang màu vàng cam Thời gian nảy mầm nhiệt độ tương đương từ 11-12 ngày có khác biệt hình thái, màu sắc, số lượng mầm Khoảng 25 - 30 ngày, hệ T2 nhiệt độ -20℃ cho thể to đẹp, màu cam đậm độ 45 mọc dày so vớ ới nhiệt độ hệ T1, nhiệt độ -80℃ cho thể thân to mọcc thưa, màu cam, cam nhiệt độ 4℃ mọcc dày mầm thể nhỏ Còn nhiệt độ 22℃-25℃ 22 mọc thưa Hình 3.8 Mầm thểể hệ T2 nuôi môi trường ng chất tạo thể Bảng 3.10 Đặc điểm m hình thái, chủng ch nấm C.millitaris bảoo quản qu nhiệt độ khác nuôi môi trường trư chất th hệ T2 Nhiệt độ bảo SL mầm qu KL thể/1 quản chủng thể phần chất -80℃ 115,64 ± 3,17 23,42 ± 2,68 Đặc điểm ểm hình thái Quảả thể mọc dày, mầm thể to ngắn, hướng ớng quang mạnh, có xuất thể dị dạng, màu vàng cam -20℃ 123,45 ± 2,77 56,02 ± 7,22 Quảả thể mọc dày, mầm thể to dài, hướng quang mạnh, ạnh, sợi thể đồng đều, màu cam đậm 4℃ 142,55 ± 2,34 58,38 ± 2,82 Quảả thể mọc dày, mầm thể nhỏ, màu cam nhạt, hướng ớng quang mạnh, màu vàng cam 22℃ - 25℃ 72,7 ± 2,21 11,33 ±2 ,5 Quả thể mọc thưa, nhiều ều thể dị dạng, màu vàng cam nhạt Theo sốố liệu thống kê từ Bảng 3.10 số lượng ợng mầm hệ T2 thu tương đương với số lượng ợng mầm thu hệ T1 khác số lượng mầm nhiệt độộ có thay đổi rõ rệt Số lượng mầm thu ợc nhiều 46 nhiệt độ 4℃ với số lượng khoảng 142 mầm Nhiệt độ -80℃ cho số lượng mầm ổn định qua hệ với khoảng 115 mầm Nhiệt độ bảo quản chủng nhiệt độ phòng( 22℃-25℃) giảm gần nửa so với hệ T1 Sang đến hệ T2 nhiệt độ có thay đổi rõ rệt số lượng mầm thu nhiệt độ -20℃, thu số lượng mầm lớn thứ 123 mầm, tăng gần gấp đôi so với hệ trước Khối lượng thể thu nặng 4℃ với 58g với thể mọc dày sợi thân nhỏ , -20℃ 56g với thể thân to mọc dày , nhiệt độ -80℃ 22℃ - 25℃ có khối lượng nhỏ 23g 11g với thể to mọc thưa thớt Tại hệ T2 kết cho thấy nhiệt độ -20℃ có hình thái phát triển so với nhiệt độ hệ so với hệ T1 Thu thể thân to, chắc, màu cam mật độ mầm thể mọc 3.4.3 Sự hình thành thể hệ T3 - Đánh giá đặc điểm thời gian mọc hệ T3 Bảng 3.11 Sự phát triển hệ sợi nấm, tạo mầm đặc điểm hình thái chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T3 -80℃ Thời gian mọc kín chất ( Ngày) 6,73 ± 0,47 -20℃ Nhiệt độ bảo quản chủng Thời gian tạo mầm (Ngày) Đặc điểm hình thái 11,73 ± 0,47 Hệ sợi mọc màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Mầm thể mọc rõ sau 11 ngày thể màu cam đậm, mầm thể to mọc thưa 6,45 ± 0,52 11,45 ± 0,52 4℃ 7,45 ± 0,52 12,45 ± 0,52 Hệ sợi mọc màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Mầm thể mọc rõ sau 11 ngày, màu cam, mầm thể to mọc dày Hệ sợi mọc đều, màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Mầm thể mọc rõ sau 12 ngày, màu cam, mầm thể mọc dày nhỏ, đầu thể xuất màu trắng 22℃-25℃ 8±0 0±0 Hệ sợi mọc đều, màu trắng, hệ sợi mịn phủ bề mặt chất, có tạo vân Khơng mọc mầm thể 47 Ở hệ T3 hệệ sợi nấm đượcc hình thành môi trường tr chất nhiệt độ có khác biệệt tốc độ thời gian mọc Sau đưa bình ni điều kiện chiếuu sáng để kích thích tạo mầm sau 2-3 ngày ni bình mẫu chuyển hệ sợii sang màu vàng cam Thời gian mầm củaa nhiệt nhi độ tương đương từ 10-11 11 ngày có s khác biệt hình thái, màu sắc, s số lượng mầm Nhiệt độ -20℃ cho qu thể to đẹp, màu cam đậm mầm thể mọc dày so vớii nhiệt nhi độ hệ T1 T2 Nhiệt độộ 80℃ cho thể thân to mọcc thưa, màu cam Nhiệt độ 4℃ mầm m qu thể nhỏ mọc dày so với hệ h T1 Còn nhiệt độ 22℃-25℃ khơng thể th mọc thể mầm dị dạng d Hình 3.9 Mầm thể th hình thành hệ T3 nuôi môi trường trư tạo thể 48 Bảng 3.12 Đặc điểm hình thái, chủng nấm C.millitaris bảo quản nhiệt độ khác nuôi môi trường chất hệ T3 Nhiệt độ bảo SL mầm KL thể/1 quản chủng thể phần chất 112,55 ± 2,3 35,08 ± 2,2 -80℃ Đặc điểm hình thái Quả thể to, mọc thưa, có đan xen thể dị dạng, màu cam đậm, thể hướng quang mạnh -20℃ 144,64 ± 2,77 56,42 ± 2,66 Quả thể to đều, đầu nhọn, màu cam đậm, hướng quang mạnh Quả thể dị dạng, đầu xẻ thùy sùi bơng 4℃ 152,55±1,86 17,42 ± 2,03 có tạo cục, màu sắc vàng nhạt, thể sinh trưởng chậm 22℃-25℃ 0 Không tạo thể thể dị dạng Thế hệ T3 ta thu số lượng mầm nhiệt độ ngang ngang Thu nhiều mầm nhiệt độ 4℃ với khoảng 152 mầm; tiếp nhiệt độ -20℃ với 144 mầm Nhiệt độ -80℃ khoảng 112 mầm Nhiệt độ 22℃25℃ không phát triển mầm Số lượng mầm nhiệt độ -20℃ phát triển mạnh sang hệ T3, số lượng mầm tăng lên đáng kể so với nhiệt độ lại so với hệ trước; khối lượng chất nặng 56,42g có số lượng mầm lớn, thân to, hơn, mọc dày Nhiệt độ 4℃ có số lượng mầm lớn nhất, thể mọc dày thân nhỏ mỏng nên khối lượng không nặng -20℃ hệ T1 Nhiệt độ -80℃ thể thân to, mọc thưa nên khối lượng thấp so với mẫu bảo quản -20℃ Còn nhiệt độ phòng (22℃-25℃) sang đến hệ T3 không tạo thể nên khối lượng khối lượng chất 3.4.4 Đặc điểm hình thái thể chủng nấm Cordyceps militaris S1 sau 60 ngày nuôi cấy qua hệ Qua hệ thu thể đồng nhiệt độ Ở nhiệt độ âm -80℃ -20℃ thu thể thân to, chắc, đầu thể nhọn Nhiệt độ bảo 49 quản giống điều kiện 4℃ nhiệt độ phòng (22℃-25℃)) thu đư thể thân nhỏ, mảnh, bắt đầu ầu xuất thể dị dạng sau hệ nuôi nuôi Mật độ mọc mầm ầm nhiệt độ bảo ảo quản khác khác Điều kiện bảo quản -80 80℃ -20℃ có tốc độ mọc nhanhh mật m độ mầm thưa thớt hệ đầu, mật m độ tăng dần ần hệ theo Nhiệt độ bảo quản 4℃ nhiệt ệt độ phịng có tốc độ mọc chậm ưng mật m độ mầm mọc dày Màu sắc thể điều kiện bảo quản chủng nấm qua hệ có màu cam ặc màu vàng cam Hình 3.10 Hình ảnh sợ ợi thể đặc trưng hệ sau 60 ngày ni cấy c Hình 3.11 Hình ảnh nh qu thể đặc trưng hệ sau ni bình chất sau 60 ngày 50 Qua kết thu qua hệ cấy nhiệt độ bảo quản ảnh hướng tới khả sinh trưởng phát triển chủng nấm C.militaris S1 Ta nhận nhiệt độ -80℃ phát triển mạnh ổn định, khơng có thay đổi qua hệ cấy, thu thể thân to, mật độ thưa thớt Nhiệt độ -20℃ không phát triển mạnh hệ hệ sau lại có phát triển rõ rệt điển hình mật độ mọc; mật độ mọc -20℃ qua hệ T2 T3 mọc dày lại thu thể thân to Nhiệt độ 4℃ lý tưởng nuôi cấy hệ thu thể đẹp, mọc dày sau hệ cấy có xuất thể dị dạng, đầu xùi màu sắc nhạt Cịn nhiệt độ phịng (22℃- 25℃) phát triển hệ T1 sang hệ T2 giảm suất mọc, sang hệ T3 suất hình thái có biến đổi xấu Như vậy, nhiệt độ bảo quản lưu giữ chủng nấm Cordyceps militaris có ảnh hưởng tới khả sinh trưởng phát triển nấm giai đoạn nuôi cấy khác Nhiệt độ bảo quản chi phối tới tốc độ phát triển sợi nấm, thời gian hình thành thể, hình thái, suất chất lượng thể 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã phân tích thành phần gen MAT xác định loài chủng nấm S1 Đây chủng nấm thuộc lồi Cordyceps militaris có chứa hai gen MAT 1-1-1 MAT 1-1-2 - Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản tới hình thái, sinh trưởng phát triển chủng nấm C.militaris S1 giai đoạn nuôi cấy qua hệ nhân giống liên tiếp Đồng thời, ghi nhận tác động nhiệt độ bảo quản tới khả hình thành thể, hình thái, suất chất lượng thể nấm nhộng trùng thảo Trong đó, nhiệt độ bảo quản phù hợp với chủng C.militaris S1 -20oC 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục phân tích đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản tới thành phần tỷ lệ gen MAT chủng nấm C.militaris S1 qua hệ đồng thời 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Danh, T D P., & Thuong, N T L (2016) Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu yếu tố ảnh hưởng đến trình ni trồng nấm Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, (44), 9-22 Gấm, Đ T., Quỳnh, D H., Anh, P T L., Dương, N H., & Hoa, Đ T K Đánh giá ảnh hưởng ánh sáng led nơng nghiệp đến q trính ni cấy in vitro nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (Link.) Fries Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 473-481, 2019 Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà, Nguyễn Thị Bích Thùy, Ngơ Xn Nghiễn (2015) Bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris L.ex Fr.) Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 13, số 3: 445-454 Nguyễn Thị Minh Hằng, Bùi Văn Thắng (2017) Nghiên cứu nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tổng hợp nhộng tằm Công nghệ sinh học Giống trồng Tập 4: 11-16 Nguyễn Thị Thanh Mai, Trần Bảo Trâm, Trương Thị Chiên, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Phương Trang, Mai Thị Đàm Linh, 2017 Đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu phương pháp nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 7/2017 Trần Văn Năm, Lê Thị Diệu Trang (2014) Báo cáo phân tích xu hướng cơng nghệ đơng trùng hạ thảo – công dụng, xu hướng sản xuất thương mại Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ TP HCM, Sở Khoa học công nghệ TP Hồ Chí Minh SumoVietnhat Bảo quản giống nấm chủng giống vi sinh vật cho hiệu quả? https://sumonhatviet.com/bao-quan-giong-nam-va-cac-chung-giong-vi-sinh-vat-saocho-hieu-qua Tài liệu tham khảo tiếng Anh Ait Benkhali, J., Coppin, E., Brun, S., Peraza-Reyes, L., Martin, T., Dixelius, C., et al (2013) A network of HMG-box transcription factors regulates sexual cycle in the fungus Podospora anserina PLoS genetics, 9, e1003642 Cole, G.T (1996) Basic biology of fungi Medical Microbiology 4th edition Gao, X.H (2008) Study on the mating type of Cordyceps militaris Acta Edulis Fungi, 15, 1– He, L., Han, C., Li, P., Chen, Y., Liu, D., and Geng, L (2009) Effect of mineral elements on colony types of Cordyceps militaris in subculturing Journal of Shenyang Agricultural University, 40, 672-677 Herskowitz, I (1992) Mating-type determination and mating-type interconversion in Saccharomyces cerevisiae The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces; Vol 2, Gene expression, 586-656 Jannie Siew Lee Chan , Gayane S Barseghyan, Mikheil D Asatiani, Solomon P Wasser (2015) Chemical Composition and Medicinal Value of Fruiting Bodies and Submerged Cultured Mycelia of Caterpillar Medicinal Fungus Cordyceps militaris CBS-132098 (Ascomycetes) Int J Med Mushrooms 17(7): 649-659 Jiaojiao, Z., Fen, W., Kuanbo, L., Qing, L., Ying, Y., and Caihong, D (2018) Heat and light stresses affect metabolite production in the fruit body of the medicinal mushroom Cordyceps militaris Applied microbiology and biotechnology, 102, 4523-4533 53 Jones Jr, S.K and Bennett, R.J (2011) Fungal mating pheromones: choreographing the dating game Fungal Genetics and Biology, 48, 668-676 Kamble V.R and Agre D.G., 2012 Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra Bionano Frontier 5(2):224-225 10 Kim, H., Metzenberg, R.L., and Nelson, M.A (2002) Multiple functions of mfa-1, a putative pheromone precursor gene of Neurospora crassa Eukaryotic Cell, 1, 987–999 11 Kobayasi Y (1982) Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329-364 Herbal, New York 12 Lee, H.-H., Kang, N., Park, I., Park, J., Kim, I., Kim, J., et al (2017) Characterization of newly bred Cordyceps militaris strains for higher production of cordycepin through HPLC and URP-PCR analysis Journal of microbiology and biotechnology, 27, 12231232 13 Li S.P, Yang F.Q, Tsim K.W (2006) Quality control of C rdy eps si e sis, a valued traditional Chinese medicine J Pharm Biomed Anal 41:1571-1584 14 Lin, Q., Qiu, X., Zheng, Z., Xie, C., Xu, Z., and Han, R (2010) Characteristics of the degenerate strains of Cordyceps militaris Mycosystema, 29, 670-677 15 Lin, X and Heitman, J (2007) Mechanisms of homothallism in fungi and transitions between heterothallism and homothallism Sex in fungi: molecular determination and evolutionary implications, 35-57 Lin, X., Hull, C.M., and Heitman, J (2005) Sexual reproduction between partners of the same mating type in Cryptococcus neoformans Nature, 434, 1017-1021 16 17 Lou, H., Lin, J., Guo, L., Wang, X., Tian, S., Liu, C., et al (2019) Advances in research on Cordyceps militaris degeneration Applied microbiology and biotechnology, 103, 7835–7841 18 Mains E.B (1958) North Mycologia 50:169-222 19 Nachshol Cohen , Jacob Cohen, Mikheil D Asatiani , Vinay K Varshney , Hui-Tzu Yu , Yi-Chi Yang , Yu-Hsuan Li , Jeng-Leun Mau , Solomon P Wasser (2014) Chemical composition and nutritional and medicinal value of fruit bodies and submerged cultured mycelia of culinary-medicinal higher Basidiomycetes mushrooms Int J Med Mushrooms 16(3): 273-291 20 Neiman, A.M (2011) Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae Genetics, 189, 737-765 Ni, M., Feretzaki, M., Sun, S., Wang, X., and Heitman, J (2011) Sex in fungi Annual review of genetics, 45, 405-430 21 American entomogenous species of Cordyceps 22 Paul M K., Paul F C., David W M and Stalpers J A (2008) Dictionary of the Fungi; CABI 23 Shonkor KD, Mina M, Akihiko S, Mikio S (2010) Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81: 961-968 24 Shrestha, B., Han, S.-K., Sung, J.-M., and Sung, G.-H (2012) Fruiting body formation of Cordyceps militaris from multi-ascospore isolates and their single ascospore progeny strains Mycobiology, 40, 100-106 25 Shrestha, B., Han, S.-K., Yoon, K.-S., and Sung, J.-M (2005) Morphological characteristics of conidiogenesis in Cordyceps militaris Mycobiology, 33, 69-76 54 26 Shrestha, B., Kim, H.-K., Sung, G.-H., Spatafora, J.W., and Sung, J.-M (2004) Bipolar heterothallism, a principal mating system of Cordyceps militaris in vitro Biotechnology and Bioprocess Engineering, 9, 440-446 27 Shrestha, B., Kim, H.-K., Sung, G.-H., Spatafora, J.W., and Sung, J.-M (2004) Bipolar heterothallism, a principal mating system of Cordyceps militaris in vitro Biotechnology and Bioprocess Engineering, 9, 440-446 28 Souza, C.A., Silva, C.C., and Ferreira, A.V (2003) Sex in fungi: lessons of gene regulation Genet Mol Res, 2, 136-147 Stanton, B.C., Giles, S.S., Staudt, M.W., Kruzel, E.K., and Hull, C.M (2010) Allelic exchange of pheromones and their receptors reprograms sexual identity in Cryptococcus neoformans PLoS genetics, 6, e1000860 29 30 Stensrud Ø., Hywel-Jones N.L., Schumacher T (2005) Towards a phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA sequence data confirm divergent lineages and paraphyly Mycological Research 109: 41-56 31 Wallen, R.M and Perlin, M.H (2018) An overview of the function and maintenance of sexual reproduction in dikaryotic fungi Frontiers in microbiology, 9, 503 32 Wang H.J., Chu Z., Feng L (2010) A comparative study on effect of two plant growth promoters on the growth of Cordyceps militaris Lishizhen Medicine And Material Medical Research 21:541-542 33 Wang L., Zhang W.M., Hu B (2008) Genetic variation of Cordyceps militaris and its allies based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequence data Fungal Divers 31:147-155 34 Wang, F., Song, X., Dong, X., Zhang, J., and Dong, C (2017) DASH-type cryptochromes regulate fruiting body development and secondary metabolism differently than CmWC-1 in the fungus Cordyceps militaris Applied microbiology and biotechnology, 101, 4645–4657 35 Wang, H., Wei, J., Lin, N., Feng, A., Chen, M., and Bao, D (2010) Distribution of mating-type genes in fruiting and non-fruiting forms of Cordyceps militaris Acta Edulis Fungi, 17, 1-4 36 Wang, L., Zhang, W.M., Hu, B al, Chen, Y.Q., and Qu, L.H (2008) Genetic variation of Cordyceps militaris and its allies based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequence data Fungal Divers, 31, 147-155 37 Wen, T., Li, M., Kang, J., and Lei, B.X (2009) A molecular genetic study on the fruiting-body formation of Cordyceps militaris 한국균학회소식: 학술대회논문집, 76–95 38 Xin, X., Yin, J., Zhang, B., Li, Z., Zhao, S., and Gui, Z (2019) Genome-wide analysis of DNA methylation in subcultured Cordyceps militaris Archives of microbiology, 201, 369–375 39 Xiong, C., Xia, Y., Zheng, P., and Wang, C (2013) Increasing oxidative stress tolerance and subculturing stability of Cordyceps militaris by overexpression of a glutathione peroxidase gene Applied microbiology and biotechnology, 97, 2009-2015 40 Yin, J., Xin, X., Weng, Y., and Gui, Z (2017) Transcriptome-wide analysis reveals the progress of Cordyceps militaris subculture degeneration PLoS One, 12, e0186279 55 41 Yin, J., Xin, X.-D., Weng, Y.-J., Li, S.-H., Jia, J.-Q., and Gui, Z.-Z (2018) Genotypic analysis of degenerative Cordyceps militaris cultured in the pupa of Bombyx mori Entomological Research, 48, 137-144 42 Yokoyama, E., Arakawa, M., Yamagishi, K., and Hara, A (2006) Phylogenetic and structural analyses of the mating-type loci in Clavicipitaceae FEMS microbiology letters, 264, 182-191 43 Zhang, X., Dong, X., Song, X., Wang, F., and Dong, C (2017) Photoperiodic responses and characterization of the Cmvvd gene encoding a blue light photoreceptor from the medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (Ascomycetes) International journal of medicinal mushrooms, 19 44 Zheng P., Xia Y.L., Xiao Ch.H (2011) Genome sequence of the insect pathogenic fungusCordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine Genome Biology 23; 12 45 Zheng, P., Xia, Y., Xiao, G., Xiong, C., Hu, X., Zhang, S., et al (2012) Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine Genome biology, 12, 1-22 56 PHỤ LỤC Môi trường Thành phần SDAY đặc 10g/l peptone +2g/l cao nấm mem +0.5g/l MgSO4 +1g/l KH2PO4 +40g/lGlucozo +15g/l Agar; pH: 5,6 SDAY lỏng 10g/l peptone +2g/l cao nấm mem +0.5g/l MgSO4 +1g/l KH2PO4 +40g/lGlucozo ; pH: 5,6 PDA Bột khoai tây 200g/l + 20g/l dextrose + 15g/l agar, pH: 5,6 Môi trường chất tạo 50% Gạo; 25% Nhộng; 15% Khoai tây; 10% bột thể đậu; Khoáng (Nước dừa + MgSO4 +KH2PO4 +Thiamin B1 + đường glucozo PDB Bột khoai tây 200g/l + 20g/l dextrose, pH: 5,6 Tên mồi Trình tự (5’-3’) ITS1 -TCCG TAGGTGAACCTGCGG- ITS4 - TCCTCCGCTTATTGATATG C- MAT1-1-1-F -ATGGAACACAGATCGAGCGACAC- MAT1-1-1-R -ATATACCTTCGCGATCA TTGCCCAG- MAT1-1-2-F -CGACATACGCTTGTCAAG- MAT1-1-2-R -GATGCCGTTCGAGGAGAG- MAT1-2-1-F -TGTTTTGTCGCGATGGTTCTGG- MAT1-2-1-R -CCTCTGGAGGTTCTGCATTCCA- 57