Nghiên cứu thiết bị, phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bằng ATP và ứng dụng trong giám sát vệ sinh thực phẩm báo cáo nghiệm thu

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HỖ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG

-VA UNG DUNG TRONG

GIAM SAT VE SINH THUC PHAM

Cơ quan chủ trị: Trường ĐH Khoa học tự thiên Đại học Quốc gia TP HCM Chủ nhiệm dé tai: PGS.TS TRẤN LINH THƯỚC

TP HCM 8/2003

ay

2.1.3 VẬT TƯ, LINH KIỆN CỦA MÁY ĐẾM ÁNH SÁNG 2.1.4 DỤNG CỤ VÀ THIẾT B

222 LY TRÍCH ATP TỪ TE BAO VA DINH LUGNG ATP BANG PHAN

2.2.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN TUYẾN TÍNH GIỮA MAT BỘ TE BAO VISINH VAT VA LUONG ANH SANG TUONG BOL PHAT RA

ORLA) ceeecccceeee ees eeeer ctenneeceennanserceseesconseeettanaararnaatannanninetseseacaggeaaat

2.2.4 ĐỊNH LƯỢNG T SNG VI SINH VAT HIEN DIEN TRONG MAU SUA 2.2.5 LAY MAU THIT VA MAU BE MAT LO MO HEO ke 2.2.6 TÁCH CHIẾT PLASMID BANG PHƯƠNG PHAP SDS

2.2.7 BIEN BIEN NAP DNA VÀO M KHUẨN E cali

2.2.8 PHAN TICH VECTOR TAI TO HOP BANG ENZYME CAT GIGI HAN 2.2.9 PHẢN ỨNG LOẠI BO NHOM PHOSPHATE es

2.2.10 PHAN UNG NOIDOAN DNA NGOAILAI VÀO 'PLASMID

2.2.11.LY TRÍCH LUCIFERASE TÁI TỔ HỢP RA KHỎI TẾ BÀO VI KHUẨN

2.2.13 NUOI SINH KHOI TE BAO VA CHUAN BI DICH LUCIFERASE TAI

2.14, TINH CHE LUCIFERASE TAITO HỢP BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC GIỮA ION Ni?” VÀ POL,YHISTIDINE n0 eeererexes 22

2.2.15 PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG ĐIỆN DI TRÊN GEL

POLYACRYLAMIDE CÓ SDS (SDS-PAGE) 00c server 23 2.2.16 DINH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 24 PHAN 3: KET QUA VA BIEN LUAN

3.1.1 MÔ TẢ CẤU TẠO VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ 3.1.2 KIỂM TRA TÍNH NĂNG CỦA THIẾT BỊ

3.1.2.1, Độ ổn định của tín hiệu đo được

3.1.2.2 Xác định khoảng tuyến tính để định lượng ATP

3.1.2.3 Xác định khoảng tuyến tính để định lượng tế bào vi sinh vật 39

3.2 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

NHANH VI SINH VẬT BẰNG PHÁN ỨNG PHÁT SÁNG THÔNG QUA

3.2.1 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG LUCIFERASE, Mg” VÀ LUCIFERIN THÍCH

HỢP TRONG PHAN UNG PHAT SÁNG

3.2.1.1 Khảo sát lượng luciferase cần cho phần ứng phat sáng 3.2.1.2 Ảnh hưởng của lượng Mg”*

3.2.1.3 Ảnh hưởng của lugng luciferin -

3.2.2 NGHIÊN CỨU DIEU KIỆN LY TRÍCH ATP RA KHOI TẾ BAO VI SINH_

3.2.2.3 So sánh hiệu quả ly trích ATP từ tế bào bởi các chất ly trích khác nhau

3.2.3 XÂY DỰNG BƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TE BAO VI SINH

3.3 ĐỊNH LƯỢNG TẾ BẢO VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRO?

THIT VA MOT SO BE MAT

3.3.1 ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG SỮA

3.4 THANH PHAN CUA BO HOA CHAT TU PHOI TRON DUNG TRONG

ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VI SINH VẬT 62 3.5 CÁC NGHIÊN CỨU ĐÓN ĐẦU: DÒNG HOÁ, BIỂU HIEN VA TINH

CHE LUCIFERASE TAI TO HGP DUNG CHO BỘ HOÁ CHẤT ĐỊNH

LUGNG NHANH VI SINH VẬT ĐỰA VÀO ATP

3.5.1 CẤU TRÚC PLASMID THỂ HIEN LUCIFERASE pQE-30luc+

3.5.2 CHON DONG VI KHUAN E coli XL1-Blue MANG PLASMID THE HIEN

LUCIFERASE pQE- 30luc+ (E coli XL1-Blue/pQE-30duc+) “

3.5.3 KIỂM CHỨNG SỰ BIEU HIEN CUA LUCIFERASE TAI TG HOP BẰNG HOẠT TÍNH VÀ BẰNG ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE BIẾN TÍNH (SDS - PAGE)

3.5.4, TINH CHE LUCIFERASE TAI TO HOP

PHAN 4: KET LUAN

MUC LUC

DAT VAN DE

1.1.MỞ ĐẦU

Bệnh gây ra bởi thực phẩm luôn luôn là mdi lo ngại của các nhà sản xuất, chế biến thực phẩm, của các cơ quan quần lý vé sinh thực phẩm và của người tiêu dùng, Ở các nước tiên tiến như Mỹ, hàng năm có khoảng 24 triệu ca bị bệnh do thực phẩm, chiếm tỷ lệ l/10 dẫn số, Ở các nước đang phải triển, có điều kiện vệ sinh kém như nước ta, tỷ lệ mắc bệnh áo thực phẩm chấc chắn còn cao hơn nhiều,

Trong các nguyên shan gay bệnh do thực phẩm, vị sinh vật là nguyên nhân quan trong gây ngộ độc và nhiềm bệnh thông qua thực phẩm

Người tiêu đùng pgầy nay da hiểt các nguyên nhân gây ra các căn dịch bệnh do thực phẩm nến đôi hỏi các nhà sẵn xuất, chế biến thực phẩm phải đảm bảo cũng cấp thực phẩm vệ sinh, an toân, nhất là về mặt vị sinh vật Do vậy, an toàn, vệ sinh đã trở thành tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của thực phdm trên thể giới

Hiện nay, để đấm bảo chất lượng quan trọng nây, các nhà sắn xuất, chế biến thực phẩm trên thế giới đã chuy On từ việc quần lý chất lượng dựa trên việc kiểm tra chất lượng nguyền liệu, bán thành phẩm và thành phẩm, sang một hệ thống quản lý chất lượng mới hữu hiệu hơa gọi là HACCP (Harzard Analysis and Critical Control Point, tam địch là Phần tích các môi nguy và Điểm kiểm soát giới hạn), Đây là mội hệ thống quản lý vệ sinh thực phẩm dựa trên việc phòng ngừa sự nhiễm vì sinh vật gây bệnh trên tất cả công đoạn của gui đình sản xuất và chế biến, từ nguyên liệu, chuẩn bị sản xuất, trong quá trình sẵn xuất cho đến thành phẩm, Hiến nay, trong lĩnh vực chế biển thực phẩm như sữa, thịt, bia , HACCP là tiêu chuẩn để đánh giá hệ thống đảm báo chất lượng của nhà sẵn xuất và chế biến thực phẩm để sản phẩm của ho được chấp nhận trên thị trường chấu Âu, châu Mỹ và trên thé giới Như vậy, ngoài bắn thân thực phẩm phải đạt chất lượng, hệ thống đầm bảo chất lượng của nhà sẵn xuất cũng trẻ thành mội tiêu chuẩn để sản phẩm được chấp nhận

Ở Việt Nam, hấu hết các đơn vị sẵn xuất và chế biển thực phẩm chưa xây

dựng được hệ thống HACCP, do vậy, việc đảm bảo an toàn, chất lượng vệ sinh sản phẩm chưa được chặt chẽ Trong thời gian tối, khi rhị trường mở rộng chúng cho toàn

khéi Bong Nam A (ASEAN), tinh canh tanh về chất lượng sản phẩm sẽ triệt để hơn,

Do vậy, các đơn vị sẵn xuất vã chế biến thực phẩm Việt Nam cần chủ động chuẩn bị để đủ sức cạnh tranh, Xây dựng hệ thống HACCP trong chế : hiển thực phẩm do vay

là mỗi nhủ cầu bức thiết, Đối với lĩnh vực chế biển thủy hải sẵn xuất khẩu, do yeu

cầu bức thiết của thực đến, thời gian qua, nhiễn đơn vị đã nỗ lực xây dựng hệ thống HACCP và gần đây các thị rường Châu Âu, Nhật Bản, Mỹ đã chấp nhận hàng thủy

sân của Việt Nam,

Trang 3

Để kiểm tra chất lượng vệ sinh vi sinh vật của thực phẩm, phương pháp thông dụng là đếm số khuẩn lạc Đây là một phương pháp vì sinh vật truyền thống, đã được kiểm chứng trong thời gian đài, ứn cậy và được dùng làm phương pháp chuẩn ở mức

quốc gia và quốc tế Tuy nhiễn phương pháp này có một số nhược điểm là cần có người có tay nghề về vị sinh vật tốn thời gian, cần từ một đến vài ngây mới cho kết

quả Vĩ vậy, phương pháp này thường dẫn đến tình huống việc đã rỗi: tức là có biết được nguyên liệu, bán thành phẩm không đạt chất lượng thì cho đến khi biết kết quả, các nguyên liệu, bán thành phẩm đồ đã đi vào thành phẩm vì quá trình sẵn xuất không thể đừng lại trong khi chờ kết quả phân tích, Nói cách khác, phương pháp này

không thích hợp với tính chất phòng ngừa sự nhiễm vi sình vật gây bệnh vào thành phẩm của hệ thống HACCP,

Để khắc phục nhược điểm chậm cho kết quả của phương phdp vi sinh vật

truyền thống, nhiều phương pháp để kiểm tra vị sinh vật cho kết quả nhanh hơn đã

được chiêu cứu và sử dụng, Một trong những phương pháp nhanh được sử dụng nhiều là phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bằng ATP

Phương pháp kiểm tra nhanh vì sinh vật bằng ÁTP được dựa trên sự phải sáng sinh học bởi phần ứng luciferin - lucferase ở con đem đóm Phương pháp này có ưu điểm là ngoài việc dễ thực hiện, còn cho kết quả chính xác, độ nhạy cao chỉ trong vài phút đến vài giờ Do vậy, có thể dùng phương pháp này để kiểm tra nhanh chúng

nguyên liệu tại hiện trường, trước khi nhập kho, kiểm tra tình trạng vệ sinh của thiết

bị, nhà xưởng trước khi vào sản xuất, theo đối phái hiện ngay sự nhiễm ví sinh vat

trong khi sản suất, nhớ vậy cố thể có biện pháp xử lý khắc phục ngay Một cách

tóm lược, phương pháp này là mội công cụ hữu hiệu để kiểm tra và giấm sát vệ sinh,

phòng ngừa sự nhiễm vị sinh vật vào sắn phẩm, nên là một công cụ rất hữu hiệu cho chương trình HACCP, |

Phương phap kiém tra nhanh vi sinh vat bing ATP d& duge su dung nhiều bởi

các nhà sản xuất và chế biến thực phẩm lớn trên thể giới từ những năm 1980 Phương pháp định lượng ví sinh vật bằng ATP đã được sử dụng để kiểm tra ví sinh

vat trong nhiều dang mau khác nhau như: chủng gốc, chủng trong quá trình lên men, bũn hoại tính, nước uống, nước trong quá trình sản xuất, chế biến; dịch từ cơ thể (sữa, nước tiểu, máu, ), thực phẩm (thị, rau, quả, thực phẩm chế biến đông lạnh ) sản phẩm đã thanh trùng hoặc khử trùng (sữa thanh trùng, để hộp ), mỹ phẩm

Ở nước ta, dap ứng cho yêu cầu nâng cao chất lượng về sinh và an toàn Thực

phẩm để có thể hội nhập với thị trường thế giới, vêu cầu về xây đựng chương trình

HACCP trong ode đơn vị sẵn xuất và chế biến thực phẩm, phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vất bằng ATP sẽ lâ một công cụ rất hữu hiệu,

Trang 3

Tại Việt Nam, đối với các nhà sản xuất, chế biến thực phẩm như sữa, bia, thịt, thực phẩm chế biến xuất khẩu, đồ hộp phương pháp này có thể được đùng để làm công cụ kiểm tra nhanh tổng vi sinh vật trong nguyên hệu, để giám sắt vệ sinh trong đây chuyển sẵn xuất, trong thành phẩm, để xây dựng chương tình ATP Đối với cơ quan quản lý nhà nước, phương pháp này có thể được dùng để kiểm tra nhanh tại

hiện trường tình trạng vệ sinh của cơ sở sản xuất, kiểm tra chỉ tiêu vì sink của nqƯớc

nguyễn liệu, nước thải

Tuy nhiên, việc ấp dụng phương pháp này tại Việt Nam gặp khó khăn là thiết

bị, hóa chất đắc tiền và chỉ phí kiểm tra cao (6.000 USD/máy xách tay và 23.000 USDémay phòng thí nghiệm, 240 USD/bộ Kit cho 10Ô lần kiểm tra),

Trong bối cảnh hiện nay, để đầm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu đùng Việt Nam cũng như để đưa được sản phẩm thực phẩm chế biến nội địa ra thị trường thể giới các nhà sẵn xuất Việt Nam cần nhanh chồng thiết lập hệ thông bảo đấm an toàn vệ sinh thực phẩm của mình, xây đựng chương trình HACCP trong hệ thống chung về quần lý chất lượng sẵn phẩm tại đơn vị, Do vậy việc ấp dụng phương pháp kiểm tra nhanh ví sinh vật thay cho phương nhấp truyền thống là một

nhù cầu bức thiết của thực tiến, 1.2 NH)C TIỂU

Đề rãi "Nghiên cứu thiết bị, phương phap Kiểm tra nhanh vị sinh vật bằng ATP và Ứng dụng trong giám sát vệ sinh thực phẩm” nhằm nghiên cứu chế tạo thiết bị đến ánh sáng và nghiên cứu hóa chất của phản ứng phát sắng dùng trong định lượng vi sinh vat bang ATP tạo cỡ SỞ để có thể ứng dụng phương phấp này vào phục vụ

thực tiễn sẵn xuất tại Việt Nam,

1.3 NỘI DŨNG

Để tài đã được Hội đẳng xét duyết thông qua với các nội dung chính như sau:

! Thiết kế và chế tạo một thiết bị đếm ánh sáng để kiểm tra nhanh vị sinh vật

bằng phần ứng phat sang can ATP

2 Kháo sát các điều kiện về hoá chất để xác định ATTP vì sinh vật

toa Thử nghiệm định lượng vi sinh vat tong số hiện điện trên bề mặt thiết bị,

nhà xưởng và thực phẩm chế biến

Trang 3

14 TÓM TẮT CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI

luciferase + luciferin + ATP ~e—~e_ luciferase ~ juciferyl-AMP + PP,

Iueiferuse ~ luctferyl-AMP +O ——me luciferase + oxyluciferin + AMP + CO, + fy (360nm)

Một phần tử luciferin khi bị ôxy hóa theo phương trình nếu trên sẽ phóng thích một quang tử ánh sáng ATP là một cơ chất tham gia vào phản ứng phái sắng và số lượng quang tử ánh sáng phát ía tỷ lệ thuận với số tượng phần tử ATP tham gia vào

phần ứng Trong điều kiện cố sự hiện điện thừa của luciferin, luciferase, lượng ảnh

sáng sinh ra bởi phần ứng nây sẽ phụ thuộc vào lượng ATP biện điện trong phản

ứng, Bằng mội thiết bị có khá nâng đếm được lượng ánh sống phát ra, người ta cd

thể định lượng được lượng ATP dựa vào một đường chuẩn thể hiện mỗi tượng quan giữa lượng ánh sáng đo được và lượng ATP

Mặt khác, tất cả tế bào sinh vật đếu chứa ATP có lượng tương đối ổn định

(lượng ATP trung bình ở vị sinh vật là 0,3fgtế bao hay I0” 'g/tể bảo) Do vậy, về nguyên LẮc, có thể định lượng vi sinh vật bằng trị số ATP được ly trích ra khỏi tế bào bằng cách dựa trên mội đường chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa lượng ánh sáng phát ra đo được (do phân ứng với luciferase, iuciferdn) thể hiện bằng RLU (Relative Light Units) va lượng tế bào vi sinh vật (được xác định bằng phương pháp

đểm số khuẩn lạc thông thường) (Hình L1)

Qui trình định lượng vì sinh vật bằng phản ứng phát sdng luciferin-luciferase

cdn ATP có thể được tôm tắt như sau: hút huyền phù tế bào vì sinh vật vào ống đo, tiến hành ly trích ATP ra khói tế bào Đật ö ống đo vào buồng đo của thiết bị đếm ánh sáng, sau đó bổ sung hồn hợp lucferin-lucifcrase Tiến hành đo và đọc lượng ánh

sáng phát ra được hién thi bing RLU Qui đốt lượng RL.U thành raặt độ tế bào (Hình

1.3)

Trang 4

ogi

2 43 4 § 6 F? 8 log (CFU/mi) Hinh 1.1: Duong tong quan tuyén tinh giita long anh sang

phát ra và một độ tế bào tí sinh vật

Jý À ‘ak

Bố sung hỗn

hip iuciferase- luciferin

Ông do chứa huyển phù tế bào vixinb

vận

BS sung chat by trick ATP

lz

VAT LIEU & PHƯƠNG PHÁP

2.1 VAT LIEU

2.1.1 GIONG VI SINH VAT

Các thí nghiệm ly trích ATP từ tế bão vị sinh vật và xác định tương quan giữa

lượng ánh sáng phái ra và số lượng tế bảo vi sinh vật được thực hiện trên chúng

Salmonella typhimurium nhan từ Trung tâm giống vì sinh vật Nhật Bản (iapan

Collection of Microorganism, JCM)

Ching £ cali DH5a (F endAl hsdR17 (ny /my.) supdd thi AX recAl gyrA96

AiaeU169(480izzZAM 15) được cung cấp bởi hãng Takara, Nhật Bản

Ching E coli XLI-Blue (recAl cHẲÁI gyrA96 thị-| hsdÑ Ì? supŠ44 relÁ1 lạc {E' praAB lạcF4ZM 15 Tn10(TeÖD được cùng cấp bồi hãng Qiagen, Đức |

2.1.2, PLASMID

Plasmid pBisc+ mang gen m& hod luciferase được cấu trúc tại Phòng thí

nghiệm Công nghệ Sinh học phần tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia

Tp Hé Chi Minh Plasmid aay lam nguyên liệu cũng cấp luc+ trong quá trình đồng hoá Íuc+ vào vector thể hiện pQE-3Ó,

Hình 2.1: Cấu trúc piáxmid pQE-30

Plasuud pQE-30 (Nùnh 2.1) được cùng cấp từ hang Qiagen ding làm vector để

biểu hiện vượt mức gen ngoại lai, Plasmid này được thiết kế có kích thước 3400bp, là

một vector biểu hiện vì có chứa yếu tổ T5 promoter được nhận diện bởi RNA Trang 6

polymerase của E.coli vA hai fac operator lam tầng khá năng kiểm soát sự hoạt động của Tã promoter tránh tình trạng “rô ri" trong vIỆC biểu hiện protein khi chưa được

cảm ứng Tĩnh tự gắn của ribosome, RBSH, cho phép t lệ dịch mã cao Với hai vị tr

kết thúc sự phiên mã có hiệu quả là „ và TI giúp cho pQE-30 ding sự phiên rã khi cần thiết và đảm bảo sự ổn định trong việc biểu hiện protein tái tế hợp Ngoài ra, pQE-30 còn mang một vùng multiple cloning site (MCS), cac codon kết thúc trong tất cả các khung đọc và một trình tự mã hoá cho 6 hisudine ở đẫu 5' tạo điểu kiện cho việc thiết kể cấu trác thể hiện và tính chế protein tái tổ hợp

2.1.3 VAT TU, LINH KIEN CUA MAY BEM ANH SANG

Ong nhân quang ( (Photomultipl ying tube} ding để chế tạo máy đếm ánh sáng được thiết kế, đặt hàng và cùng cấp bởi Công ty Hamamatsn, Nhật Bản; các lnh - kiến điện tử, bán dẫn khác được nhập từ nước ngoài boặc nuuä tại TP HCM; buồng đo và các phần cơ khí khác được gia công tại TP, HCM Mấy đếm ánh sáng được nghiên cứu, thiết kế và chế tạo với sự phối hợp của Phòng Điện tử ứng dựng, Trung tâm Kỹ thuật hạt nhân TP.HCM

3.1.4 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ

~_ Pipetman các loại

~ Đền cần, que trải, que cấy, thùng đá, ống nghiệm các loai, peti, eppendorf vac

loại, tâm xia rang, Ong Falcol $Oml, ống tiêm 50ml, bình ta đựng côn (nước cÃU

—_ Máy quang phể chuyén dung GeneQuant pro- (Amersham Biesciences} ding cho DNA, RNA va protein

~_ Tủ cấy võ trùng Claáss H (Mỹ)

~ Mang loc vi khuan, gidy do pH (Whatman)

~ May ly tam lash Mikro 22R (Hettich, Đức)

~_ Máy lọc nước siêu sạch EASY pure UV (Amersham Biosciences)

—_ Máy ly tâm lạnh tốc độ cao (Heraeus, Đức)

—_ Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator Š 150 (Stuard Scientific, Anh}

- Mấy đo ánh sfng luminometer, Ong do (Phan Lan)

~ May quang phd ké Ultrospec 2000 (Amersham Biosciences}

~ May do pH (QRION, Ánh)

Máy khuẩy từ gia nhiệt Binby (Anh)

~_ Tủ ẩm vị sinh vật Memmert (Đúc)

—_ Tô sẩy Menunert (Đức)

~ Néi bap Tomy (Nhat

~ Tủ lạnh sâu ~ 80°C (Sanyo Nha

Trang 7

~ Td lanh -40°C (Medical Class Nhat ~ Tủ mát4~ 1C (NhậU0 ~ ~ Can k¥ thadt Ohaus (My)

— CaAn phan tich Precica (Thuy S¥)

~ Bé dién di axit nucleic {HORIZON'S8, Life TeochnologYxui, Mỹ) và hệp đền soi UV (Hoefer, Mỹ)

—_ Bộ điện di protein Hoefer”, bộ ngudn (Amersham Biosciences)

-~ Thiết bị dién bién nap, cuvette (BIO RAD, Md)

~ May luần nhiệt PTC-IO0TKI (MỸ)

May phá tế bão bằng siêu âm (Ultrasonic Cell Disraptor, M¥)

— Thiết bị tình chế protein FPCL va phan mềm Unicom version 3.10 (AKTA,

Amersham Biocences}

~ Thi€t bi chap aah ImageMaster® (Amersham Biosciences} —_ Cột Ni~ NTA tỉnh chế His_tag protein

- Phân mềm thiết kế mối Amplify 1.2

~ Phan mém phan tich DNA Jellyfish 2.1.5 HOA CHAT

Các bóa chất chính dùng cho phần ứng phát sáng được nhập khẩu từ các công

(y như $4U?

~_ Môi trường PCA (Diico, Mỹ) -

~_ Tryptone, cao nấm men (HiMedia, Ấn Độ)

~ Bacto-agar (Difca, USA}

~ Potassium acetate, sodium acetate, ax acetic bang, glycine, sodium dodecy!

sulfate (SDS}, NaQu, glucose, Tris base, HCI, chloroform, phenol, ethanol tuyét

đối, dung dich acrylamide 30% (wiv) vA bis-acrylamide 0.8% (wivj, TEMED, MgS0,, succinic acid, Coomassie Brilliant Blue G-250, NaCl, glycerol, imidazole,

benzamidine ~ HC], phosphoric acid 85%, bromophenol blue, EDTA, Chloroform, ammonium persulfate (APS), 8-hydroxyquinoline, xylene cyanol FF, orange G,

KsHPO,, KHLPO, (Prolabo, Merck va Amersham Biosciences)

~ Phenylmethylsalfonyl fluoride (PMSP), streptomycine sulfate (Sigma, M¥)

~ Enzyme cét han ch€ Smal, lyzozyme, GFX TM&DNA bands kH, Tag

polymerase, RNase (Amersham Biosciences}

— Bé tinh ché DNA t¥ gel agarose NuleoSpin® (Macherey - Nagel GmbH & Co, Đức)

~_ Các loại enzyme cất hạn chế (Fermentas, Đức)

~ Thang phần tử lượng DNA 1 kbp (Biolabs, New England)

Trang 8

~ Thang phan nf lvong nho (Low Molecular Weight) (Amersham Biosciences) Adenosine 5'-triphosphate (disodium salt) (ATP), luciferase, chat ly trich ATP (FL-SAR), Dithiothrettol (DTT) Gigma, My)

~ Luciferin (Biotlum, MY)

~ Nikel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) (Qiagen, Difc}

- X-gal, IPTG, Pfu polymerase, alkaline phosphatase ti ruột bê non, các loại dNTP (Promega)

~ Agarose (Seakem® LE Agarose, M¥)}

~ Agarose Type b Low EEO, EEC Gigma, MY)

“— Bavine Serum Albumin (BSA) (Boehringer Mannheim, Ditc)

~ Chat ly tich B/S Extractant (Biothema, MP}

~ Chat fy tích n-Dodecy! Trimethyl Ammonium Bromide (DTMAB),

Benzalkonium chloride 10%, PEG 4006, Ampicillin, PEG 6000 (Wako, Nhat Ban)

~ Bdékit dink hrong ATP, ATP Monitoring Reagent (Labsystem, Phan Lan) 2.2 PRUONG PHAP

2.2.1 THUC HIEN PHAN UNG PHÁT SÁNG VÀ ĐÓ LƯỢNG ANH SANG PHATRA

Hỗn hợp phân ứng phát sáng gốm 200ul chứa các thành phần không thay đổi

gốm O,1M Tris ~ Succinate (hodc Tris - Acetate), pH 7,75, 00154mg ĐỊT, 200 ne

BSA; lmM EDTA, Cac thanh phan ATP, MgSO,, luciferin vi luciferase od lygng thay đổi tùy mạc đích thí nghiệm Các thành phần nây được bổ sung vào ống đo theo

thi ty nh sau: dung dich dém, DTT, BSA, EDTA, MgSQ,, luciferin, ATP va cudi

cling JA luciferase Trén nhanh hn hop bang may rung vortex trong vai gidy va dat

ngay vào huỗng đo Tiến hành đo và ghi nhận giá trị Anh sang phat ra (RLU)

222 LY TRICH ATP TU TE BAO VA BINH LUGNG ATP BANG PHAN UNG PHAT SANG

Chuan bi huyén phi tf bao S pphimurium (sau khi di nia sach vdi nước cất

v8 tring) sao cho ODgwam dat khoang 0,3 Tién hanh ly trich ATP trong mét hén hop

$00n) trong mat ng eppendorf gém các thành phần sau: 30001 huyền phù tế bào,

một đụng tích thích hợp các chất ly trích (sao cho có lượng hoặc ning dd mong

muốn), bổ sung nước cho đủ 300nl, Trộn hỗn hợp bang may rung vortex trong 15

giấy Dùng 5Qul địch ly trích để thực hiện phần ứng phát sáng Thành phan 200pì hỗn hợp phần ứng phát sáng như sau: i1ÔUi dung dich dém Tris - acetate 0,1M, pH 7,75; S0ul địch trích ATP và dÔul dong dịch hỗn hợp phần ứng phái sáng lucferase -

Trang 9

luciferin Tiến hành đo như mê tả ở trên, Thực hiện một đối chứng, thay 5Ô0Hl dịch huyền phũ tế bào bằng SÔHÌ nước cất vô trùng

2.2.3, XAY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN TUYẾN TÍNH GIỮA MẬT ĐỘ ˆ TE BAO VISINH VAT VA LUGNG ANH SÁNG TƯƠNG ĐỐI PHÁT RA (RLY)

Chuẩn bị huyền phù tế bào §, œphimurium (sau khi đã rửa sạch với nước cất vô trùng) có mật độ tương ứng khoảng 6x10*, 6x10”, 610”, 6x10”, 6x10", 4,7x10" va

6x10'Ẻ CPU/ml (được xác định theo phương pháp để đĩa như mô tả ở mục 2/2 2.4.2) Dong 135pl huyén phi t€ bho 6 mdi nGng dé cho vae cdc ống đo, Bổ sung thêm lấui

dụng dịch benzalkonhun chioride 0,2% (W/V) Trộn bằng cách vortex trong lŠ giấy,

để vên 45 giấy Bổ sung thêm 50g] dung dich dém Tris — succinic 0,1M, pH 7,75

Tron déu Dat Sng do nay vae budng do Nap nbanh SOp] dung dich hén hop phan

ứng phái sáng luciferase - lucifenn vào ống đo Đậy buông đo, tiến hành đo và ghi nhận giá tị do được,

2.2.4 BINH LUONG TONG VI SINH VAT HIEN DIEN TRONG MAU SUA

2.2.4.1 Qui trink thu mua vA bac quản sữa cho nhà máy

Sữa từ các đại lý hoặc từ các hộ nõng dân được thu gom vé cdc tram trung

chuyển Trong quá trình vận chuyển, sữa được chứa trong các bình (thường là các xô nhựa hay can 30 lữ) đã được xử lý bằng nước xã phòng rửa chến và nước mấy Tại

các trạm trung chuyển, sữa trong các can nhựa 30 lít được xử lý thô trước khi đưa vào

bẩn chứa lạnh 20°C bằng cách cho qua một vải lọc để loại bỏ các cặn, Tại đầy, mẫu sữa được kiểm tra vi sinh một cách định tính bằng cách dựa vào sự đổi mầu của

raethylen Tu$ vào sự hiện điện nhiều hay ít của vì sinh vật trong mẫu sữa mã sự đổi mâu của methylen (Ừ màn xanh chuyển sang mầu trắng) sẽ diễn ra nhanh hay chậm Sữa được xem là đạt kết quá vì sinh nếu thời gian chuyển hoàn toẫn sang màu trắng

nhiều hơn 4 giờ Cùng với các chỉ nếu về độ béo, kháng sinh kết quả định tính vì

sinh nãy, nhà mấy sẽ quyết định giá thành của sữa cho từng hệ nông dân Sữa được

chữa trong các bến 20°C sau 12 ~ 24 giữ sẽ được chuyển vỀ công ty bằng các xe bồn

Trong quá trình thu mua và bảo quan sifa, sự nhiễm vị sinh vật chỗ yếu từ không khí và các dụng cụ chứa đựng trong quá trình vận chuyển, Sữa là mỗi trường rất tốt cho vị sinh vật phát triển, vì vậy nếu bảo quân không tốt cũng nhự bảo quản trong thời gian quá đài (từ lúc vất tới lúc về công 1y) sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sữa Để có sự đánh giá chung về chỉ tiêu vị sinh của sữa thê, tại cổng ty, sữa sẼ duge kiểm tra định lượng vị sinh trước khi đưa vào sẵn xuất Tổng vị sinh vật là một trong những Trang 10

chỉ tiêu cần thiết về vi sinh đối với sữa và các sẵn phẩm (ừ sữa Qui trinh thu mua va

bảo quần sữa cho nhà máy được mình hoa qua các Hình 2.3 ~ 2, 3

2.2.4.3, Định lượng tổng ví sinh vật hiếu khí trong mẫu sữa

Thực hiện phân ứng phát săng như mục 2.2.3 trong đó dịch huyền phù tế bào 8 typhimurium dude thay thế bằng 135ul dịch sữa Thực hiện hai phản ứng phát sáng

cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình Đồng thời, xác định mật độ tế bảo vi sinh vật

hiện điển trong mẫu sữa theo phương pháp đếm khuẩn lạc để so sánh hai phương

pháp Pha loãng mẫu sữa bậc 10 Hút vô trùng li ở mỗi ba nỗng độ pha loãng kế

tiếp nhau cho vào giữa hộp pebi vô trùng Thêm khoảng 20ml môi trưởng nutrient agar đã hấp khử trùng và để nguội ở nhiệt độ 45 ~ S0”C Lắc tròn đĩa petri xudi và

ngược chiếu kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần Để trên mặt phẩng ngang cho Agar đồng tự nhiên, Khi môi trường đã đông, lật úp đĩa và ú ở 37C, Đếm số khuẩn lạc hiện

điện san 24 giờ,

tình 2.3: Can nhựa 30 la dùng trong việc thủ gam sóa về các trạm trung Chuyển (À); Vệ sính bằng nước xà phòng rầa chén và nước mãy trước sau mỗi đợi thu gom sữa (B)

Trang IlÍ

Hình 3.3: Lấy mẫu sữa (À) và định tính ví sinh tật hiện điện trong mẫu sữa bằng phần

wig mau methylen (B)

2.2.8.1 Tém tit qui trình giết m

Trước khi giết mổ các mặt sàn được vệ sinh bằng cách rữa dưới vôi nước

giếng Heo được mổ trực tiếp trên sần xi mãng cách mặt đất khoáng 20 ~ 3cm Trong suốt quá trình mổ, heo được rửa liên tục đưới vời nước giếng Bộ lòng hco sau

khi tách ra Khỏi cơ thể, được chuyến sang mật sẵn inox để tiếp tục xử lý, Trong khi Trang 12

đó, cơ thể heo được tách đọc làm đối, treo trên các giá inox Lúc này việc mổ heo đã

hoàn tất và thị heo được phân phối cho người tiêu đùng, Các hoạt động giết mổ

được mô tả trung Hình 2.5 ~ 2.7

&

Hình 2.5: Toàn cảnh lò mổ (À) và sân mổ xi mống trước giờ mổ (B)

phối (BỊ

Trang 13

2.2.5.1 Định lượng vi sinh vật hiện điện trên bể mặt sàn mổ và mẫu thịt

2.2.5.3.1 Lấy mẫu bễ mặt

Bể mặt sản xì măng và bể mặt inox được sử dụng để thứ nghiệm định

lượng tổng vi sinh vật Thao tác lấy mẫu bề mặt được thực hiện tuần tự như sau:

Rửa hai tay, tử khu$n xuống bàn tay bằng xà phòng và nước sạch

Rửa sạch bằng nước vôi Lau khô tay bằng khăn giấy

Khử trùng đôi bàn tay đến khu a bing cn

Đặt khuôn mẫu đo diện tích (10x10cm) đã khử trùng bằng cồn vào điểm cần

Hình 2.9: Quẹt sinh khốt vì sùth vật tại điểm cân kiếm tra (À}

cất lấy đầu tampon và giữ trong sppendo/ƒ () 3.2.5.2.3 Lấy mẫu this

Thịt được lấy ở vị trí bất kỹ trên thân heo sau khi mổ Mẫu được đựng trong túi vô trùng, ghí ký hiệu mẫn,

23.5.2.4 Dink heang tong vi sinh vai hién dién trén bề mỗi và mẫu thHt

Miẫu bể mặt và mẫu thịt sáu khi lấy được phần tích ngay ở phòng thi

nghiệm

Đối với mẫu bể mặt bổ sung 7TÔÔpÌ nước cất vô tùng vào các

eppcndorf đựng đầu tampon Vortex mạnh để huyền phù tế bão vì sinh vật trong 45

~ 60 giây Sử dụng 1354l để thực hiện phản ứng phát sáng như mô tả trong mục

2.2.3 Thực hiện hai lẫn thử cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình Đồng thời, tiến

hành pha loãng bậc 10 dịch huyển phù trên và định lượng vì sinh vật theo phương

một đối chứng trên bể mật sạch (đã hấp võ trùng) trong phòng thí nghiệm

Đối với mẫu thịt: cần vô trùng 25g thịt cho vào túi dap mau vd trùng,

Bổ sung 225m! nước cất vô trùng, tiến hành dap mau 3 lần mỗi lần 30 giây với tốc

độ 230 vòng/phút bằng máy đập mẫu StormacherP 400 Cừculator, Lấy 1350 dịch thu được thực biện phần ứng phát sáng như mô tả trong mục 2.2.3 Thực hiện hai lần thử cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình, Đồng thời, pha loãng bậc 19 dịch huyền phù

trên và định lượng vì sinh vật theo phương pháp để đĩa như mô tẢ trong mục 2.242,

Thực hiện đối chứng với nước cất vô trùng, Thao tác định lượng vì sinh vật bằng phần ứng phát sáng cần ATP được mô tả trong Hình 3.10 ~ 2.12

Trang l5

3.2.6, TÁCH CHIẾT PLASMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SDS - KIỂM

~ —È, cai mang plasmid được nuôi cấy quá đêm ở 37C trong 8Ö ~ 1ÙÖmi môi trường

Trang 14

LB có bể sung ampicllin nềng độ 100ug/ml, Chuyển dich nuôi cấy vào ống ly tâm lớn Ly tâm thư sinh khối ở 15.000g, 3 phút, nhiệt độ phông Rửa sinh khối bằng lÔml nước cất, ly tâm thu sinh khối ở 15.000g, 3 phút, nhiệt độ phòng,

Thém 2ml dung dich 1, vonex kỹ, Thêm 4ml dung dịch H1, đảo nhẹ vài lấn, ủ Š ~ 10 phút ở nhiệt độ phông, Thêm 3,5ml đụng dịch HĨ lạnh, đảo nhẹ vài lần và ủ trong đá 10 phú Thêm: 100H1 chloroforn Ly tâm thu dịch ở 20,Q00g, 30 phút, á°C, không thắng rotor,

Dịch nổi thu được thêm vào 6ml isopropanol, vortex nhẹ sau đó để yên LÔ phút ở nhiệt độ phòng, Ly tầm thu tủa ở 15.000g, 10 phút, 25°C, Rửa tủa thu được trên

bằng 3mi ethanol 70% lạnh, Ly tâm 15.000g, Sphút, 4C; lật ngược ống để bó

cthanol, thấm giợt ethanol cuối cùng bằng giấy thẩm Để khô tự nhiễn 2Ö ~ 3

phút

Cho vào Iml TE LX và [Ou! RNase, vortex, d 37°C (230 phat) Thém 0,6 ml PEG

6000 20%, vortex, chia déu ra 2 eppendorf U OC w8n 2 aid Ly tam thu tha Ở 20.000g, 10 phút, 4'C, Thấm khô, Tráng với 0,5ml ethanol 100%, Ly tâm thu tủa

ở 20.000, 3 phút, 4°C, để khô tự nhiền

Thêm 0,5ml TE 1X và 0,Sml phenol da cin bằng với TE, vortex kỹ Ly tấm thu dịch nổi ở 20.000g, tOphút, 4'C, Thêm Ø,5ml chiorofơm tanh, vortex Ly tam thu

dịch nổi ở 20.000g, 1Ú phút, 4C,

Thém 4Oul sodium acetate 3M và hơn Ími ethanal 106% lạnh, vortex Ly tâm thu

tủa ở 20.000, 10 phút, 4°C, Rửa tủa bằng 0,5m ethanol 70% lạnh và ly tầm tha

tủa ở 20,000g, 10 phút, 4C Làm khô tự nhiều 30 ~ 40 phút (có thể đất trong tủ 37°C trong 20 phúi, thềm 300 ~ S00nÏ TE 1X, búng nhẹ

Đo OD: xác định nâng độ DNA, độ sạch của mẫu thu được, Điện di kiểm tra mẫu

thu được,

1.3.7, ĐIỆN BIẾN NẠP DNA VÀO VIKHUẨN £ coll

Chuẩn bị tế bào E cob khả nạp:

+ Cấy 50ul huyển phà tế bão £ col vào 20ml môi tường LB lằng, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37C, Hút 3ml dịch nuôi cấy trên vào mỗi erlen ! li chứa 350ml

mỗi trường LB lỏng (š erlen}, nuôi cấy lắc 250vòng/phúi ở 37C cho đến khi giá trị OŨ,„, của dịch nuôi cấy đại D,đã ~ 0.5

Trang U7

+ Ngâm các cden trên vào nước đá trong 20 - 30 phút Lắc nhẹ để làm lạnh

đều môi trường Cho địch nuôi cấy vào các ống ly tâm đã được làm lạnh sẵn

và ly tâm thu sinh khối tế bào ở 400Qg, 4 phút, 4°C

+ Rửa sinh khối tế bão bằng nước MIH-Q lạnh vô trùng bằng cách vortex nhẹ

Ly tâm thu lại sinh khối tế bào ở 4000g, 5 phút, 4C Rửa lại sinh khối tẾ bào

trong 50ml glycerol 10% lạnh, Ly tấm ở 5000, 5 phút, 4°C, để bố nhẹ nhâng phần dịch nổi

+ Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 50ml gliycerol !0% lạnh Tiếp

tục ly tâm ở 500Óg, 5 phút, 4C Lật ngược ống đồ bỏ hết phan dịch trong, thấm giọt glycerol cuối cùng bằng giấy thấm Hòa sinh khối tế bào trong Ímil

môi rường GYT lạnh Vorex nhẹ để huyền phù sinh khối Đất vào châu đá

Nhanh chóng chuyển dịch tẾế bào vào các eppendorf vô trùng, lạnh

tdOul/eppendorÐ và giữ ở -§0°C, Sau khi chuẩn bị xong tế bào khả nạp lấy một eppendorf tiến hành điện biến nạp để kiểm tra hiệu suất biến nạp (hút LŨ

~ 25ng DNA trong dung tich 1 - Zul cho vao 40qd dich tế bào khả nạp) ~_ Điện biển nạn DNA vào vì khuẩn E coll:

+ Chỉnh mấy điện biển nạp có điện dung 25HƑ, hiệu điện thể 2,5kV, điện trở

2006 và thời gian phải sung là 5,0 iniHgiây Trộn đều, nhẹ nhàng l- 2nl DNA

plasmid trong 40w] tế bào E, coii Khả nạp Giữ trong nước đã Š phút (rong trường hợp lấy từ tủ ~ $Ó°C, để giải đồng ở nhiệt độ phòng, sau khi tan để

thanh vào chậu đá)

+ Nhẹ nhành hút lên bơm xuống vai lần và chuyển địch tế bào trên vào buông

mau (cuvette) điện biến nạp lạnh, gỗ nhẹ để dịch tế bào nằm hoàn toàn dười

đầy Lau khô hơi nước bám 6 bể mặt buông mẫu (đặt biệt là bế mặt hai bản

tụ) và đặt buồng mẫu vào máy biển nạp, Nhân núi cho máy hoạt động Nhanh chóng lấy buồng mẫu ra, cho vào ìml mỗi trường SÓC đã giữ Ẩm 37C, dùng ptipet bơm lên xuống nhiều lần để trộn tế bào, chuyển sang một eppendorf vỗ

trùng Nuôi cấy lắc ở 37C trong 4Š phút,

+ Lấy 200ul dịch trên (phân còn lại có thể giữ trong tủ mãU trải trêu mỗi trường

1B 2% agar đã hấp khử trùng có ampicilln nông độ 100ug/ml U 8 37°C wong

14 ~ lOgiỡ (hoặc íy tâm 10,000g, 2 phốt thu sinh khối tế bào, để nhanh môi trường, huyền phù nhẹ sinh khối với phân môi trường còn lại Trải hết phân

địch này),

Trang 18

2.2.8 PHẦN TÍCH VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HAN

Phan ửng cất này được thiết kể cho plasmid pBiuxc+ để thu nhận gen ic+ và

pQE-30 để thu nhận plasmid ở dạng mở vòng: thể tích phần ứng 400n1 gdm: 40pl

dung dich đệm BamHI+ 10X, [Sug DNA plasmid, 2u] BamHI (10U/u), dul Hindlll

(10U/ul) BS sung nude cho dd 400ut U phân ứng 372C, 6 - 7 giờ Tủa lại với sodiam acetate 3M va ethanol tuyệt đối, Rứa lại với cần 70%, để khô tự nhiên, hoà lại trong TE Xử lý pQE-30 với alkaline phoaphatase Tỉnh chế hỗn hợp pBlac+ qua dién di

trên ge! agarose 19 và qua cột theo qui trình của bộ tỉnh chế DNA từ gel agarose

NuleoSpin® để tha nhận gen luce

2.2.9 PHAN UNG LOAI BO NHOM PHOSPHATE

Để nâng cao hiệu quả nối, sau khí phần ứng cất hạn chế hoàn thành DNA

plasmid tiếp tục được xử lý với alkaline phosphatase Việc xứ lý này sẽ loại bổ các gốc phosphate ở đầu 5' của DNA, từ đồ làm cho plasnsd không thể tự đóng vòng trổ lại trong quá trình nội,

Thể tích phản ứng ÃOul pồm: 5ul dung dich đệm alkaline phosphatase 10X, DNA hea tan trong TE, Ipl alkaline phosphatase (1U/) BG sung TE cho di SOul Ủ

phản ứng 372C, 30 phút, Biến tinh enzyme ở 70°C, 15 phút, Hỗn hợp sau biến tính sẽ

được bổ sung LOul dung dich nap mau DNA 6X Dién di, tính chế theo NuleoSpin® kit

2.2.10 PHAN UNG NOI DOAN DNA NGOAI LAI VAO PLASMID

Các sản phẩm DNA sáu khi qua tính chế, được kiểm tra ndag d6 qua viéc do OD;suy„ và kiểm tra qua điện di trên gel agarose 1% với thang phần tử lượng DNA,

Khi mẫu đã đạt các yêu cầu, tiến hành thiết kế phần ững nối,

Sự nối một đoạn DNA ngoại lai và plasmid đã cất vòng là đo sự hình thành

cầu nối phosphodieater giữa nhóm phosphate ở đầu 5' và nhóm hydroxyl ở đầu 3” trên phần tử DNA dưới sự xúc tác của T4 DNA ligase, Các đầu 5' ~ P và 1` - OH có thể ở đạng đầu bang (blunt ends) hodec d4u dinh (sticky ends}

Thành phần phần ứng nd: 160fmole DNA plasmid (1), 945fmole ĐNA ngoại tại (2), 1,Rul Tả DNA buffer 10X (3), 4.45U T4 DNA ligase (4) va « nÍ MIH-Q cho đủ

Trang [9

Cách thực hiện: phần ứng được thực hiện trong eppendorf 0.5m Hac x ul nude Milli-O cho vao eppendorf BG sung (1) va (2) Tron đều Ú 65°C, 4 phút, Đặt nhanh vào đá, giữ trong đá trong quá trình bổ sung các thành phân khác Tiếp tục bể sung (2) Trên đều Sau cùng, bố sung (4), Đặt phần ứng ở 25°C, 2 gid Biến tính 70°C, 20 phát Tủa bing sodium acetate 3M và ethanol tuyệt đối Rửa lại bằng

ethanol 70%, để khô tự nhiên, Hoà lại với 5H nước MiHI-Q, thực hiện điện biến nạp

2.2.11 LY TRICH LUCIFERASE TAI TỔ HỢP RA KHỎI TẾ BẢO VI

KHUAN VA THU HOAT TINH

Để thử hoạt tỉnh luciferase tải tổ hợp của các dòng ví khuẩn rang gen lưc+, tiến hành như san:

~ Cấy một ít sinh khối từ một khuẩn lạc đơn vào 5ml mỗi trưởng LB có bể sung

ampicilin 100pg/ml Lắc 372C, 3 ~ 4 gid Bổ sung 5 HÍ IFTG 80GmM, lắc thêm Š

gid & 37°C Ly tam 10.000g, 3 phút 4'C để thu sinh khối tế bào, Rửa 1€ bao vdi 2ml nước cất lạnh bằng cách vortex nhẹ Ly tâm thủ sinh khối trở lại Huyền phù tế bào trở lại trong lrnl dụng dich potassium phosphate 0,1M pH 7,8, 2mM EDTA lank trong eppendorf 1.5m

— BMtc&c eppendorf nay trong đá khoảng 15 - 20 phút, Bổ sung lysozyme sao cho

dat néng dé cudi etng Imgiml, le déu Bé yén wong dé thém 15 phi Dai cdc

eppendor† này vào tủ -80°C cho téi khi déag hon toan ( 60 phid, Gidi đông ở nhiệt độ phòng và ly tâm 20.000g trong 10 phút, 4°C Lay dich trong, bộ cặn,

~_ Hút lÓÔul dịch trong thu được, bơm vào ống đo có chứa sẵn 150u1 dung địch phan ứng phái sáng Ảnh sảng phát ra được đo bằng máy đo ánh sáng và được thể hiện bằng đơn vị RLU Đơn vị này được dùng để chỉ hoạt tính tương đối của luciferase, Hoạt tính [uciferase được xác định trong một dụng tích phần ứng 250nÌ gốm Tris

- succinic 0,1M, pH 775, lômM Mg”, imM EDTA, 2ug luciferin, 4 x 10° mole

ATP

2.2.12 PHAN TICH TONG PROTEIN

~ Lấy một it sính khối từ một khuẩn lạc đơn của đồng £ coli XL1-Blue/pQe-

3Qfuc+ cấy vào Ấm môi trường LB Lắc 37C sao cho O2 /ssa„ đạt khoảng Ô 7 - 0,5 Bổ sung 5ul IPTG §00mM, lắc thêm 5 - 6 giờ ở 37C, Thực hiện một đối

chứng không cẩm ứng với IPTG, Lấy Lãml môi trường nuôi cấy cho vào eppendort Í 5ml, Ly tám 10,000g, 3 phú Lấy sinh khối, đổ bồ môi trường Rữa

với 1ml nước cất bằng cách vorex mạnh Ly tâm 10.000g, 3 phiit Thu sinh khối,

Trang 20

đổ bổ nước bền trên, thấm khô giọt cuối cùng

Huyền phủ sinh khối với 3041 nước cất, thêm 30pl dung dich nap mau protein 2X,

Vortex nhe Dun 1ÖĐC, 5 phút Ly tâm 12.000g, 5 phút Hút lOuÍ dịch bên trên

nạp vào gel SDS + PAGE 12,5%,

Nhuễm protein với Coomasie Brilliant Blue G ~ 230

2.2.13 NUOI SINH KHOITE BAO VA CHUAN BI DICH LUCIFERASE

TAI TO HOP THO

Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc đơn của dòng vị khuẩn E colifpQh-30luct edy

sang 2Ôml mỗi rường LB có bổ sung ampicilline (100ug/m)) Lac 37°C, qua dém

Hút 2ml dịch nuối cấy trén vac mdi erlen 1 lít chữa 35Ôml môi trường LB lông có

bd sung ampicilline (10Qug/ml) (2 erlen) Nuôi cấy lắc 250 vông/phút ở 37C

Theo đõi ODsu„„ cho đến khi đạt giá trị 0,7 - 0,8 Bổ sung 437HÌ dụng địch IPTG

80ÖmM vào mỗi erlen trên, Tiếp tực nuôi cấy tấc như điều kiện trên thêm 7 giờ

Ngắm các crlen trên vào nước đá trong 20 —~ 30 phút Lắc nhẹ để lầm lạnh đều môi trường, Cho địch nuôi cấy vào các ống Ìy târa đã được làm lạnh sẵn và ly tâm

thu sinh khối tế bào ở 5000g, 5 phút, 4C, Rửa sinh khối tế bào bằng nước cất lạnh bằng cách vortex nhẹ Ly tâm thu lai sinh khối tế bào ở S0O0g, 5 phút, Á”C,

Để và thấm hết nước rửa,

Bổ sung thêm 4ml dung dich đệm A lạnh Vortex để huyến phù tế bào Chuyển

huyễn phù tế bào vào Ống nghiệm thuỷ tính Giữ trong đã Bổ sung dung dich lyzozyme sao cho néng dat dat Smg/ml Vortex, để yén trong đá khoảng 20 ~ 30 phú! Đặt huyễn phũ nây vào tủ - 80°C và chờ cho đông hoàn toàn (> ó0 phúA Tiến hành giải đông ở nhiệt độ phòng, Ngay sau khi fan hoàn toàn, đặt nhanh vào hộp đá

Giữ huyển phủ tế bào trong châu đá, Tiến hành phá tế bào bằng siêu âm với

chương trình san: 12W, phát xung 30 giây, Tiến hành phát sung 4 lần và giữa các

lần nghĩ 50 giấy Chuyển địch vào các eppendorf 15ml, Ly tâm 20.000g, 30 phat,

phủ bằng vortex, Giữ trong đá, Đây là dịch luciferase tái tổ hợp thô

2.2.14 TINH CHE LUCIFERASE TÁI TỔ HỢP BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC GIỮA ION NỈ?” VÀ POLYHISTIDINE

Cơ sở khoa học: các kết quả nghiên cửu cho thấy, một chuối các aXit amin

histidine kế tiểp nhau cổ ái lực rất mạnh với lon nikel (NỈO Chuỗi axit amin này được mã hoá bởi mội số nucleotide chứa trong đoạn DNA có vai trò điều hoà trong

sự tổng hợp histidine: CACCACCAUCAUCAUCAUCAU Như vậy, nếu lấy trình tự này gấn vào đầu §' hay 3’ cla doan gen m4 hod cho protein cần quan tâm Sau dịch ma sé tap ra mot protein dung hợp (usion) với một polyhistidine & dau N hay dau C cua protein quan tim tương ứng Khi đó, polyhistidine trở thành cái đuổi (ag) trong protein dung hợp, Nếu Ni ** duce of định bởi một giả thể, khi cho một hồn hợp protein cé mang protein dung hop mang His tag thi protein dung hợp nây sẽ bị giữ lại đo polyhistdine hến kết với ion Ni" Nhờ đó được tách ra khôi hỗn bợp (Hình 3.1 3) Sau khi được tách ra khỏi hỗn hợp, protein dụng hợp được tách ra khối phức hợp Ni** - protein dung hop nhữ các chất kìm (chelator) canh tranh véi protein dung hop dé gianh lay ion NỈ (chính xác hơn là cạnh tranh với polyhisudine) Trong thực !Ế, người ta sử dụng imidazole để tách protein dung hợp ra khỏi phức hợp NỈ” - protein dung hợp với polyhisddine vì imiđazole sẽ cạnh tranh với polyhistidme Day là cơ sở khoa học của quá trình tỉnh chế protein tái t6 hop cd mang His tag

Protein quan tâm

Gia thể dược Pre eee ae

Liên kết giấu tà lan NI

poiyhistidine va Ni Polyhistidine

Hinh 2.13 : Twong tdc giffa protein dung hgp vai polyhis va gia thể đã gắn NẺ”

Trang 22

pQE-30 được thiết kế cố một chuối nucleotide mã hod cho 6 histidine dat

trước vũng MS Vì vậy, khi gen (uc+ được nối vào vùng MCS sẽ được biểu hiện ở đạng dung hợp với 6 histdine

Các ion Ni” được cổ định bằng các chất kia như iminodiacetc acid (DA) hay

nitrilotriacetc acid (NTA) Phức hợp NỈ? - IDA và NỈ” - NTA được gắn vào một giá

thé IA agarose qua vai (spacer), Độ dài của vai sẽ làm tầng ái lực của Ni? với polyhistidine, Tuỳ thuộc vào chất kim mà người ta chía thành hai loại giá thé: Ni- IDA agarose va Ni-NTA agarose,

Cúch tiến hành: tình chế taciferase tãi tổ hợp từ dòng vị khuẩn £ coi XLI-

Blue/pQE-30/uc+ bằng cột 5ml NỈ” - NTA agarose vdi dung dich dém A (100mM

potassium phosphate, pH 7,8, 300 mM NaCl, imM benzamidine ~ HCI, 10% glycerol, 1SmM imidazole), B (100uM potassium phosphate, pH 7,8, 300 mM NaCl, ImM benzamidine ~ HC}, 10% glycerot, 300mM imidazole) theo cdc thang 86 sau: vận tốc dòng chẩy: Iml/phúi, cân bằng cSt SCV, thé tich mau nạp: 2ml, rửa cột: 2CV, dung lv: SCV, phan doan: 2ml (CV: column volumn — dụng tích côi),

Mỗi phần đoạn, lấy 100ul thở hoạt tính luciferase như mô tả ở mục 2.3.11

trong phần Vật Hệu và Phương phấp, Các phân đoạn có hoạt tinh luciferase dude gom lại Tiến hành thử hoạt nh, định lượng protein và phân tích rên SDS ~ PAGE

Cột sau sử dụng được rửa với nước cất SCV Tiếp theo rửa với 6V NaOH 0,5N trong 30 phút, Tiếp rửa bằng nước cất, rửa ethanol 30% và giữ với ethanol 30% trong

lạnh chó tới khi dùng

2.2.18 PHAN TICH PROTEIN BANG BIEN DI TREN GEL

POLYACRYLAMIDE CO SDS (SDS-PAGE) |

Chuẩn bị để một gel polyacrylamide kich thuée 100-x 100 x 0,75mm có nồng độ

acrylamide là 12,5% như sau:

~ Chuẩn bị một dung dịch gel phân tích (separating gel) có tổng thể tích là 6,7ml có thành phần được bổ sung theo thử tự sau: 2,2ml nước cất, 1,6?ml Tns - HƠI 1,5M

pH 8,8, 2,78ml 30% acrylamide 03% bisacrylamide, 67p1 SDS 10%, SO!

ammonium persuifate 10%, Lac nhe cho tan ammonium persulfate Thém Zyl TEMED

Sau khi cho TEMED vio ding pipette Pasteur hodc micrompette bom dung dich gel vào khuôn để gel sao cho mức dung địch gel cao 7cm Sau đó, nhẹ nhàng đặt một

~ me

lớp nước cất lên trên lớp gel vừa để để quá trình polymer hóa xây ra, Chỡ gel cứng

Trang 23

~ Chuẩn bị một dung dịch gel gom (stacking gel) tổng thể tích 2ml có thành phần

được bể sung theo thứ tự sau: l,1Šmi nước cất, 05ml Ti - HCI 0,5M: pH 6,8,

03ml 30% acrylamide 0,8% bisacrylamide, 20u1 SDS 10%, Ly) ammonium persulfate 10% Lắc nhe cho tan ammonium sulfate Bể sung 1HÍ TEMED

Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn (sau 25 - 30 phú, hút hết nước

bến trên Dàng giấy lọc thấm khô mặt ong của hai tấm kiếng làm khuôn để gekL

Tiển hành để lớp gel gom bằng cách dùng pipeue Pasteur hoặc núcropipette bơm

dung dịch gel gom vào khuôn Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu Sau khi gel trùng ngưng, tiến hành lấy lược ra và lấp dia gel vào bộ điện dì, Cho dụng

địch điện đi vào buồng điện di

~_ Xứ lý mẫu: lÔjl mẫu trộn với 10u] dung địch nạp mẫu 2X Đun sôi cách thủy 5 phút, Mẫu được nạp hết vào giếng (2000)

~_ Tiển hành chạy điện di Ổn định dòng; 2mA/giếng mẫu,

~ Sau dién di, tiến hành nhuộm géi với dung địch nhuộm đã chuẩn bị (1 - 2 gid}

~ Tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dụng dịch giải nhuộm cho đến

khí nên gel trở nên trong suốt không mầu, Thay mới dung dịch giải nhuộm khi dung dich nay cé mẫu tường đương với mâu trong nến gel,

Để giữ gel tiến hành thực hiện ruột trong hai cách: (1) lót gel trên tấm film trong

và scan hay (2) sấy khô gel trong chân không

2.2.16 ĐỊNH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc

nhuộm Coomassie Briliamt Biue khi tạo phức hợp với protein Trong dụng dịch mang

tính acid, khi chưa kết nổi với protein thì thuốc nhuộm có bước sống hấp hấp thu cực đại 465am; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng

505nm Độ hấp thụ ở bước sóng 595nm có lên hệ một cách trực tiếp tới nâng độ

So với các phương pháp xác định protein khác thì đây là phương pháp có độ

nhạy cao có thể xác định tới lung, hóa chất đơn giản ít tốn thời gian, Một du điểm lớn

của phương phấp này là ít bị cần trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

protein, nhat lA ammoniom sulfate

Trang 24

Cách tiến hành: phần ứng mầu được thực hiện trong các ống nghiệm theo trình tự

~ Lập 3 loạt ống nghiệm, mỗi loạt 6 ống được đánh số theo thử tự Oa, Ob, la,

~ Đối với ống 0a, 0b cho vào Imil nước cất, Hút 6,1, 6,2, 6/3, 0,4, 05m1 dụng dịch

albumin 0,1mg/ml cho lần lượt vào các ống 1a, Ìb, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, Sb

lượng albumin trong mỗi ống nghiệm tuần tự là 0, 10, 20, 30, 40 va 50 pe Thém

nước cất vào mỗi ống sao cho đạt thể tích chung 1ml,

~ Dùng đồng hỗ bấm giây, canh thời gian Ö phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử vào

ống nghiệm 0a, Lắc đếu, để yên

- Ở thời điểm 1 phút, chơ 5ml dung dịch thuốc thứ vào ống nghiệm 0b Lắc đều, để yên Thực hiện việc bổ sung 5ml dụng dịch thuốc thử tuần tự vào các ống la, 1b,

2a, 2b ở các thời điểm cách nhau 1 phút Đến thời điểm 11 phút, chớ 5ml dung

dịch thuốc thử vào ống ób, Lắc đều, để yên

~_ Tính thời giao ống 0a được 20 phút, tiến hành áo độ hấp thu của dụng dịch ở bước sống 59Šnm (UĐ:u;)

Tính thời gian ống Ob được 21 phút, tiến hành đo ODa¿; đ bước sống 595nm, Tuần

tự tiến hành đo ODa„; của các ống còn lại tại các thời điểm cách nhau Ì phúc

Đến thời điểm 31 phút tiến hãnh đu ống 6b ~_ Lấy giá trị trung bình của hai ống a và b

~ Lẩy OD¿s; của ống thử thật (có protein) wif ODs95 của ống thử không (không có

proftem) được AO Days

~ Vé& dudng tuyén tính giữa nồng độ protein (ug/mD với mật độ quang (AODsos) ~_ Việc đo mẫu cũng được tiến hành tương tự với thời gian cho phần ứng là 20 phút,

Mẫu được đo với thể tích sao chớ QDs¿ đo được nằm trong khoáng ODa¿; của đường chuẩn,

Tran aq td

KẾT QUÁ & BIỆN LUẬN

3.1 THIẾT KẾ VÀ CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐẾM ANH SANG

3.1.1 MÔ TẢ CẤU TẠO VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ

Thiết bị được thiết kế và chế tạo theo cấu hình và đặc tính của thiết bị đo ánh sáng Luminoskan TL của hãng Labsystems:

+ Nguyễn tắc đo r

Thiết bị được thiết kế dựa trên nguyên tấc phát quang của phần ứng lhiciferm -

luciferase có sự tham gia của ATP trong tế bào sống, Cường độ ánh sáng phát ra của mẫu được biến đổi sang tín hiệu điện nhờ Ông nhân quang PMT (Photo Multiplying

Tube) Tin hiéu dong clia dng PMT sé được đo nhờ Hệ điện tử có sử dụng kỹ thuật vi

xử lý

+ ÄđÓ (â thiết bị :

Các Hình 3.1Á, B, C mô tâ các chí tiết bên ngoi của thiết bị, Thiết bị gồm:

- Cổng nối với điện nguồn (1} cũng cấp dòng điện một chiều 12V từ điện xoay

chiếu 220V

- Công tắc chính (2)

~ Cổng tuyển dif iéu RS322 (3): truyền đữ liệu qua máy tinh để lưu trữ hoặc

xử lý bằng phắn mềm

- Buồng đo (4): nơi đặt ống đo chứa dụng địch phần ứng phát sáng

- Măn hiển thị (51: hiển thi 4 chữ số (0,000 - 9999)

- Nút đo (6): dùng để đo

- Nút chỉnh 0 (: đăng để chỉnh không tin hiệu nến

+ Cấu hình và nguyên tắc hoại động của thiết bi:

Cấu hình nguyễn tắc của thiết bị được mồ tả trong Mink 3.2 Thiét bi gam hai phần: cơ khi và điện tử, |

Trang 26

~ Phần cơ khí chủ yếu là buỗng đo được thiết kế nhằm thực hiện việc chuyển

mau vào buồng đo một cách tuyết đối kín không cho ánh sáng tự nhiên chiếu vào

ống nhân quang PMT và ánh sáng từ phân ứng có thể được thu nhận tối đa bởi PMT, Buồng đo được thiết kế là một buồng tối có mâm xoay có đặc tính:

+ Khi xoay đến vị mí mở, cửa buồng đo mở để có thể đặt ống do vào buồng đo, ống nhãn quang PMT được che kn,

+ Khi xoay đến vị trí đồng, buồng ảo hoàn toàn kín đổi với ảnh sáng bên

ngoài, cửa buồng đo sẽ mở ở vị trí của PMIT, ống nhân quang này thu nhận tín hiệu phat sang

- Phin dién tử gồm Ong nhan quang, Tién khuéch dai ohay dién tich, Khuéch đại, Bộ biến đổi tương tự - số (ADC), B6 chỉ thị Nút điển khiến, Bộ cao thể, Bộ nguồn nuôi,

+ Ông nhân quang PMT: được thiết kế riêng để nhận ánh sáng yếu của phần

ứng phát sáng sinh học Cấu tạo cửa sổ nhạy sáng nằm phiá bên của Ống

+ Cao thế nuồi ống PMT khoảng 1000V có độ ổn định cao

+ Nguồn nuôi cho hệ có thể từ nguồn thể mạng 220V AC được chính thành

điện một chiều 12V,

+ Tiển khuếch đại nhạy điện tích, Khuếch đại và Bộ biến đổi tương tự - số

{ADC): Dòng ra từ ống PMTT dưới dạng điện tích được BS tiến khuếch đại nhạy điện

tích biển đổi sang dạng điện thế với thời gian biến đổi khoảng 10 giây, Điện thế tỷ lệ

với cường độ sáng sau khi được khuếch đại nhờ Bộ khuếch đại được đưa đến Bộ biển

đổi tương tự - số, Kết quả biến đổi được Khối xử lý trung tâm thu nhận và xử lý, sau

đó được chỉ thị trên bộ chí thị gầm 4 số

Sơ để mạch của các phần chính được trình bày trên Hình 3.3~ 3.5

Trang 27

TNs

>= ché tae

Hình 3.1C: Các chỉ tiết bên ngoài của mây đểm ảnh sắng

4, Buéng do; 5 Man hide thị 6, Nút áo; 7 Nat chink 0

Trang 30