Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano ulvan polysaccharide từ ulvan polysaccharide trong rong lục, hướng đến ứng dụng làm chất dẫn thuốc trong y sinh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH Mã số: VAST03.04/15-16 Hướng KHCN: Khoa học vật liệu (Mã hướng: VAST03) Đơn vị chủ trì:Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân NHA TRANG, 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH Mã số: VAST03.04/15-16 Xác nhận quan chủ trì đề tài NHA TRANG, 2017 Chủ nhiệm đề tài MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG iii v DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ vii Mở đầu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sulfate polysaccharide từ rong lục 1.2 Rong lục chi Ulva Ulvan 1.2.1 Rong lục chi Ulva 1.2.2 Ulvan : Thành phần hóa học, cấu trúc ứng dụng 1.3 Nanogel 11 1.3.1 Định nghĩa nanogel 11 1.3.2.Cơ chế hình thành nanogel 12 1.3.3 Phương pháp điều chế nanogel 13 1.4 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực Đề tài 17 1.4.1 Ngoài nước 17 1.4.2 Trong nước 25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phân tích thành phần hóa học mẫu rong thu thập 28 2.2.2 Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ lồi 29 rong lục thuộc chi ulva 2.2.3 Xây dựng quy trình chuyển hóa ulvan polysaccharide thành 31 nano ulvan polysaccharide 2.2.4 Nghiên cứu cấu trúc hóa học cấu hình không gian sản phẩm 33 ulvan polysaccharide nano ulvan polysaccharide 2.2.5 Thử hoạt tính sinh học ulvan polysaccharide nano ulvan 34 thu 2.2.6 Đánh giá hiệu việc nano hóa định hướng cho khả dẫn 37 thuốc CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Thu thập số loài rong lục thuộc 02 chi ulva chi 38 Enteromorpha phân tích thành phần hóa học mẫu rong thu thập 3.2 Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ loài rong 43 lục thuộc chi ulva 3.2.1 Phân tích thành phần nguyên liệu 3.2.2 Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết polysaccharide 44 44 3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết ulvan 47 3.2.4 Đề xuất quy trình 50 3.3 Xây dựng quy trình chuyển hóa ulvan polysaccharide thành 53 nano ulvan polysaccharide từ loài rong lục thuộc chi ulva làm nguyên liệu điều chế chất dẫn thuốc 3.3.1 Thủy phân ulvan polysaccharide 3.3.2 Axetyl hóa ulvan polysaccharide thủy phân 54 57 3.3.3 Phân tích phổ huỳnh quang AcU EU 59 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ polyme amphiphilic (AcU) lên kích thước 62 hạt nanogel zeta 3.3.5 Thử nghiệm nanogel ulvan mang curcumin 3.4 Nghiên cứu cấu trúc hóa học cấu hình không gian sản phẩm 63 71 ulvan polysaccharide nano ulvan polysaccharide 3.5 Hoạt tính sinh học ulvan Acetyl ulvan (AcU) 3.5.1.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 84 84 3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào 86 3.5.3 Hoạt tính chống oxy hóa 89 3.6.Đánh giá hiệu việc nano hóa định hướng cho khả dẫn 90 thuốc CHƯƠNG CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 94 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 PHỤ LỤC 13 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT C- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C H- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H AOAC : Hiệp hội hóa học phân tích COSY : Phổ tương tác chiều đồng hạt nhân 1H-1H CS% : % tế bào sống sót DA : Mức độ acetyl hóa DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI -MS : Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử Gal : Galactose GlcA : Glucuronic acid GPC : Sắc ký thẩm thấu gel Hela :Ung thư cổ tử cung Hep-G2 : Ung thư gan người HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC IC50 IdoA : Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết : Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm : Iduronic acid IR : Phổ hồng ngoại J (Hz) MALDI-MS Man MBC MCF-7 : Hằng số tương tác : Phổ khối lượng ion hóa hấp thụ laze : Mannose : Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu : Ung thư vú người MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu NCI : Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ NOESY : Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1H-1H OD : Mật độ quang học PIC-NGs Polyion complex nanogels Rha : Rhamnose SAXS : Tán xạ tia X góc nhỏ SEM : Hiển vi điện tử quét SP : Sulfate polysaccharide TFA : Trifluoroacetic acid TMS : Tetramethylsilane UL : U lvan chiết từ rong lục Ulva lactuca AcU : Ulvan acetyl hóa từ UL UR : Ulvan chiết từ rong lục Ulva reticulata UroA : Uronic acid WHO : Tổ chức y tế giới Xyl : Xylose δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học DANH MỤC BẢNG STT 01 Tên bảng Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học polysaccharide dạng ulvan chiết Trang 21 từ số loài rong lục thuộc chi rong Ulva Chaetomorpha 02 03 Bảng 2.1 Danh sách loài rong địa điểm thời gian lấy mẫu Bảng 2.2: Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 28 30 polysaccharide 04 Bảng 3.1 Các loài rong lục sử dụng làm nguyên liệu sinh học để 38 điều chế SPs 05 06 Bảng 3.2 Thành phần hóa học rong lục Bảng 3.3 Thành phần polysaccharide rong lục 41 42 07 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết 45 polysaccharide 08 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hiệu 45 suất chiết polysaccharide 09 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu suất chiết 46 polysaccharide 10 11 Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH đến hiệu suất chiết polysaccharide Bảng 3.8 Các yếu tố khảo sát điều kiện chiết tối ưu 47 47 12 Bảng 3.9 Kết thí nghiệm tối ưu hóa theo phương án CCF 48 13 Bảng 3.10 Phân tích phương sai kết thí nghiệm tối ưu hóa 49 14 Bảng 3.11 Kết xác định khối lượng phân tử ulvan 55 15 Bảng 12 Ảnh hưởng nồng độ polyme amphiphilic lên kích 62 thước hạt zeta hạt 16 17 Bảng 3.13 Các đỉnh đặc trưng phổ IR AcU AcU-Cur Bảng 3.14 Kết phân tích phổ IR ulvan chiết từ rong ulva 67 72 lactuca 18 19 Bảng 3.15 Kết phân tích phổ 1H 13C-NMR UL Bảng 3.17 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ulvan chiết từ 02 loài rong Ulva reticulata (UR) Ulva lactuca 79 85 20 (UL) AcU Bảng 3.17 Kết thử độc tính dòng tế bào ưng thư 88 ulvan chiết từ rong lục Ulva lactuca 21 Bảng 3.18 Kết thử độc tính dịng tế bào ưng thư 88 ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata 22 Bảng 3.19 Kết thử độc tính dòng tế bào ưng thư 89 AcU 22 Bảng 3.20 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa ulvan 90 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ STT 01 Tên hình đồ thị Hình 1.1 Sơ đồ biểu thị phân bố lồi rong lục có sulfate Trang polysaccharide 02 03 Hình 1.2 Cấu trúc chuỗi mạch ulvan Hình 1.3 Cơ chế tạo hydrogel ulvan qua a) Ca2+ borate ester phần b) carboxylate c) sulfate 04 Hình 1.4 Nanogel điều chế dựa vào tương tác tĩnh điện 13 polymer 05 06 Hình 1.5 Hai phương pháp điều chế nanogel Hình 1.6 Nanogel điều chế từ polymer biến tính chứa 14 15 gốc kỵ nước 07 08 Hình 1.7 Quá trình hình thành nanogel CHPOA-PEGSH Hình 1.8 Cấu trúc hóa học ulvan từ rong lục Ulva pertusa 16 20 09 Hình 1.9 Cấu trúc sợi nano hình thành tác dụng Ulvan 24 với PVA poly(vinyl alcohol) / H3BO3/Ca2+ thơng qua liên kết hydrogel 10 11 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình tách chiết polysaccharide điện tích Hình 3.1 Hình ảnh số lồi rong lục 29 40 12 Hình 3.2 Bề mặt đáp ứng hàm mục tiêu Y (X1=6,0, X4 = 25) 50 13 Hình 3.4 Quy trình tách chiết ulvan từ lồi rong Ulva lactuca 51 14 Hình 3.5 Quá trình tự kết tụ tạo michelle cấu trúc lõi-vỏ 53 15 Hình 3.6 Quá trình tự kết tụ tạo nanogel 54 16 Hình 3.7 Phổ GPC ulvan thủy phân thời gian 56 17 Hình 3.8: Phổ GPC ulvan thủy phân thời gian 56 18 Hình 3.9.Sơ đồ phản ứng axetyl hóa ulvan 57 19 Hình 3.10 Phổ 1H NMR mẫu ulvan thủy phân (UL) ulvan thủy 58 phân acetyl hóa (AcU) 20 Hình 3.11 Phổ 1H NMR mẫu ulvan thủy phân (U) ulvan thủy 59 21 phân ester hóa (EU) Hình 3.12 Phổ huỳnh quang kích thích pyrene mẫu Ac.U EU 61 22 Hình 3.13 Phổ huỳnh quang phát xạ pyrene mẫu AcU EU 61 23 Hình 3.14 Kích thước hạt nanogel nồng độ Polyme 63 amphiphilic (AcU) khác 24 25 Hình 3.15 Phổ IR AcU (xanh), AcU-Cur (đỏ) Cur (vàng) Hình 3.16 .Phổ huỳnh quang curcumin nước (Cur-water) 65 66 Curcumin nanogel (Cur-Au) 26 27 Hình 3.17 Thế zeta hệ AcU-Cur Hình 3.18 Kích thước hạt nanogel AcU-Cur 67 68 28 Hình 3.19 Đặc điểm hình thái nanogel AcU-Cur a Ảnh 69 FESEM B Phân bố kích thước hạt curcumin từ ảnh chụp FESEM C ảnh chụp TEM 29 30 Hình 3.20 Phổ IR ulvan chiết từ rong ulva lactuca Hình 3.21 Phổ 1H-NMR ulvan chiết từ rong ulva lactuca 72 73 31 Hình 3.22 Phổ 13C-NMR UL 74 32 Hình 3.23 Phổ COSY UL 75 33 Hình 3.24 Phổ HSQC UL 77 34 Hình 3.25 Phổ HMBC UL 78 35 Hình 3.26 Phổ ESI-MS ulvan UL 80 36 Hình 3.27 Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 81 37 Hình 3.28 Đồ thị Kratky dung dịch UR 1% nước 83 NaCl 0,5 M 38 39 Hình 3.29 Biểu đồ Guinier dung dịch UR 1% nước Hình 30 Kết thử hoạt tính kháng dịng vi khuẩn A) E coli 84 85 and B) Pseudomonas aeruginosa C) Enterobacter cloace 40 ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata đĩa thạch Hình 31 Hình ảnh thể ức chế dòng tế bào ung thư a) 87 HepG2, b) MCF7 c) Hela ulvan UL với nồng độ khác 41 42 Hình 3.32 Hình chụp curcumin tan dung dịch AcU (Au-Cur) curcumin tan nước (Cur) Hình 3.33 Ảnh hưởng thời gian lên khả giải phóng 91 91