(Luận văn) xác định genotype hpv (human papilloma virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của bệnh viện trường đại học y khoa thái nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử reverse dot blot

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - VŨ KỲ LIÊN lu XÁC ĐỊNH GENOTYPE HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) an va n Ở MỘT SỐ PHỤ NỮ TỚI KHÁM TẠI KHOA SẢN CỦA tn to ie gh BỆNH VIỆN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA THÁI p NGUYÊNNHIỄM VIRUS BẰNG KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ w d oa nl REVERSE DOT BLOT an lu nf va LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC z at nh oi lm ul z m co l gm @ va http://www.ltc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN an Lu Thái Nguyên, 2015 ac th si ii MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu lu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU an va 1.1 HPV – Human Papilloma Virus n 1.1.1 Đặc điểm HPV to 1.1.3 Phân type HPV p ie gh tn 1.1.2 Bộ gen HPV 1.1.4 Chu kỳ sống 10 nl w 1.2 Ung thƣ cổ tử cung HPV ngƣời 13 d oa 1.2.1 Các bệnh HPV 13 an lu 1.2.2 Ung thƣ cổ tử cung 14 nf va 1.2.3 Dịch tễ học HPV 18 1.3 Các phƣơng pháp phát HPV 20 lm ul 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 20 z at nh oi 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 z gm @ 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 24 l co 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 m 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 an Lu 2.3.1 Phƣơng pháp thu nhận xử lý mẫu bệnh phẩm 26 va http://www.ltc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si iii 2.3.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA phenol - chloroform 26 2.3.3 Phƣơng pháp Realtime-PCR phát HPV-DNA 27 2.3.4 Phƣơng pháp lai Reverse Dot Blot (RDB) 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số phát HPV-DNA 31 3.2 Kết xác định type (genotype) virus HPV 34 3.2.1 Kiểu type HPV đƣợc phát 36 3.2.2 Sự phân bố types HPV đƣợc phát 37 3.2.3 Sự đồng nhiễm type HPV 38 lu KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 41 an n va KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 p ie gh tn to KHUYẾN NGHỊ 41 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu va http://www.ltc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ASCUS Atypical Squamous cell of Undetermined Significance Thay đổi tế bào biểu mô gai khơng điển hình CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia Tân sinh biểu mô cổ tử cung EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EV Epidermaldysplasia Vereuciform Rối loạn mụn cóc da biểu mô HGSIL High-grade Squamous Intraepithelial Lesion Tổn thƣơng biểu mô lát mức độ cao IARC International Agency for Resegrch on Cancer Tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế kb Kilo base kDa Kilodalton lu STT an n va p ie gh tn to oa nl w LCR 10 LSIL 11 ORF 12 PCR 13 d Vùng điều khiển dài Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion Tổn thƣơng biểu mô lát mức thấp nf va an lu Long Control Region Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RDB Reverse Dot Blot Lai phân tử 14 SIL Squamuos Intraepithelial Lesion 15 URR Upstream Regulatory Region 16 VLPs Virus like particles z Khung đọc mở z at nh oi lm ul Open reading frame l gm @ Tổn thƣơng biểu mô vảy m co Vùng điều hòa thƣợng nguồn an Lu va http://www.ltc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN Hạt virus giả ac th si v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Sự hình thành capsid genome HPV Hình 1.2 Hình dạng HPV Hình 1.3 Cấu trúc gene HPV Hình 1.4 Bộ gene HPV dạng mạch thẳng Hình 1.5 Cấu tạo hạt giả virus Hình 1.6 Hình ảnh HPV gây mụn cóc da sùi mào gà miệng 14 Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt chế gây ung thƣ HPV 15 Hình 1.8 Hình ảnh ung thƣ cổ tử cung 17 lu Hình 1.9 Hình ảnh tế bào biểu mơ cổ tử cung bình thƣờng (trái) tế bào ung thƣ an n va cổ tử cung (phải) 18 Hình 3.1 Kết phát HPV (HPV-DNA dƣơng tính) 32 gh tn to Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV mẫu bệnh phẩm 26 ie kỹ thuật Realtime-PCR 32 p Hình 3.2 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE chứng dƣơng 32 nl w Hình 3.3 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE 33 d oa chứng âm 33 an lu Hình 3.4 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE 33 nf va mẫu xét nghiệm 33 Hình 3.5 Sơ đồ vị trí gắn mẫu dò probes đặc hiệu cho 24 types HPV màng lm ul lai 36 z at nh oi Hình 3.6 Biểu đồ phân bố types HPV 37 Hình 3.7 Tỷ lệ đồng nhiễm type HPV 39 Hình 3.8 Kết màng lai với nhóm HPV nguy thấp (type 6, 11 81) 40 z gm @ Hình 3.9 Kết màng lai với nhóm HPV nguy cao (type 16 18) 40 Hình 3.10 Kết màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy thấp-thấp 40 l m co Hình 3.11 Kết màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cao-thấp 40 an Lu va http://www.ltc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 2.2 Các thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm type HPV 37 Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm đơn đồng nhiễm types HPV 38 Bảng 3.3 Tỷ lệ đồng nhiễm types HPV 38 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu va http://www.ltc.tnu.edu.vn n Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện ung thƣ cổ tử cung loại ung thƣ xếp thứ hai bệnh ung thƣ phổ biến phụ nữ giới nhƣng lại chiếm vị trí đầu bệnh ung thƣ phụ nữ nƣớc phát triển HPV (Human Papilloma Vius) mối nguy hiểm đe dọa sức khỏe ngƣời phụ nữ mắc ung thƣ cổ tử cung phụ nữ mang virus HPV đƣợc định type (genotype) dựa khác biệt trình tự DNA virus Đến nhà khoa học xác định đƣợc 100 type HPV khác 80 type đƣợc giải trình tự tồn hệ lu gen type lại đƣợc giải mã phần Dựa khả gây an n va tổn thƣơng mô học, đặc biệt khả gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70 HPV16, 18 chiếm tỷ lệ gh tn to chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cao (High-risk HPV) gồm type HPV16, ie cao Các type HPV nguy cao nguyên nhân gây tổn thƣơng p nghiêm trọng phát triển thành ung thƣ cổ tử cung Nhóm HPV nguy thấp nl w (Low-risk HPV) gồm type HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64 phổ d oa biến HPV6, 11 Các type nguy thấp tác nhân gây nên đa số dạng an lu sùi mào gà sinh dục (HPV6, 11), mụn cóc chân (HPV1), mụn cơm tay (HPV2) nf va dạng viêm nhiễm khác Mối liên quan nhiễm HPV ung thƣ cổ tử cung đƣợc xác định từ lm ul năm 70 thể kỷ trƣớc, theo HPV gây rối loạn sinh sản tế bào z at nh oi biểu mô cổ tử cung, với diễn tiến tự nhiên từ viêm nhiễm mạn tính, đến dị sản nhẹ, dị sản vừa, dị sản nặng, ung thƣ cổ tử cung Tuy hầu hết (khoảng 98%) tình trạng nhiễm HPV tự khỏi, nhƣng types HPV thuộc nhóm nguy cao z gm @ làm tổn thƣơng cổ tử cung nặng thành ung thƣ, thƣờng sau khoảng 10 năm Khi bị nhiễm có tổn thƣơng HPV, khơng có thuốc điều trị đặc hiệu l m lấy tổn thƣơng co cho HPV, để tránh nguy tổn thƣơng diễn tiến nặng hơn, có cách điều trị an Lu n va ac th si Hạn chế quan hệ tình dục sớm, khơng quan hệ tình dục với nhiều ngƣời tình dục an tồn cách giúp giảm nguy nhiễm HPV Tuy nhiên, cách phòng ngừa nhiễm HPV hiệu tiêm ngừa vacxin, Việt Nam lƣu hành loại vacxin phòng types HPV phổ biến (type 6, 11, 16 18) vacxin Vacxin Gardasil (MERCK &CO., Inc.,) vacxin Cervarix (GlaxoSmithKline) Với tiến y khoa đại, ung thƣ cổ tử cung đƣợc chữa khỏi bệnh đƣợc phát sớm Do bên cạnh việc tầm sốt ung thƣ cổ tử cung xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (xét nghiệm PAP) việc phát tình trạng nhiễm HPV định type virus có vai trò quan trọng lu Trên sở kết thu đƣợc từ đề tài nghiên cứu HPV trƣớc đây, an n va thực đề tài “Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) số virus kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot” gh tn to phụ nữ tới khám khoa sản Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm Phát đƣợc HPV phụ nữ kỹ thuật Realtime-PCR p ie Mục tiêu nghiên cứu nl w Xác định đƣợc genotype HPV kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot d oa Nội dung nghiên cứu an lu - Nghiên cứu phát tình trạng nhiễm HPV nhóm phụ nữ đƣợc lựa nf va chọn kỹ thuật Realtime-PCR - Xác định genotype HPV trƣờng hợp nhiễm virus kỹ lm ul thuật lai phân tử Reverse Dot Blot z at nh oi z m co l gm @ an Lu n va ac th si CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HPV – Human Papilloma Virus 1.1.1 Đặc điểm HPV Human Papilloma Virus (HPV) nhóm virus có kích thƣớc nhỏ, mang vật liệu di truyền DNA, gây bệnh ngƣời thuộc họ Papovaviridae HPV có cấu trúc capsid khơng vỏ đối xứng xoắn ốc, đƣờng kính hạt virus khoảng 52- 55nm chứa DNA dạng vòng, mạch đôi, liên kết với protein giống histone Vỏ capsid đƣợc tạo thành từ 72 đơn vị capsomere, đơn vị pentamer protein cấu trúc L1 protein cấu trúc L2 (protein thành phần kháng nguyên đƣợc sử dụng lu miễn dịch đặc hiệu) Cả hai protein cấu trúc virus tự mã hóa: Protein an n va capsid (L1) chiếm khoảng 80% tổng số protein virus Protein capsid phụ xoắn cuộn chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ q trình chép Ngồi ra, gh tn to (L2) chiếm khoảng 20% Riboxom có hệ số lắng 21S Tiểu phần lớn có vịng ie tiểu phần thứ có hệ số lắng 14S xuất chịu trách nhiệm chép lại p DNA tế bào chủ bao Virion Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ đƣợc d oa nl w gọi Virion giả hay Pseudovirion nf va an lu z at nh oi lm ul z @ m co l gm Hình 1.1 Sự hình thành capsid genome HPV an Lu n va ac th si lu an n va to Hình 1.2 Hình dạng HPV gh tn HPV không phát triển điều kiện nuôi cấy phịng thí nghiệm, p ie muốn thực đề tài dựa nghiên cứu invivo ngƣời bị nhiễm mẫu bị nhiễm đƣợc lƣu giữ nhiệt độ -700C thời gian oa nl w dài mà không làm ảnh hƣởng tới khả hoạt động virus [22] 1.1.2 Bộ gen HPV d an lu Genome HPV phân tử ADN kép khơng hồn chỉnh, siêu xoắn nf va vòng tức capsome xếp xung quanh theo chiều xoắn acid nucleic (ở DNA) tạo thành ống giống nhƣ cầu thang xoắn, chiều dài capsid phụ thuộc lm ul chiều dài sợi acid nucleic, gen virus chiếm 12% trọng lƣợng hạt virus, có kích z at nh oi thƣớc nằm khoảng 7,2 kb đến 8,1 kb (trong base Guanine Cytosine chiếm 42%), 10 khung đọc mở ORF Khung đọc mở mã hố cho tồn protein z HPV nằm mạch phân tử ADN kép, tức chép, phiên mã m co l gm @ xảy mạch theo chiều [22] an Lu n va ac th si 32 lu Hình 3.1 Kết phát HPV (HPV-DNA dương tính) an kỹ thuật Realtime-PCR va n Hình 3.1 cho thấy tín hiệu huỳnh quang màu FAM mẫu xét nghiệm, tn to chứng dƣơng chứng âm Với chứng dƣơng mẫu xét nghiệm cho thấy tín hiệu ie gh huỳnh quang tuyến tính màu FAM vƣợt qua đƣờng (base line), với p chứng âm tín hiệu huỳnh quang màu FAM nằm dƣới đƣờng Khi kết hợp kết tín hiệu huỳnh quang với tín hiệu huỳnh quanh chứng nội w oa nl cho thấy phản ứng đạt yêu cầu d * Phân tích chứng dƣơng, chứng âm: nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu Hình 3.2 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE chứng dương n va ac th si 33 lu an Hình 3.3 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE n va chứng âm tn to Hình 3.2 cho thấy chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu gh FAM tuyến tính vƣợt tín hiệu (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) đƣờng biểu diễn p ie tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính khơng vƣợt qua tín hiệu (đƣờng biểu w diễn âm tính) Chứng âm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính oa nl đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính (Hình 3.3.) Kết cho d thấy phản ứng khuếch đại đạt yêu cầu nf va an lu * Phân tích mẫu xét nghiệm dƣơng tính: z at nh oi lm ul z m co l gm @ mẫu xét nghiệm an Lu Hình 3.4 Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE n va ac th si 34 Hình 3.4 cho thấy mẫu xét nghiệm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vƣợt tín hiệu (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) Kết với kết phân tích chứng dƣơng chứng âm cho thấy mẫu xét nghiệm dƣơng tính thực (phát đƣợc HPV-DNA mẫu huyết bệnh nhân) Với mẫu xét nghiệm có chứng nội dƣơng tính đƣợc kết luận mẫu âm tính thật (không phát đƣợc HPV-DNA mẫu huyết bệnh nhân) * Kết phát HPV-DNA tỷ lệ nhiễm HPV: Qua tiến hành phản ứng Realtime-PCR với mẫu phết bệnh phẩm cổ tử cung lu 166 phụ nữ có hình ảnh tổn thƣơng lâm sàng, kết cho thấy phát an n va đƣợc 47 mẫu cho kết HPV-DNA dƣơng tính thực Số mẫu bệnh phẩm lần thực phản ứng, điều cho thấy chất lƣợng phản ứng khuếch đại gh tn to lại (119) âm tính Khơng có tƣợng dƣơng tính giả âm tính giả ie HPV-DNA đảm bảo yêu cầu Nhƣ tỷ lệ nhiễm HPV số phụ nữ khám p phụ khoa đƣợc lấy mẫu xét nghiệm phát HPV 28,31 % Đã có khác biệt nl w tỷ lệ nhiễm HPV kết nghiên cứu so với kết nghiên d oa cứu nƣớc công bố [1], [3], [4], [5], [7], [8] Sự khác biệt giải an lu thích đối tƣợng nghiên cứu không giống nhƣ phụ nữ khám phụ nf va khóa, phụ nữ hành nghề mại dâm, …; có khác biệt thời điểm nghiên cứu, khu vực nghiên cứu số lƣợng mẫu thu thập nghiên cứu lm ul Tất sản phẩm PCR dƣơng tính với HPV đƣợc sử dụng trực tiếp cho z at nh oi định type HPV kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot 3.2 Kết xác định type (genotype) virus HPV Việc xác định type HPV không dựa vào khác biệt cấu trúc kháng z gm @ nguyên virus (định type huyết thanh) nhƣ việc định type nhiều virus khác (virus gây viêm gan, HIV…) mà đƣợc dựa tƣơng đồng HPV-DNA Đến l co có 200 types HPV khác đƣợc xác định, 80 types đƣợc m giải trình tự tồn hệ gene types cịn lại đƣợc giải mã phần an Lu Nhƣ thấy HPV số virus có nhiều types Khi type n va ac th si 35 HPV có 10% gene vùng E6, E7, L1 khác với types HPV đƣợc xác định đƣợc xem type HPV Dựa khả gây tổn thƣơng mô học, đặc biệt khả gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm: Nhóm HPV nguy cao (High-risk HPV) gồm types HPV16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70 Trong HPV16 HPV18 chiếm tỷ lệ cao Các types HPV nguy cao nguyên nhân gây tổn thƣơng nghiêm trọng phát triển thành ung thƣ cổ tử cung Nhóm HPV nguy thấp (Low-risk HPV) gồm types HPV1, 2, 6, 8, 9, lu 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64 phổ biến HPV6 HPV11 Các types nguy an n va thấp tác nhân gây nên đa số dạng mụn cơm, mụn cóc da, sùi mào gà Đã có số kỹ thuật đƣợc sử dụng để xác định type HPV nhƣ kỹ thuật gh tn to vùng hậu môn, sinh dục dạng viêm nhiễm khác ie nested-PCR, phối hợp PCR kỹ thuật cắt enzyme cắt giới hạn, kit Hybrid Capture p Test (là thử nghiệm dựa kỹ thuật lai phân tử mẫu dò (probe) với HPV-DNA nl w phát kháng thể với phản ứng hóa quang) sử dụng phối hợp kỹ thuật PCR d oa với lai reverse blotting Nhiều nghiên cứu xác định type HPV cho thấy kết hợp PCR an lu với reverse blotting có nhiều ƣu điểm nhất, nghiên cứu nf va sử dụng phƣơng pháp việc định type HPV mẫu bệnh phẩm lâm sàng cho kết phát định tính HPV dƣơng tính lm ul Trong nghiên cứu chúng tơi, việc xác định type HPV dựa kỹ thuật Reverse z at nh oi Dot Blot với giá thể màng lai Biodyn C (Pall coporation) Đây kỹ thuật lai pha rắn, mẫu dị đặc hiệu cho trình tự đích đƣợc cố định màng lai thành điểm Sản phẩm PCR dƣơng tính đánh dấu biotin đƣợc đem lai với mẫu dò z @ (probes) gắn cố định màng lai Các mẫu dò (probes) đƣợc gắn màng lai Biodyn gm C có kit đƣợc tham khảo từ báo nhóm tác giả Van den Brule cs co l (2002), chúng nằm vùng nhân cặp mồi MY11/MY09 Phản ứng lai xảy m trình tự oligonucleotide đặc hiệu cho type HPV mẫu dò gặp chuyển an Lu động nhiệt dung dịch lai nhiệt độ thích hợp Phân tử lai đƣợc phát nhờ phản ứng màu Streptavidine-Alkaline phosphatase với chất NBT/BCIP Bộ kit n va ac th si 36 reverse Dot Blot định kiểu gene Human Papilloma Virus (Tên: LightPower iVAHPV Genotype RDB Kit, mã: VA.A02-003J, nguồn: Cty Cổ phần công nghệ Việt Á) cho phép xác định 24 types HPV diện mẫu bệnh phẩm, types virus bao gồm types virus nhóm nguy thấp 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71, 81 16 type virus thuộc nhóm nguy cao 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82 Để định type HPV kỹ thuật lai phân tử, sản phẩm PCR dƣơng tính với HPV từ phản ứng Realtime-PCR đƣợc sử dụng trực tiếp thử nghiệm lai Reverse Dot Bot * Phân tích mẫu: Với mẫu có tín hiệu dƣơng tính mạnh thấy rõ ràng hộp lu an chứa màng lai, mẫu có tín hiệu dƣơng tính yếu màng lai đƣợc lấy khỏi n va hộp đƣa lên trƣớc bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt Tín hiệu trịn HPV đó, mẫu đồng nhiễm nhiều type virus (vừa có type nhóm nguy gh tn to xanh xuất vị trí tƣơng ứng với genotype kết luận mẫu nhiễm type ie thấp vừa có type nhóm nguy cao) Những mẫu âm tính với types dƣơng p tính vị trí chứng dƣơng đƣợc kết luận “Mẫu nhiễm HPV type khác 24 d oa nl w genotype kit” nf va an lu lm ul z at nh oi Hình 3.5 Sơ đồ vị trí gắn mẫu dị probes đặc hiệu cho 24 types HPV màng lai 3.2.1 Kiểu type HPV phát z gm @ Với 47 mẫu xét nghiệm dƣơng tính với HPV-DNA, chúng tơi xác định đƣợc types HPV (gồm type 6, 11, 81, 16 18) số 24 types virus xác m co l định kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot an Lu n va ac th si 37 3.2.2 Sự phân bố types HPV phát Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm type HPV Nhóm type HPV Type HPV Số lƣợng Tỷ lệ % 12 25,53 11 11 23,4 81 14,89 16 19,15 18 17,02 47 100 Nguy thấp Nguy cao Tổng lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu lm ul Hình 3.6 Biểu đồ phân bố types HPV z at nh oi Kết bảng 3.1 hình 3.6 cho thấy có tất types HPV đƣợc xác định số phụ nữ có kết xét nghiệm HPV-DNA dƣơng tính Trong nhóm type nguy thấp chiếm đa số 30/47 mẫu (63,83%) gồm ba type 6, 11 81 lƣợt lƣợt chiếm z gm @ tỷ lệ 25,53%, 23,4% 14,89% Nhóm type nguy thấp có 17/47 mẫu (36,17%) gồm hai types thƣờng gặp type 16 18 với tỷ lệ tƣơng ứng 19,15% 17,02% l Nghiên cứu Võ Huỳnh Kha Huỳnh Quyết Thắng (2011) đối co m tƣợng phụ nữ ung thƣ cổ tử cung Bệnh viện ung bƣớu Cần Thơ cho thấy tỷ lệ an Lu nhiễm HPV 92,9%, xác định đƣợc types HPV thuộc nhóm nguy cao n va ac th si 38 đối tƣợng nghiên cứu, hay gặp type 16, 18 58, khơng có type virus nguy thấp đƣợc phát đối tƣợng đƣợc nghiên cứu [13] Trong nghiên cứu phát đƣợc types HPV tỷ lệ nhiễm type virus có khác biệt Điều đƣợc giải thích nghiên cứu chúng tơi đƣợc tiến hành khoảng thời gian ngắn (khoảng 10 tháng) với số lƣợng mẫu bệnh phẩm thu thập cho xét nghiệm cịn nên số type HPV đƣợc phát Do đối tƣợng đƣợc lấy mẫu xét nghiệm phụ nữ đến khám sản phụ khoa khu vực nghiên cứu có khác nên tỷ lệ nhiễm types HPV nhóm đối tƣợng nghiên cứu có khác biệt lu 3.2.3 Sự đồng nhiễm type HPV an n va Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm đơn đồng nhiễm types HPV Số lƣợng Tỷ lệ % Nhiễm type 36 76,6 Nhiễm type 11 23,4 Nhiễm ≥ type 0,0 Tổng 47 100 p ie gh tn to Kiểu nhiễm HPV d oa nl w an lu Kết bảng 3.2 cho thấy đa số trƣờng hợp nhiễm HPV đơn nf va type (76,6%), có 23,4% đồng nhiễm types virus Khơng có trƣờng hợp đồng nhiễm từ types HPV trở lên lm ul Bảng 3.3 Tỷ lệ đồng nhiễm types HPV Các type HPV Tỷ lệ % 18,18 6-81 11-81 gm Nguy cao-thấp 16-6 9,09 Nguy cao-cao 0 0,0 11 100 theo nhóm 45,45 90,91 27,7 l 9,09 m co an Lu Tổng Tỷ lệ % đồng nhiễm @ Nguy thấp-thấp Số lƣợng z 6-11 z at nh oi Đồng nhiễm 100 n va ac th si 39 lu an n va to Hình 3.7 Tỷ lệ đồng nhiễm type HPV gh tn Kết bảng 3.3 hình 3.7 cho thấy có đồng nhiễm types HPV p ie nhóm nguy thấp (6 11, 81 11 81) kiểu đồng nhiễm chiếm chủ yếu kiểu đồng nhiễm types virus (90,91%) Chỉ có nl w trƣờng hợp có kiểu đồng nhiễm nhóm quy thấp nhóm nguy cao (9,09%) d oa Trong bốn kiểu đồng nhiễm kiểu nhiễm phối hợp type 6-81 chiếm đa số an lu (45,45%) Không thấy xuất kiểu nhiễm phối hợp từ types HPV trở lên Qua nf va kết nghiên cứu thu đƣợc cho thấy tƣợng nhiễm HPV phụ nữ không nhiễm đơn type virus mà thực tế nhiễm phối hợp types virus, không lm ul đồng nhiễm types HPV nhóm nguy thấp mà cịn có đồng nhiễm z at nh oi type virus giữ nhóm nguy thấp cao Điều cho thấy tầm quan trọng việc không cần xét nghiệm sàng lọc tình trạng nhiễm HPV mà cịn phải xác định z đƣợc type HPV để dự phịng, kiểm soát nhiễm virus theo dõi tiến m co l tử cung gm @ triển tổn thƣơng ác tính tế bào biểu mơ cổ tử cung tầm soát ung thƣ cổ an Lu n va ac th si 40 Hình 3.8 Kết màng lai với nhóm HPV nguy thấp (type 6, 11 81) lu an n va p ie gh tn to Hình 3.9 Kết màng lai với nhóm HPV nguy cao (type 16 18) d oa nl w nf va an lu lm ul z at nh oi Hình 3.10 Kết màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy thấp-thấp z m co l gm @ an Lu Hình 3.11 Kết màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cao-thấp n va ac th si 41 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN Phát HPV phụ nữ kỹ thuật Realtime-PCR 47/166 phụ nữ (chiếm 28,31%) nhiễm HPV (HPV-DNA dƣơng tính) Xác định genotype HPV kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot Trong tổng số 47 trƣờng hợp nhiễm HPV, kết xác định type virus cho thấy: - Có 63,83% trƣờng hợp nhiễm HPV nhóm nguy thấp 36,17% trƣờng hợp nhiễm HPV nhóm nguy cao - Ba types HPV nhóm nguy thấp type (25,53%), type 11 (23,4%) lu type 81 (14,89%) types HPV nhóm nguy cao type 16 (19,15%) type 18 an - Tỷ lệ nhiễm HPV đơn (nhiễm type) 76,6% đồng nhiễm n va (17,02%) đƣợc xác định - Kiểu đồng nhiễm HPV nhóm nguy thấp-thấp gồm: 6-11, 6-81 11-81 ie gh tn to (nhiễm types) 23,4% p - Kiểu đồng nhiễm HPV nhóm nguy cao-thấp 16-6 nl w - Không phát đƣợc đồng nhiễm type HPV nhóm nguy cao d oa - Khơng phát đƣợc trƣờng hợp đồng nhiễm từ types HPV trở lên nf va an lu KHUYẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thêm phân bố type HPV khác cộng đồng lm ul - Với trƣờng hợp nhiễm types HPV nhóm nguy cao cần tiến z at nh oi hành xét nghiệm PAP’smear xác định hình thái tế bào biểu mơ cổ tử cung nhằm tầm soát, phát trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung góp phần dự phịng điều trị bệnh sớm z m co l gm @ an Lu n va ac th si 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Ngọc Dung (2004), “Khảo sát liên quan mẹ nhiễm HPV bệnh u nhú quản”, Thời Y Dược học, Tháng 8/2004, tr.199-201 Nguyễn Hoàng Chƣơng, Nguyễn Chấn Hùng, Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng & cs (2005), “Xây dựng quy trình PCR phát Human Papillomavirus (HPV) dịch phết tế bào âm đạo”, Tạp chí Y học Tp HCM Tập 9, số 1, tr 49-53 Trịnh Quang Diện & cs (1999), “Phát sớm tổn thƣơng biểu mô lu ung thƣ cổ tử cung phƣơng pháp tế bào học”, Tạp chí Y học thực hành, an phát sớm ung thƣ cổ tử cung cộng đồng”, Thông tin Y Dược to Nguyễn Ngọc Hiếu & Trần Trọng Kính (1995), “Phát sớm ung thƣ cổ tử học, Tháng 11/1995, tr.23-27 p ie gh Nguyễn Bá Đức & cs (1995), “Nghiên cứu biện pháp phòng ngừa n tn va số 11, tr 69-71 Nguyễn Trọng Hiếu (2004), “Tần suất nhiễm HPV phụ nữ TP HCM”, Thời d oa nl w cung bệnh viện Phụ Sản Hà Nội”, Tạp chí Y học thực hành, số 11, tr 74-75 Nguyễn Trọng Hiếu (2004), “Tần suất nhiễm HPV phụ nữ TP HCM Hà nf va an lu Y Dược học, Bộ IX số 4, Tháng 8/2004, tr.195-198 Nội”, Tạp Chí Phụ sản, Số 1-2, tập 4, Tháng 6/2004, tr.64-72 lm ul Nguyễn Thị Nhƣ Ngọc & cs (2002), “Nhận định tình hình tỉ lệ nhiễm HPV Chí Minh, số 4, tr.382-386 z at nh oi qua phết tế bào âm đạo bệnh viện Hùng Vƣơng”, Tạp chí Y Học TP.Hồ Vũ Thị Nhung (2004), “Nhận xét bƣớc đầu liên quan type HPV z gm @ tổn thƣơng tiền ung thƣ, ung thƣ cổ tử cung Bệnh viện Hùng Vƣơng”, Nội san Sản Phụ Khoa Số Đặc biệt Bình Dương 14-15/7/2004, m co l tr.170-175 an Lu n va ac th si 43 Vũ Thị Nhung & cs (2006), “Khảo sát tình hình nhiễm types HPV 10 (Human papillomavirus) phụ nữ Thành Phố Hồ Chí Minh kỹ thuật sinh học phân tử” Đề tài Sở Khoa học Công Nghệ Tp.HCM Thái Kế Quân & cs (2004), “Xây dựng quy trình phát HPV (Human 11 papillomavirus) phục vụ nghiên cứu chẩn đốn”, Chương trình vườn ươm sang tạo Khoa học Kỹ thuật trẻ, Sở Khoa học Cơng Nghệ Tp.HCM Phạm Việt Thanh (2006), “Chƣơng trình tầm soát Human Papilloma Virus 12 (HPV) ung thƣ cổ tử cung”, Tạp chí Y học thực hành, số 550, tr.13-24 Võ Văn Kha, Huỳnh Quyết Thắng (2011), “Tỷ lệ nhiễm HPV bệnh nhân 13 lu ung thƣ cổ tử cung Bệnh viện ung bƣớu Cần Thơ”, Tạp chí Y học T.P Hồ an n va Chí Minh, tập 15, số 2, tr.168-173 14 Baay, M.F.D., Quint, W.G.V., Koudstaal, J., Hollema, H., Duk, J.M., Burger, gh M.P.M., Stolz, E., & Herbrink, P (1996), “Comprehensive study of several tn to TÀI LIỆU TIẾNG ANH p ie genral and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus nl w DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas” J Clin Microbiol Bauer HM, Ting Y, Greer CE, Chambers JC, Tashiro CJ, Chimera J, an lu 15 d oa 34:745-747 nf va Reingold A, Manos MM JAMA.(1991), “Genital human papillomavirus infection in female university students as determined by a PCR-based lm ul method” Jan 23;265(4):472–477 Gravitt, P.E., Peyton, C.L., Apple, R.J., & Wheeler, C.M (1998), z at nh oi 16 “Genotyping of 27 human papillomavirus types by using L1 consensus PCR products by a single-hybridization, reverse line blot detection method” J z gm 17 @ Clin Microbiol 36:3020-3027 Hart, K.W., Williams, O.M., Thelwell, N., Fiander, A.N., Brown, T., l co Borysiewicz, L.K., & Gelder, C.M (2001), “Novel method for detection, m typing, and quantification of human papillomaviruses in clinical samples” J an Lu Clin Microbiol 39:3204-3212 n va ac th si 44 18 Harwood CA, Spink PJ, Surentheran T, Leigh IM, de Villiers EM, McGregor JM, Proby CM, Breuer J (1999), “Degenrate and nested PCR: a highly sensitive and specific method for detection of human papillomavirus infection in cutaneous warts” J Clin Microbiol 1999 Nov;37(11):3545-55 19 IARC HPV prevalence Surveys, 1993-2004 20 Jacobs, M.V., Snijders, P.J.F., Van den Brule, A.J.C., Helmerhorst, T.J.M., Meijer, C.J.L.M & Walboomers, J.M.M (1997), “A genral primer GP5+/GP6+- mediated PCR-enzyme immunoassay method for rapid detection of 14 high-risk and low-risk human papillomavirus genotypes in lu an cervical scrapings” J Clin Microbiol 35:791-795 John Doorbar (2005), “The papillomavirus life cycle” Journal of Clinical n va 21 22 Josko Zekan, Maja Sirotkovic-Skerlev and Mihael Skerlev Oncogenic Aspects of gh HPV Infections of the Female Genital Tract In: Herve Seligmann, ed (2011), tn to Virology 32S (2005) S7-S15 p ie “DNA replication-current advances” ISBN 978-953-307-593-8 Karl M, Amy B, Kirsten ME et al Journal of Virology (2004), “Mechanism of nl w 23 Karlsen, F., Kalantari, M., Jenkins, A., Pettersen, E., Kristensen G., Holm, R., an lu 24 d oa human papillomavirus-induced oncogensis” 78(21):11451-11460 nf va Johansson, B., & Hagmar, B (1996), ”Use of multiple PCR primer sets for optimal detection of Human Papillomavirus” J Clin Microbiol 34:2095-2100 lm ul 25 Lee HP, Seo SS (2002), “The application of human papillomavirus testing to 26 z at nh oi cervical cancer screening” Yonsei Med I; 43(6): 763-768 Nelson, J.H., Hawkins, G.A., Edlund, K., Evander, M., Kjellberg, L., Wadell, G., Dillner, J., Gerasimova, T., Coker, A.L., Pirisi, L., Petereit, D., & z gm @ Lambert, P.F (2000), “A novel and rapid PCR-based method for genotyping human papillomaviruses in clinical samples” J Clin Microbiol 38:688-695 l Peitsaro, P., Johansson, B., & Syrjanen, S (2002), “Integrated human co 27 m papillomavirus type 16 is frequently found in cervical cancer precursors as an Lu n va ac th si 45 demonstrated by a novel quantitative real-time PCR technique” J Clin Microbiol 40:886-891 28 Pham THA, Nguyen TH, Herrero R, Vaccarella S, Smith JS, Nguyen Thuy TT, Nguyen HN, Nguyen BD, Ashley R, Snijders PJ, Meijer CJ, Munoz N, Parkin DM, Franceschi S, (2003), “Human papillomavirus infection among women in South and North Vietnam” International Journal of Cancer 104: 213-220 29 Peyton, C.L., Schiffman, M., Lorincz, A.T., Hunt, W.C., Mielzynska, I., Bratti, C., Eaton, S., Hildesheim, A., Morera, L.A., Rodriguez, A.C., Herrero, R., Sherman, M.E & Wheeler, C.M (1998), “Comparison of PCR-and lu Hybrid capturebased human papillomavirus detection systems using multiple an cervical specimen collection strategies” J Clin Microbiol 36:3248-3254 va 30 Qu, W., Jiang, G., Cruz, Y., Chang, C.J., Ho, G.Y.F., Klein, R.S., & Burk, R.D n tn to (1997), “PCR detection of Human Papillomavirus : Comparision between GP5+/GP6+ primer system” J Clin Microbiol 35:1304-1310 S de Sanjosé, M Diaz, X Castellsagué, G Clifford, L Bruni, N Muñoz, and F 31 and p ie gh MY09/MY11 nl w X Bosch Jul (2007), “Worldwide prevalence and genotype distribution of d oa cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a lu meta-analysis”.The Lancet infectious diseases, vol 7, no 7, pp 453- 459 Silvia DS, Wim GVQ, Laia A et al (2010), “Huaman papillomavirus genotype nf va an 32 attribution in invasive cervical cancer: a retrospective lm ul cross-sectional worldwide study” Lancet Oncol 2010; 11:1048-1056 Van den Brule, A.J.C., Pol, R., Fransen-Daalmeijer, N., Schouls, L.M., z at nh oi 33 Meijer, C.J.L.M & Snijders, P.J.F (2002), “GP5+/6+ PCR followed by reverse line blot analysis enables rapid and high-throughput identification of z human papillomavirus genotypes” J Clin Microbiol 40:779-787 @ Vernon, S.D., Unger, E.R., & Williams, D (2000), “Comparison of human gm 34 hybrid capture” J Clin Microbiol 38:651-655 m co l papillomaviruses detection and typing by cycle sequencing, line blotting, anf an Lu n va ac th si 46 Ylitalo, N., Bergstrom, T., & Gyllensten, U (1995), “Detection of genital 35 human papillomavirus by single-tube nested PCR and type-specific oligonucleotide hybridization” J Clin Microbiol 33:1822-1828 Zur Hausen, H (1996), “Papillomavirus infections – a major cause of human 36 cancers” Biochimica et Biophysica acta 1228 F55-F78 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si