Phân lập và định danh vi khuẩn bacillus mycoides trong đất trồng bắp cải tại một số huyện trên địa bàn thành phố hà nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BACILLUS MYCOIDES TRONG ĐẤT TRỒNG BẮP CẢI TẠI MỘT SỐ HUYỆN TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HÀ NỘI HÀ NỘI - 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BACILLUS MYCOIDES TRONG ĐẤT TRỒNG BẮP CẢI TẠI MỘT SỐ HUYỆN TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HÀ NỘI Sinh viên thực : NGUYỄN ĐÌNH TỒN Khóa : 63 Ngành : Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS TRẦN THỊ BÌNH NGUYÊN HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, Các số liệu mà tơi thu thập q trình thực tập trực dõi, ghi chép thu thập Các số liệu thu thập trung thực, khách quan chưa công bố báo cáo trước Các trích dẫn báo cáo có nguồn gốc cụ thể rõ ràng, xác Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên NGUYỄN ĐÌNH TỒN i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy cô cán làm việc Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, nơi tơi trực tiếp thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ vi sinh, Công nghệ sinh học Thực vật, Sinh học phân tử & Công nghệ sinh học ứng dụng nhiệt tính giúp đỡ, hỗ trợ máy móc trang thiết bị giúp tơi hồn thành thí nghiệm đề tài T xin chân thảnh cảm ơn thầy cô giáo, cán bộ, toàn thể ban chủ nhiệm khoa Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam giảng dạy tạo điều kiện cho q trình học tập thực khố luận khoa Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Bình Ngun – Trưởng mơn Cơng nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học người tận tình giúp đỡ, bảo trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Cối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè giúp đỡ, động viên suốt q trình thực tập khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên NGUYỄN ĐÌNH TỒN ii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Chi Bacillus 2.1.1 Hình thái Bacillus 2.1.2 Chức Bacillus 2.2 Vi khuẩn Bacillus mycoides 2.2.1 Lịch sử phân loại Bacillus mycoides 2.2.2 Phân bố Bacillus mycoides 2.2.3 Hình thái học Bacillus mycoides 2.2.4 Tác động có lợi Bacillus mycoides với trồng 10 2.3 Các phương pháp định danh vi khuẩn 11 2.3.1 Phương pháp truyền thống 11 2.3.1.1 Sử dụng khóa phân loại 12 2.3.1.2 Sử dụng phương pháp số học 12 2.3.2 Phương pháp đại 12 2.3.2.1 Sử dụng mẫu dò kết hợp với phương pháp in-situ phát huỳnh quang (Flourescence in-siu Hybridazation – FISH) 13 2.3.2.2 Phương pháp lai nucleic acid 14 2.3.2.3 Định danh phương pháp 16S rRNA 15 2.4 Một số nghiên cứu phân lập định danh Bacillus mycoides 19 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn iii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị 22 3.1.3 Hóa chất 22 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 23 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 3.2.1 Địa điểm thực 23 3.2.2 Thời gian thực hiên 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 23 3.3.2 Phương pháp làm 24 3.3.3 Phương pháp nuôi lỏng 24 3.3.4 Phương pháp giữ giống 25 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 25 3.3.5.1 Định danh phương pháp truyền thống 25 3.3.5.2 Định danh phương pháp 16S rRNA 25 3.3.6 Phương pháp tách chiết DNA 26 3.3.7 Phương pháp PCR 27 3.3.8 Phương pháp điện di 28 3.3.9 Giải trình tự 29 3.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 29 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Phân lập vi khuẩn từ đất trồng nông nghiệp 30 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn 30 4.1.2 Tạo dòng 31 4.2 Kết định danh vi khuẩn Bacillus mycoides 16S rRNA 32 4.2.1 Thu dịch nuôi khuẩn lạc 32 4.2.2 Kết chạy điện di phản ứng PCR 33 4.2.3 Kết giải trình tự xử lý số liệu 34 4.2.4 Kết phân tích phả hệ 40 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn iv C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Hình thái Bacillus kính hiển vi Hình 2.2 Khuẩn lạc B mycoides DX SIN Hình 2.3 Khuẩn lạc B mycoides SINett Hình 2.4 Bacillus mycoides phát triển môi trưởng lỏng Hình 2.5 Vi khuẩn Bacillus mycoides kính hiển vi điện tử Hình 2.6 Cấu trúc thứ cấp 16S rRNA 16 Hình 2.7 Cấu trúc thứ cấp 16S rRNA 16 Hình 2.8 Tốn tử rRNA 17 Hình 4.1 Đĩa thạch chứa khuẩn lạc Bacillus mycoides 30 Hình 4.2 Đĩa thạch khơng chứa khuẩn lạc Bacillus mycoides 30 Hình 4.3 Hình dạng khuẩn lạc Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải môi trường LB-agar 31 Hình 4.4 Các chủng Bacillus mycoides môi trường LB – lỏng 32 Hình 4.5 Điện di DNA tổng số 33 Hình 4.6 Sản phẩm điện di phản ứng PCR gen 16S rRNA 34 Hình 4.7 Kết giải trình tự gen 36 Hình 4.8 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotidecủa Mau với chủng tương đồng Genbank 37 Hình 4.9 Xử lý trình tự gen 16S rRNA Mau với trình tự 16s rRNA thuộc nhóm Bacillus cereus 40 Hình 4.10 Cây di truyền phả hệ thể vị trí phân loại chủng Bacillus mycoides BC 01 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn v C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Môi trường sử dụng nghiên cứu 2323 Bảng 3.2 Số lượng nguồn gốc mẫu 24 Bảng 3.3 Mồi đặc hiệu loài sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 3.4 Chu kì nhiệt phản ứng PCR 27 Bảng 4.1 Kết đo quang phổ DNA tổng số 33 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn vi C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa từ A Adenine Nucleotide APX Ascorbate peroxidase B mycoides Bacillus mycoides BC Bắp cải bp Base pair - Cặp bazơ C Cytosine Nucleotide CDS Trình tự mã hóa giả định cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym Fol Fusarium oxysporum f sp lycopersici F Forward primer – Môi xuôi FISH Flourescence in-siu Hybridazation - in-situ phát huỳnh quang G Guanine Nucleotide GPX Guaiacol peroxidase LB Luria Bertani MALDI-TOF MS Matrix assisted laser desorption ionization - time of flight MLEE Điện di enzyme đa điểm NAAT Kỹ thuật khuếch đại axit nucleic OD Optical density – Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase PAL Phenylalanine amoniac-lyase sp species - loài vii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an spp species pluriel - nhiều loài T Thymine Nucleotide TP Thành phố TAE Tris-acetate-EDTA Ta Annealing temperature - Nhiệt độ gắn mồi R Reverse primer – Mồi ngược RFLP Restristion Fragment Length Polymorphisms - Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn rRNA Ribosomal ribonucleic acid UV Ultraviolet - Tia tử ngoại 16s rRNA 16S ribosomal RNA viii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an hạn 1,8 – 2,0 chứng tỏ DNA tách chiết tinh sạch, nồng độ DNA mẫu đảm bảo chất lượng để phục vụ thí nghiệm M: ADN ladder 100 bp (Thermo) 1: Sản phẩm PCR có kích thước 1500kp Mau (Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh) Hình 4.6 Sản phẩm điện di phản ứng PCR gen 16S rRNA Kết điện di sản phẩm PCR cho băng vạch rõ nét với kích thước khoảng 1500 bp Kết điện di sản phẩm PCR thu phù hợp với kích thước phân tử theo lý thuyết 4.2.3 Kết giải trình tự xử lý số liệu Trình tự chuỗi nucleotide 16S rRNA Mẫu (Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh) giải trình tự Các giãn đồ giải trình tự (chromatogram) mở chương trình BioEdit để xác định nucleotide Kết cho thấy pick rõ nét, có tín hiệu đọc tốt (hình 4.7) 34 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 35 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.7 Kết giải trình tự gen Chuỗi thơ nucleotide trích xuất từ BioEdit so sánh với chuỗi gen 16S rRNA có Ngân hàng gen Sử dụng phần mền BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để xác định mức độ tương đồng trình tự nucleotide 16S rRNA Mẫu (Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh) với trình tự Genbank 36 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.8 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotidecủa Mau với chủng tương đồng Genbank Trình tự nucleotide 16S rRNA chủng Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh có độ tương đồng nucleotide đạt 99,32 % với trình tự nucleotide 16S rRNA số chủng Bacillus mycoides Bacillus mycoides S20704 số tham chiếu KF956602.1; Bacillus mycoides Bacillus mycoides Y-2 số tham chiếu KF483222.1; Bacillus mycoides EKE04 số tham chiếu MT994645.1; Bacillus mycoides Y7 số tham chiếu MH224388.1; Bacillus mycoides L2S8 số tham chiếu EU221418.1; Bacillus mycoides số tham chiếu L2S5 EU221416.1 Do Bacillus mycoides vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus nên chúng có điểm tương đồng mặt di truyền Nên tiến hành so sánh trình tự nucleotide Mẫu Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh với số mẫu vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus (trong có số chủng Bacillus mycoides biết ngân hàng gen) 37 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự nucleotide Mẫu Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh với số mẫu vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus (hình 4.9), kết cho thấy có sai khác nucleotide số vị trí ví dụ nucleotide vị trí 3, 15, 55, 144,…; thay C-T vị trí 8, 13, 155,…; thay G-A vị trí 17, 44, 56, 120,… 38 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 39 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.9 Xử lý trình tự gen 16S rRNA Mau với trình tự 16s rRNA thuộc nhóm Bacillus cereus Chú thích: Mau - Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh 4.2.3 Kết phân tích phả hệ Sử dụng 1355 nucleotide vùng 16S rRNA, xây dựng di truyền phả hệ theo phương pháp Neighbor-joining sử dụng MEGAX với giá trị bootstrap 1.000 lần lặp lại (hình 4.10) Trình tự gen 16S rRNA Mau Bacillus mycoides BC 01 so sánh với 29 trình tự nucleotide (7 trình tự vi khuẩn Bacillus mycoides, trình tự Bacillus antharac, trình tự Bacillus thuringiensis, trình tự Bacillus weihenstephanen, trình tự Bacillus pseudomycoides, trình tự Bacillus licheniformis, trình tự Bacillus subtilis, trình tự Bacillus clausii, trình tự Bacillus coagulans, trình tự Alkalihalobacillus clausii) có sẵn Genbank lập di truyền phả hệ Hình 4.10 di truyền phả hệ thể vị trí phân loại chủng Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh (Mau Bacillus mycoides BC 01) với chủng thuộc nhóm Bacillus cereus Kết cho thấy rằng, vi khuẩn B mycoides (Mau Bacillus mycoides BC 01) nằm nhánh với chủng B mycoides có Genbank 40 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.10 Cây di truyền phả hệ thể vị trí phân loại chủng Bacillus mycoides BC 01 Từ đánh giá hình dạng vi khuẩn vi khuẩn kết hợp với đánh giá trình tự nucleotide 16S rRNA, kết khẳng định mẫu phân lập thuộc vi khuẩn Bacillus mycoides 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập chủng Bacillus mycoides từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh, Đông Anh, Gia Lâm Ứng Hịa Kết giải trình tự so sánh mức độ tương đồng chủng Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh cho thấy, chủng có độ tương đồng nucleotide đạt 99,32% với trình tự nucleotide 16S rRNA nằm nhánh di truyền phả hệ vơi chủng Bacillus mycoides khác Genbank Định danh chủng Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng bắp cải huyện Mê Linh hình thái đặc trưng 16S rRNA 5.2 Kiến nghị Sử dụng kết nghiên cứu làm tiền cho nghiên cứu sâu sử dụng vi khuẩn Bacillus mycoides sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp trồng trọt, tăng suất, chất lượng trồng 42 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Kiều Phương Nam (2005) Phân lập, định danh khảo sát tác động vi khuẩn Methylobacterium sp lên phát sinh lồi hình thái thực vật Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhuên, DHQG TP Hồ Chí Minh Trần Linh Thước (2002) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất Giáo Dục 43-100 Trần Linh Thước (2002) Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất ĐHQG TP Hồ Chí Minh 418-462 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Ali, B., Wang, X., Saleem, M H., Azeem, M A., Afridi, M S., Nadeem, M., Ghazal, M., Batool, T., Qayyum, A., Alatawi, A., & Ali, S (2022) Bacillus mycoides PM35 Reinforces Photosynthetic Efficiency, Antioxidant Defense, Expression of Stress-Responsive Genes, and Ameliorates the Effects of Salinity Stress in Maize Life (Basel, Switzerland), 12(2), 219 https://doi.org/10.3390/life12020219 Ambrosini, A., Sant'Anna, F H., de Souza, R., Tadra-Sfeir, M., Faoro, H., Alvarenga, S M., Pedrosa, F O., Souza, E M., & Passaglia, L M (2015) Genome Sequence of Bacillus mycoides B38V, a Growth-Promoting Bacterium of Sunflower Genome announcements, 3(2), e00245-15 https://doi.org/10.1128/genomeA.00245-15 Bargabus R, Zidack N, Sherwood J, Jacobsen B 2002 Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, 43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent Physiol Mol Plant P61:289–298 Bell, J A., & Friedman, S B (1994) Genetic Structure And Diversity Within Local Populations Of Bacillus Mycoides Evolution; international journal of organic evolution, 48(5), 1698–1714 https://doi.org/10.1111/j.1558-5646.1994.tb02206.x Cochran, C., & Masuda, H (2016) Switching of the rotational direction of rhizoidal colonies in a newly isolated Bacillus mycoides strain Ko01 The Journal of general and applied microbiology, 62(2), 47–51 https://doi.org/10.2323/jgam.62.47 Cutting S M (2011) Bacillus probiotics Food microbiology, 28(2), 214– 220 https://doi.org/10.1016/j.fm.2010.03.007 10 Di Franco, C., Beccari, E., Santini, T., Pisaneschi, G., & Tecce, G (2002) Colony shape as a genetic trait in the pattern-forming Bacillus mycoides BMC microbiology, 2, 33 https://doi.org/10.1186/1471-21802-33 11 Fravel DR, Spurr H, Harvey J 1977 Biocontrol of tobacco brown-spot disease by Bacillus cereus subsp mycoides in a controlled environment Phytopathology 77:930–932 doi: 10.1094/Phyto-67-930 12 Gottheil, O., 1901, Centralb f Bakt., etc., II Abt., 7, 589-591 and 627-633 13 Guerrero-Barajas, C., Constantino-Salinas, E A., Amora-Lazcano, E., Tlalapango-Ángeles, D., Mendoza-Figueroa, J S., Cruz-Maya, J A., & Jan-Roblero, J (2020) Bacillus mycoides A1 and Bacillus tequilensis A3 inhibit the growth of a member of the phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides species complex in avocado Journal of the science of food and agriculture, 100(10), 4049–4056 https://doi.org/10.1002/jsfa.10450 14 Haan, T., McDougall, S., & Drown, D M (2019) Complete Genome Sequence of Bacillus mycoides TH26, Isolated from a Permafrost Thaw 44 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Gradient Microbiology resource announcements, 8(24), e00507-19 https://doi.org/10.1128/MRA.00507-19 15 Heidt, J., Papaloukas, N., & Timmerman, C P (2019) A rare bloodstream infection: Bacillus mycoides Neth J Med, 77(6), 227 16 Holzmüller, K.,1909, Centralb f Bakt., etc., II Abt., 23, 304-354 17 Hassan, T U., Bano, A., Naz, I., & Hussain, M (2018) Bacillus cereus: A competent plant growth promoting bacterium of saline sodic field Pak J Bot, 50(3), 1029-1037 18 Kimura , K., & Yokoyama , S (2019) Trends in the application of Bacillus in fermented foods Current opinion in biotechnology, 56, 36-42 https://doi.org/10.1016/j.copbio.2018.09.001 19 Kurniawan, A., & Chuang, H W (2022) Rhizobacterial Bacillus mycoides functions in stimulating the antioxidant defence system and multiple phytohormone signalling pathways to regulate plant growth and stress tolerance Journal of applied microbiology, 132(2), 1260–1274 https://doi.org/10.1111/jam.15252 20 Lawyer F C., Stoffel S., Saiki R K., Myambo K., Drummond R & Gelfand D H (1989) Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus J Biol Chem 264(11): 6427-37 21 Logan, N.A and Vos, P.D (2015) Bacillus In Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (eds M.E Trujillo, S Dedysh, P DeVos, B Hedlund, P Kämpfer, F.A Rainey and W.B Whitman) https://doi.org/10.1002/9781118960608.gbm00530 22 Mullis K B (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction Scientific American 262(4): 56-61, 64-5 23 Neher OT, Johnston MR, Zidack NK, Jacobsen BJ 2009 Evaluation of Bacillus mycoides isolate BmJ and B mojavensis isolate 203-7 for the 45 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an control of anthracnose of cucurbits caused by Glomerella cingulata var orbiculare Biol Contr 48:140–146 doi: 10.1016/j.biocontrol.2008.08.012 24 Nicholson, W.L (2002) Roles of Bacillus endospores in the environment Cellular and molecular life sciences: CMLS 59, 410-416 25 Nyberg, C., 1927, Soc Scint Fenn Biol 3, 26 Oesterle, P., and Stahl, C A., 1930, Centralb f Bakt., etc., II Abt., 79,125 27 Pelt-Verkuil Elizabeth van, Belkum Alex van & Hays John P (2008) Principles and technical aspects of PCR amplification 28 Pringsheim, E G., 1924, Centralb f Bakt., etc., II Abt., 61, 225-246 29 Pinos D., Chakroun M., Millán-Leiva A., Jurat-Fuentes J.L., Wright D.J., Hernández-Martínez P., Ferré J (2020) Reduced membrane-bound alkaline phosphatase does not affect binding of Vip3Aa in a Heliothis virescens resistant colony Toxins 12:409 doi: 10.3390/toxins12060409 30 Turchi, L., Santini, T., Beccari, E., & Di Franco, C (2012) Localization of new peptidoglycan at poles in Bacillus mycoides, a member of the Bacillus cereus group Archives of microbiology, 194(10), 887–892 https://doi.org/10.1007/s00203-012-0830-1 31 Valtierra-de-Luis D., Villanueva M., Lai L., Williams T., Caballero P (2020) Potential of Cry10Aa and Cyt2Ba, Two minority δ-endotoxins produced by Bacillus thuringiensis ser israelensis, for the control of Aedes aegypti larvae Toxins 12:355 doi: 10.3390/toxins12060355 32 Rajalakshmi, B S., Fathima, A A S., Jasmine, B S., Vasanthy, M., Selvi, C T., Rajagopal, R., Khan, R., Hatamleh, A A., Alnafisi, B K., Gatasheh, M K., Chang, S W., & Ravindran, B (2022) Pollutant removal from cheese processing effluent using effective indigenous natural scavengers Environmental monitoring and assessment, https://doi.org/10.1007/s10661-022-10535-5 46 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 195(1), 12 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 33 Wang, G F., Meng, J F., Tian, T., Xiao, X Q., Zhang, B., & Xiao, Y N (2020) Endophytic Bacillus velezensis strain B-36 is a potential biocontrol agent against lotus rot caused by Fusarium oxysporum Journal of applied microbiology, 128(4), 1153–1162 https://doi.org/10.1111/jam.14542 34 Weisburg, W G., Barns, S M., Pelletier, D A & Lane, D J 1991 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study Journal of bacteriology, 173, 697-703 35 Wu, J J., Huang, J W., & Deng, W L (2020) Phenylacetic Acid and Methylphenyl Acetate From the Biocontrol Bacterium Bacillus mycoides BM02 Suppress Spore Germination in Fusarium oxysporum f sp lycopersici Frontiers in microbiology, 11, 569263 https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.569263 36 Wemheuer, F., Hollensteiner, J., Poehlein, A., Liesegang, H., Daniel, R., & Wemheuer, B (2018) Draft Genome Sequence of the Endophyte Bacillus mycoides Strain GM6LP Isolated from Lolium perenne Genome announcements, 6(5), e00011-18 https://doi.org/10.1128/genomeA.00011-18 37 Yi, Y., de Jong, A., Spoelder, J., Elzenga, J T., van Elsas, J D., & Kuipers, O P (2016) Draft Genome Sequence of Bacillus mycoides M2E15, a Strain Isolated from the Endosphere of Potato Genome announcements, 4(1), e00031-16 https://doi.org/10.1128/genomeA.00031-16 38 Zhang J., Jin M., Yang Y., Liu L., Yang Y., Gómez I., Bravo A., Soberón M., Xiao Y., Liu K (2020) The cadherin protein is not involved in susceptibility to Bacillus thuringiensis Cry1Ab or Cry1Fa toxins in Spodoptera frugiperda Toxins 12:375 doi: 10.3390/toxins12060375 39 Hou X., Han L., An B., Zhang Y., Cao Z., Zhan Y., Cai X., Yan B., Cai J (2020) Mitochondria and lysosomes participate in Vip3Aa-induced Spodoptera frugiperda Sf9 cell apoptosis Toxins 12:116 doi: 10.3390/toxins12020116 47 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn