(Luận văn) phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn urô (eucalyptus urophylla) chuyển gen gsi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HUYỀN lu an n va ie gh tn to PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DỊNG p BẠCH ĐÀN URƠ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1 d oa nl w ll u nf va an lu m oi LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC z at nh z m co l gm @ an Lu n va Hà Nội - 2017 ac th si BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HUYỀN lu an n va PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DỊNG p ie gh tn to BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1 d oa nl w Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 u nf va an lu ll LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC oi m z at nh z NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BÙI VĂN THẮNG m co l gm @ an Lu Hà Nội - 2017 n va ac th si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Đây cơng trình nghiên cứu tơi cộng tác với cộng khác; - Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; lu an - Phần kết lại luận văn chưa công bố n va cơng trình khác to gh tn Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017 p ie Học viên d oa nl w ll u nf va an lu Nguyễn Thị Huyền oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Bùi Văn Thắng, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh công nghệ chuyển gen” người thầy tận tình hướng dẫn, hỗ trợ kinh phí điều kiện cần thiết khác để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Việt, Chủ nhiệm Bộ mơn lu Cơng nghệ tế bào tồn thể cán thuộc Bộ môn tạo điều kiện an n va thuận lợi để học tập, thực hoàn thành đề tài luận văn tn to Trong q trình làm luận văn, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình gh tồn thể cán Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm p ie nghiệp Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu nl w Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp d an lu văn oa động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực thành công luận u nf va Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017 ll Học viên oi m z at nh z m co l gm @ Nguyễn Thị Huyền an Lu n va ac th si iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BÀNG vii lu DANH MỤC CÁC HÌNH viii an DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN x n va MỞ ĐẦU to tn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU ie gh 1.1 Tổng quan Bạch đàn nói chung Bạch đàn Urơ nói riêng p 1.2 Một số nghiên cứu chuyển gen vào Bạch đàn nl w 1.3 Gen GS1 kết nghiên cứu chuyển gen GS1 vào trồng 10 d oa 1.4 Vector chuyển gen GS1 vào bạch đàn Urô 15 an lu 1.5 Các phương pháp phân tích đánh giá chuyển gen phịng thí nghiệm va đồng ruộng 18 ll u nf 1.5.1 Đánh giá chọn lọc chuyển gen in vitro in vivo 18 oi m 1.5.2 Phân tích chuyển kỹ thuật sinh học phân tử 19 z at nh 1.5.3 Phân tích chức sinh học gen chuyển 23 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 z @ 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 l gm 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.2.1 Phân tích, xác định dịng chuyển gen 25 m co 2.2.2 Đánh giá sinh trưởng dòng chuyển gen giai đoạn nhà lưới 25 an Lu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 n va 2.3.1 Phương pháp sàng lọc thể nhận gen GS1 in vitro 26 ac th si iv 2.3.2 Đánh tính kháng kháng sinh Kanamycin dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 trồng nhà lưới 27 2.3.3 Phương pháp tách DNA tổng số (lượng nhỏ) từ thực vật 27 2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN tổng số (lượng lớn) từ thực vật 28 2.3.5 Phương pháp định tính định lượng DNA tổng số 29 2.3.6 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30 2.3.7 Phương pháp tách chiết mRNA 30 2.3.8 Phương pháp tổng hợp cDNA 31 2.3.9 Phương pháp kiểm tra có mặt gen chuyển chuyển gen lu an PCR 33 n va 2.3.10 Phương pháp Southern blot 35 tn to 2.3.11 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR) 36 gh 2.3.12 Phương pháp nhân giống vơ tính dịng bạch đàn Urô 37 p ie 2.3.13 Đánh giá sinh trưởng dòng bạch đàn chuyển gen GS1 38 w Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 oa nl 3.1 Kết sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 môi trường kháng d sinh chọn lọc in vitro 39 lu va an 3.2 Kết sàng lọc dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 in vivo 42 u nf 3.3 Kết phân tích dịng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 kỹ thuật ll PCR 45 m oi 3.4 Kết phân tích dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 kĩ thuật lai z at nh Southern 48 z 3.5 Kết phân tích dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 kĩ thuật @ RT-PCR 49 gm l 3.6 Kết đánh giá mức độ ổn định gen chuyển dịng bạch đàn m co Urơ chuyển gen GS1 51 an Lu 3.7 Kết đánh giá sinh trưởng dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 55 3.7.1 Sinh trưởng chiều cao dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 va n trồng nhà lưới 55 ac th si v 3.7.2 Đánh giá sinh khối tươi dịng Bạch đàn urơ chuyển gen GS1 đối chứng giai đoạn vườn ươm 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ Chữ viết tắt A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzylaminopurine cDNA Complementary DNA CS Cộng DNA Axic deoxiribonucleic E Eucalyptus lu an Food and Agriculture Organization of the United Nations GS Glutamin synthetase IBA Indol Butyric Acid n va FAO ie gh tn to Kanamycin p Kan nl Napthalene Acetic Acid an Nông nghiệp Phát triển nông thôn va NN&PTNT Môi trường lu MT d oa NAA Murashige & Skoog w MS Riboucleic acid RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction WT Wild type (hoang dại) ll u nf RNA oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si vii DANH MỤC CÁC BÀNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 môi trường kháng sinh chọn lọc in vitro 26 Bảng 2.2 Cặp mồi kiểm tra gen nptII, 35S-P, NOS-T chuyển gen 33 Bảng 2.3 Cặp mồi kiểm tra gen GS1 chuyển gen 34 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra chuyển gen 34 Bảng 2.5 Cặp mồi kiểm tra gen GS1 từ mRNA chuyển gen .37 Bảng 3.1 Kết nghiên cứu chuyển gen GS1 vào bạch đàn Urô 40 lu Bảng 3.2: Ảnh hưởng kanamycin đến tỉ lệ cháy bạch đàn Urô không chuyển an gen 43 n va Bảng 3.3: Kết đánh giá tính kháng kháng sinh kanamycin dịng bạch đàn tn to Urơ chuyển gen GS1 nhà lưới 44 gh Bảng 3.4 Sinh trưởng chiều cao dịng Bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 p ie đối chứng .56 w Bảng 3.5 Sinh khối tươi dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 đối chứng d oa nl (wt) .59 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vai trị GS q trình đồng hóa tái sử dụng nitơ (Stéphanie cs, 2009) 14 Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-GS1 17 Hình 1.3 Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA vector chuyển gen pBI121GS1 18 Hình 3.1 Chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tái sinh môi trường chứa kanamycin 150 mg/l , 200 mg/l rễ môi trường rễ chọn lọc chứa 75 lu an mg/l kanamycin 41 n va Hình 3.2 Các dịng Bạch đàn urơ chuyển gen GS1 trồng nhà lưới đánh giá tn to tính kháng kháng sinh 45 gh Hình 3.3 DNA tổng số tách chiết từ dịng bạch đàn Urơ giả định chuyển p ie gen GS1 46 w Hình 3.4 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ dịng bạch đàn Urơ chuyển oa nl gen 46 d Hình 3.5 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ dịng bạch đàn Urơ lu va an chuyển gen 47 u nf Hình 3.6 Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter NOS-T từ dòng bạch ll đàn Urô chuyển gen GS1 48 m oi Hình 3.7 Kết Southern blot mẫu bạch đàn Urô chuyển gen GS1 49 z at nh Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR dịng bạch đàn Urô chuyển z gen GS1 mồi GS1-F/R Act-F/R 50 gm @ Hình 3.9 Các dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 chu kì nhân giống thứ 51 l Hình 3.10 DNA tổng số dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 tách chiết m co chu kì gel agarose 0,8% 52 an Lu Hình 3.11 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 + NOS -T từ dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 53 n va ac th si 58 bước đầu chuyển gen giai đoạn vườn ươm/nhà lưới, để đưa kết luận xác cần tiếp tục đưa trồng điều kiện tự nhiên đánh giá giai đoạn 12, 24 36 tháng tuổi Bên cạnh đó, kết đánh giá sinh trưởng chiều cao bạch đàn Urô chuyển gen GS1 so với đối chứng không chuyển gen gần tương đương với số cơng trình cơng bố chuyển gen GS1 đối tượng Dương lai số tác giả giới (Gallardo cs, 1999; Fu cs, 2003; Man cs, 2011) lu an n va p ie gh tn to E-X16 E-X7 E-X17 E-X29 E-X20 oa nl w WT d Hình 3.15 Kiểu hình dịng chuyển gen GS1 đối chứng không chuyển va an lu gen giai đoạn tháng tuổi u nf 3.7.2 Đánh giá sinh khối tươi dịng Bạch đàn urơ chuyển gen GS1 ll đối chứng giai đoạn vườn ươm oi m z at nh Bên cạnh việc đánh giá sinh trưởng chiều cao chuyển gen đối chứng, sinh khối tươi tiêu sử dụng để so z sánh Tổng sinh khối tươi dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 dịng @ l gm đối chứng khơng chuyển gen (wt) trồng chậu đất nhà lưới tháng tuổi Các sau đo xác định chiều cao, rửa đất cân tổng sinh khối m co tươi toàn Kết thu trình bày bảng 3.5: an Lu n va ac th si 59 Bảng 3.5 Sinh khối tươi dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 đối chứng (wt) Mẫu nghiên cứu Tổng sinh khối Tỷ lệ sinh khối tươi (g) tăng (%) 4,50 ± 0,18f Dòng E-X7 5,56 ± 0,27e 23,56 Dòng E-X16 5,63 ± 0,10b 25,11 Dòng E-X17 5,25 ± 0,13d 16,67 Dòng E-X20 5,09 ± 0,11c 13,11 Dòng E-X29 5,28 ± 0,12a 17,33 Trung bình 5,36 ± 0,15 19,16 lu Đối chứng (wt) an n va ie gh tn to p Ghi chú: Trong phạm vi cột, giá trị mang chữ khác oa nl w sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 d Kết thu cho thấy, tổng sinh khối tươi tồn dịng an lu bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tăng cao so với dòng đối chứng rõ rệt u nf va Dịng E-X7 E-X16 tổng sinh khối tươi tồn 5,56 g 5,63 g vượt ll so với đối chứng 23,56% 25,11% dòng chuyển gen GS1 lại E- oi m X17, E-X20 E-X29 tổng sinh khối tăng vượt so với dòng đối chứng (wt) lần z at nh lượt 16,67%, 13,11%, 17,33% Giá trị tăng trung bình tổng sinh khối dịng chuyển gen đối chứng khơng chuyển gen 19,16% Tuy nhiên, z gm @ dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 đưa trồng giai đoạn vườn ươm tháng tuổi nên chưa đánh giá sinh trưởng, phát triển giai đoạn rừng l m co trồng Cần tiếp tục có nghiên cứu đánh giá sinh trưởng sinh khối chuyển gen so với đối chứng giai đoạn rừng trồng để có sở lựa chọn an Lu đủ tiêu chuẩn làm giống n va ac th si 60 lu Hình 3.16 Sinh khối dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 đối chứng an n va không chuyển gen (wt) p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1) Đã sàng lọc 41 chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 rễ môi trường rễ chọn lọc chứa kháng sinh kanamycin 75 mg/l Phân tích kĩ thuật sinh học phân tử xác định dòng chuyển gen (E-X7, E-X16, EX17, E-X20 E-X29) cho thấy mức độ ổn định gen chuyển sau chu kì nhân giống vơ tính 2) Đánh giá sinh trưởng dịng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 (ký lu hiệu: E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) cho thấy dịng có độ vượt chiều an n va cao từ 17 – 28,3% độ vượt sinh khối tươi từ 13,11% - 25,11% so với dòng Kiến nghị ie gh tn to đối chứng không chuyển gen p 1) Tiếp tục xác định mức độ biểu protein gen GS1 d oa ELISA… nl w dịng bạch đàn Urơ chuyển gen thông qua kĩ thuật Western blot, an lu 2) Tiếp tục theo dõi đánh giá sinh trưởng dịng bạch đàn Urơ va chuyển gen GS1 so với đối chứng không chuyển gen giai đoạn nhà lưới oi m lá, điều kiện nghèo nitơ… ll u nf qua tiêu sinh trưởng đường kính thân, sinh khối khơ tồn cây, diện tích z at nh 3) Đánh giá sinh trưởng dịng bạch đàn Urơ chuyển gen GS1 so với đối chứng không chuyển gen điều kiện đồng ruộng z m co l gm @ an Lu n va ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Thị Hồng Gấm, Trần Thị Hương Giang, Bùi Phương Thảo, Nguyễn Văn Đoài, Nguyễn Thị Thơm, Bùi Văn Thắng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2016), Tạo thuốc chuyển gen GS1 tăng cường hiệu sử dụng nitrogen, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, Số 3/2016 Lê Đình Khả (2006), Lai giống rừng, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hồng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalyptus theo sinh lu trưởng kháng bệnh Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp an n va Quyết định 4861/QĐ-BNN-TCLN Bộ NN PTNT ngày 17/11/2014 Thông tư số 44/2015/TT-BNNPTNT ngày 23/11/2015 Bộ trưởng Bộ gh tn to NN&PTNT Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo thuốc kháng bệnh khảm ie p kỹ thuật RNAi Luận văn Thạc sỹ sinh học w Alwine J C., D J Kemp and G R Stark (1977), Method for detection of d oa nl Tài liệu tiếng Anh: lu va an specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenyloxymethyl-paper Anuário Estatístico Da Abraf (2013) Ano base 2011 Brasília, DF: ABRAF, ll u nf and hybridization with DNA probes, PNAS 74(12), pp 5350-5354 m oi 2012 136 p Disponível em: 227 | Rev Geama, Recife – (4): 216-228 2017 | Online version ISSN: 2447-0740 | z http://www.geama.ufrpe.br @ z at nh Out-Dez Becker T W., Caboche M., Carrayol E and Hirel B (1992), Nucleotide gm l sequence of a tobacco cDNA encoding plastidic glutamine synthetase and m co light-inducibility, organ specificity and diurnalrhythmicity in the Molecular Biology 19, pp 367-379 an Lu expression of the corresponding genes of tobacco and tomato, Plant n va ac th si Boland DJ, Brooker MIH, Chippendale GM, Hall, NH, BP M, Johnson RD (2006), Forest trees of Australia, Melbourne, CSIRO, Australia Cantón F R., Suarez M F., Jose-Estanyol M and Cánovas F (1999), Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings: Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts, Plant Molecular Biology 40, pp 623-634 Clarke B, McLeod I, Vercoe T (2009), Trees for Farm Forestry: 22 promising species, The Rural Industries Research and Development Corporation, Barton, Kingston lu an Clemente M T and Marquez A J (1999), Site-directed mutagenesis of n va Glu-297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine L-methionine sulfoximine, Plant Molecular Biology 40, pp 835-845 gh tn to synthetase alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to Cren M and Hirel B (1999), Glutamine synthetase in higher phants: p ie Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell, Plant w Dubois F., Brugière N., Sangwan R S and Hirel B (1996), Localisation of d oa nl Cell Physiology 40, pp 1187-1193 lu va an tobacco cytosolic glutamine synthetase enzymes and the corresponding u nf transcripts show organ-and cell-specific patterns of protein synthesis and ll gene expression, Plant Molecular Biology 31, pp 803-817 m oi 10 Eldridge K, Davidson J, HarwoodC and Van Wyk G (1993), Eucalyptus z at nh Domestication and Breeding Oxford University Press, Oxford N F Weeden, Crispin B Taylor, z 11 Elsbeth L Walker, Pamela Green, @ Gloria M Coruzzi, (1995), Molecular evolution of duplicate copies of gm m co Molecular Biology 29, pp 1111-1125 l genes encoding cytosolic glutamine synthetase in Pisum sativum, Plant genetic modification an Lu 12 FAO (2004), Priliminary review of biotechnology in forestry including n va ac th si 13 Fu J., R Sampalo, F Gallardo, F M Cánovas and E G Kirby (2003), Assembly of a cytosolic pine glutamine synthetase holoenzyme in leaves of transgenic poplar leads to enhanced vegetative growth in young plants, Plant, Cell and Environment 26, pp 411–418 14 Fuentes S I., Allen D J., Ortiz-Lopez A and Hernández G (2001), Over expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and grow at low nitrogen concentrations, Joural Experimental Botany 52, pp 1071-1081 15 Gallardo F., J Fu, F R Canton, A Garcia-Gutierrez, F M Cánovas and E lu an G Kirby (1999), Expression of a conifer glutamine synthetase gene in n va transgenic poplar, Planta 210, pp 19–26 www.git-forestry.com gh tn to 16 GIT Forestry (2008), Cultivated eucalyptus global map 2008, http:// p ie 17 GLOBAL Eucalyptus map: a cartography information resource depicting Eucalyptus cultivated forests worldwide, (2009) w Eucalyptus oa nl 18 Grupo Sustainable Forest Management and Grupo d Empresarial ENCE, S.A 2009, 76 lu va an 19 Hung TD, Brawner JT, Mede R, Lee DJ, Southerton S, Thinh HH, Dieters u nf MJ (2015), Estimates of genetic parameters for growth and wood ll properties in Eucalyptus pellita F Muell to support tree breeding in m oi Vietnam, Annals of Forest Science 72, pp 205‒217 z at nh 20 Iglesias TG, Wilstermann D Eucalyptus universalis Global Cultivated z Eucalyptus Forests Map 2008 version 1.0.1.In: GIT Forestry Consulting’s @ Eucalyptoligics: Information resources on l gm worldwide, (2008) Eucalyptus cultivation m co 21 Ishiguri F, Diloksumpun S, Tanabe J, Iizuka K, Yokota S (2013), Stress- an Lu wave velocity of tree and dynamic Youngʼs modulus of logs of 4-year-old Eucalyptus camaldulensis trees selected for pulpwood production in n va Thailand, Journal of Wood Science 59, pp 506‒511 ac th si 22 Ireland, R J and Lea, Peter John (1999), The enzymes of glutamine, glutamate, asparagine and aspartate metabolism, Plant Amino Acids : biochemistry and biotechnology: Marcel Dekker Inc, New York, pp 49109 23 Jacek Biesiadka , Andrzej B Legocki (1997), Evolution of the glutamine synthetase gene in plants, Plant Science 128, pp 51–58 24 Jing Z P., F Gallardo, M B Pascual, R Sampalo, J Romero, A Torres, D E Navarra and F M Cánovas (2004), Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase, New lu an Phytologiist 164, pp 137–145 n va 25 Keadtidumrongkul Pornthep, Anongpat Suttangkakul, Phitsanu Pinmanee, Supachai Vuttipongchaikij (2017), Growth modulation effects of CBM2a gh tn to Kanokwan Pattana, Chokchai Kittiwongwattana, Somsak Apisitwanich, p ie under the control of AtEXP4 and CaMV35S promoters in Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum and Eucalyptus camaldulensis, Transgenic w d oa nl Res, DOI 10.1007/s11248-017-0015-4 an lu 26 Kevil Christopher G., Loren Walsh, F Stephen Laroux, Theodore va Kalogeris, Mathew B Grisham, J.S Alexander (1997), An improved, ll u nf rapid Northern protocol, Biochemical and Biophysical Research oi m Communications 238(2), pp 277-279 z at nh 27 Min-gang Li, Richard Villemur, Patrick J Hussey, Carolyn D Silflow, J Stephen Gantt, D Peter Snustad (1993), Differential expression of six z l gm pp 401-407 @ glutamine synthetase genes in Zea mays, Plant Molecular Biology 23(2), 28 Man Huimin, Stephan Pollmann, Elmar W Weiler, Edward G Kirby m co (2011), Increased glutamine in leaves of poplar transgenic with pine GS1a an Lu caused greater anthranilate synthetase α-subunit (ASA1) transcript and n va ac th si protein abundances: an auxin-related mechanism for enhanced growth in GS transgenics?, Journal of Experimental Botany 62(13), pp 4423–4431 29 Matsuoka, T., et al (2001), A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize, Shokuhin Eiseigaku Zasshi 42 (1), pp 24–32 30 Miflin B J and Lea P J (1980), Ammonia assimilation In: Miflin BJ, ed The biochemistry of plants, vol San Diego, CA, USA: Academic Press, pp 169–202 31 Miflin B J and Habasd Dimah Z (2002), The role of glutamine synthetase lu an and glutamate dehydrogenase in nitrogen assimilation and posibilities for va n improvement in the nitrogen utilization of crops, Journal of Experimental gh tn to Botany 53(370), pp 979-987 32 Nap Jan-Peter, Jacques Bijvoet and Willem J (1992), Biosafety of ie p kanamycin-resistant transgenic plants, Transgenic Research 1, pp 239- oa nl w 249 d 33 Norbert Brugière, Frédéric Dubois, Céline Masclaux, Rajbir S Sangwan, lu an Bertrand Hirel (2000), Immunolocalization of glutamine synthetase in u nf va senescing tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves suggests that ammonia ll assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol, Planta 211, oi z at nh 34 Nozomu Sakurai, m pp 519-527 Toshihiko Hayakawa, Teiji Nakamura, Tomoyuki Yamaya (1996), Changes in the cellular localization of z gm @ cytosolic glutamine synthetase protein in vascular bundles of rice leaves at various stages of development, Planta 200, pp 306-311 l m co 35 Oguchi Taichi, Yuko Kashimura, Makiko Mimura, Xiang Yu, Etsuko Matsunaga, Kazuya Nanto, Teruhisa Shimada, Akira Kikuchi, Kazuo N an Lu Watanabe (2014), A multi-year assessment of the environmental impact n va of transgenic Eucalyptus trees harboring a bacterial choline oxidase gene ac th si on biomass, precinct vegetation and the microbial community, Transgenic Res, DOI 10.1007/s11248-014-9809-9 36 Oliveira Igor C., Timothy Brears, Thomas J Knight, Alexandra Clark, and Gloria M Coruzzi (2002), Overexpression of Cytosolic Glutamine Synthetase Relation to Nitrogen, Light, and Photorespiration, Plant Physiol 129, pp 1170-1180 37 Ouyang L J., L M Li (2016), Effects of an inducible aiiA gene on disease resistance in Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis, Transgenic Res, DOI 10.1007/s11248-016-9940-x lu an 38 Schlamp K., A Weinmann, M Krupp, T Maass, P.R Galle, A Teufel n va (2008), Blotbase: A northern blot database, Gene 427(1-2), pp 47-50 impacts of Eucalyptus plantations: A review, Journal of Food, gh tn to 39 Shi Z, Xu D, Yang X, Jia Z, Guo H, Zhang N (2012), Ecohydrological p ie Agriculture and Environment 10(3&4), pp 1419-1426 40 Stéphanie M., Bernard and Dimah Z H (2009), The importance of w oa nl cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling, d New Phytologist 182, pp 608–620 lu va an 41 Teulieres C., Grima Pettenati J., Curie C., Teissie J., Boudet A M (1991), u nf Transient foreign gene expression in polyethylene/glycol treated or ll electropulsated Eucalyptus gunnii protoplast, Plant Cell, Tissue and m oi Organ Culture 25, pp 125-132 z at nh 42 Tuong Van Nguyen (2008), Genetic engineering of grain sorghum z (Sorghum bicolour (L.) Moench) for nutritional quality improvement @ Thesis submitted in requirement for Doctoral in Applied Biological l gm Siences m co 43 Yu Xiang, Akira Kikuchi, Takayoshi Shimazaki, Akiyo Yamada, Yoshihiro an Lu Ozeki, Etsuko Matsunaga, Hiroyasu Ebinuma, Kazuo N Watanabe (2013), Assessment of the salt torelance and environmental biosafety of Eucalyptus va n camaldulensis harboring a mangrin transgene, J Plant Res 126, pp 141 – 150 ac th si 44 Yu Xiang, Akira Kikuchi, Etsuko Matsunaga, Teruhisa Shimada, Kazuo N Watanabe (2013), Environmental biosafety assessment on transgenic Eucalyptus globulus harboring the choline oxidase (codA) gene in semiconfined condition, Plant Biotechnology 30, pp 73–76 45 Yu Xiang, Akira Kikuchi, Etsuko Matsunaga, Yoshihiko Morishita, Kazuya Nanto, Nozomu Sakurai, Hideyuki Suzuki, Daisuke Shibata, Teruhisa Shimada, Kazuo N Watanabe (2013), The Choline Oxidase Gene codA Confers Salt Tolerance to Transgenic Eucalyptus globulus in a SemiConfined Condition, Mol Biotechnol, DOI 10.1007/s12033-012-9575-y lu an 46 Wessels CB, Crafford PL, Toit BD, Grahn T, Johansson M, Lundqvist SO, n va Säll H, Seifert T (2016), Variation in physical and mechanical properties coast of Southern Africa, European Journal of Wood and Wood Products gh tn to from three drought tolerant Eucalyptus species grown on the dry west p ie 74, pp 563‒575 47 Wroblewski Tadeusz, Urszula Piskurewicz, Anna Tomczak, Oswaldo w oa nl Ochoa, Richard W Michelmore (2007), Silencing of the major family of d NBS-LRR-encoding genes in lettuce results in the loss of multiple lu 313x.2007.03182.x u nf va an resistance specificities, The Plant Journal, DOI: 10.1111/j.1365- ll 48 Wu YQ, Hayashi K, Liu Y, Cai Y, Sugimori M (2006), Relationships of m oi anatomical characteristics versus shrinkage and collapse properties in z at nh plantation-grown Eucalyptus wood from China, Journal of Wood Science z 52, pp 187‒196 @ gm 49 Zhong Ping Jing, Fernando Gallardo, María Belén Pascual, Rafael Sampalo, José m co l Romero (2004), Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar over expressing glutamine synthetase, New Phytologist 164, pp 137 – 145 an Lu n va ac th si lu an n va p ie gh tn to PHỤ LỤC d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) CaCl2 CaCl2.6H2O 332,02 440 KH2PO4 170 KNO3 1900,00 MgSO4 180,54 NH4NO3 1650,00 FeSO4.7H2O EDTA 27,8 37,3 Hoặc FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,2 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,90 ZnSO4 8,60 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 NaMoO4.2H2O 0,25 n va Hàm lượng (mg/l) oi an Thành phần oa lu STT p ie gh tn to nl w d 10 ll u nf va m 13 an 12 lu 11 MnSO4.H2O 16,90 15 Glycin 2,00 16 Thiamin HCl 17 Myo - inositol 18 Pyridoxine HCl z at nh 14 z 100,00 l gm @ 0,10 m co 0,50 an Lu n va ac th si Thành phần môi trường MS* (giảm ½ nitơ tổng số) Thành phần Hàm lượng (mg/l) CaCl2 CaCl2.6H2O KH2PO4 332,02 440 170 KNO3 950 MgSO4 180,54 NH4NO3 825 FeSO4.7H2O EDTA 27,8 37,3 Hoặc FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,2 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,90 ZnSO4 8,60 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ll 0,25 lu STT an n va p ie gh tn to u nf va an 12 lu 11 d oa nl w 10 NaMoO4.2H2O 14 MnSO4.H2O 16,90 15 Glycin 2,00 16 Thiamin HCl 17 Myo - inositol 18 Pyridoxine HCl oi m 13 z at nh z 100,00 m co l gm @ 0,10 0,50 an Lu n va ac th si Các công thức môi trường tái sinh bạch đàn Urô sử dụng nghiên cứu Loại môi Thành phần môi trường trường MS giảm 1/2 nitơ tổng số + mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 20 g/l sucrose + g/l phytagel + 400 Km-EU3 mg/l cefotaxime + 150 mg/l kanamycin, pH = 5,8 lu MS giảm 1/2 nitơ tổng số + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l an NAA + 100 ml/l ND + 20 g/l sucrose + g/l phytagel + 400 n va Km-EU4 tn to mg/l cefotaxime + 150 mg/l kanamycin, pH = 5,8 gh MS giảm ½ nitơ tổng số + 85 mg/l NaH2PO4 + 0,3 mg/l p ie BAP + 0,1 mg/l IBA + 0,05 mg/l NAA + 0,3 mg/l vitamin Km-EU5 B2 + 0,05 mg/l axít folic + 20 g/l sucrose + g/l phytagel + d oa nl w 400 mg/l cefotaxime + 200 mg/l kanamycin, pH = 5,8 sucrose + g/l agar + 300 mg/l cefotaxime + 75 mg/l u nf va Km-EU6 an lu ½ MS* bổ sung 0,3 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA + 20 g/l kanamycin, pH = 5,8 ll oi m z at nh Cơng trình cơng bố liên quan đến luận văn z m co l gm @ an Lu n va ac th si