(Luận văn) nghiên cứu nhân giống một số dòng tếch (tectona grandis linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Bộ giáo dục đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Trường đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ Dương lu an n va p ie gh tn to Nghiªn cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp z m co l gm @ Hà T©y 2007 an Lu n va ac th si Bé gi¸o dơc đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Trường đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ Dương lu an n va gh tn to Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy p ie in vitro d oa nl w nf va an lu Chuyên ngành: Lâm học Mà số: 60.62.60 z at nh oi lm ul Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp Người hướng dẫn: T.S Hà huy thÞnh z m co l gm @ an Lu Hà T©y 2007 n va ac th si Lêi nãi đầu Nâng cao chất lượng đào tạo nghiên cứu khoa học mục tiêu quan trọng việc đào tạo cao học Trường đại học Lâm nghiệp Để hoàn thành chương trình đào tạo Cao học Lâm nghiệp khoá học 2005- 2007, đồng ý Khoa sau đại học - Trường Đại học Lâm nghiệp, thực đề tài tốt nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Được trí Ban lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống lu rừng, đề tài thực phòng nghiên cứu nuôi cấy mô - Trung tâm an va nghiên cứu giống rừng n Để đạt kết học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp gh tn to này, tác giả đà nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều mặt ie Trường đại học Lâm nghiệp, đặc biệt Khoa sau đại học, tất thầy p cô giáo trực tiếp giảng dạy, lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống nl w rừng Cho phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy, cô d oa giáo, đặc biệt T.S Hà Huy Thịnh Th.S Đoàn Thị Mai, toàn thể cán an lu công nhân viên trung tâm đà tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ hoàn nf va thành luận văn lm ul Trong luận văn tránh khỏi khiếm khuyết, mong bảo bổ sung ý kiến nhà khoa học, bạn đồng z at nh oi nghiệp để công trình nghiên cứu hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! z Hà Tây, Ngày 25/09/2007 m co l gm @ Tác giả an Lu n va ac th si Đặt vấn đề lu an n va p ie gh tn to Theo định thủ tướng phủ (QĐ số 17/2006/NĐ-TTg), đến năm 2020 phải tạo giống trồng, vật nuôi có suất cao, chất lượng hiệu kinh tế cao phục vụ tốt nhu cầu chuyển đổi cấu kinh tế lĩnh vực Nông nghiệp Phát triển nông thôn Một nhiệm vụ ngành Lâm nghiệp phát triển vi nhân giống đáp ứng đủ nhu cầu giống Lâm nghiệp vào năm 2015 [16] Tếch loài sinh trưởng nhanh có biên độ sinh thái rộng gỗ Tếch sử dụng phổ biến xây dựng làm đồ gỗ gia dụng có khả chống mối mọt, chịu nước lâu ngày, mặt gỗ có độ bóng cao Trong công nghiệp chế biến gỗ: Tếch loài có chất lượng gỗ mịn bóc tách thành mỏng Do gỗ Tếch có tỷ trọng nhẹ, bị hà bám, chịu va đập ngâm nước mặn nên dùng công nghiệp đóng tàu Mặt khác, nhu cầu thương mại gỗ Tếch ngày tăng thay số loài gỗ quý khác[42] Cây Tếch trồng thăm dò nước ta vào khoảng năm 30 w d oa nl kỷ 20 Lúc đầu, Tếch trồng thử công viên đường phố nhiều tỉnh như: Hà Giang, Tuyên Quang, Sơn La, Lai Châu, Hà Nội, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh, Sài Gòn Cũng thời gian riêng Lộc Ninh, Tỉnh Bình Phước đà gây trồng Tếch thành khu rừng nhỏ Vào năm 60, với nguồn giống thu hái từ Lộc Ninh đà trồng thành công khu rừng Tếch 200 Định Quán, tỉnh Đồng Nai mét khu rõng TÕch t¹i Eak – Mat, tỉnh Đắc Lắc Sau năm 1975, Tếch trồng mở rộng nhiều lâm trường tỉnh miền Đông Nam Bộ Tây Nguyên như: Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Đắc Lắc, Gia Lai, Kom TumNhưng chưa có giống cải thiện nên chất lượng rừng không cao, suất rừng trồng Tếch nước ta thấp (9 12m3/ năm) [17] Hiện nay, diện tích rừng Tếch trồng nước giới năm tăng nf va an lu z at nh oi lm ul z co l gm @ m nhanh, nhiều Indonesia khoảng 1.760 nghìn ha, ấn Độ khoảng 2.450 an Lu nghìn ha, Myanmar 139 nghìn ha, Malaysia khoảng nghìn ha, Thái Lan n va ac th si 836 nghìn [29] ë ViÖt Nam, diÖn tÝch trång TÕch chØ ®¹t 1.500 ha, rÊt Ýt so lu an n va p ie gh tn to víi c¸c n­íc khu vực nhiều nguyên nhân khác mà thiếu giống cải thiện nguyên nhân quan trọng Chính công tác chọn tạo nhân giống số dòng tếch có suất cao vấn đề cần thiết Hiện nay, giống sản xuất từ hạt sử dụng phổ biến không đáp ứng nhu cầu trồng rừng rừng giống chuyên canh, hạt giống thu hái xô bồ nên phẩm chất hạt Hơn cách nhân giống gây tượng phân ly tính trạng thụ phấn tự làm cho trồng không đồng dẫn đến suất rừng biến động Một khó khăn suất hạt rÊt thÊp (1 rõng 15 ti chØ cho kho¶ng 50 kg hạt) Không thế, hạt Tếch tự nhiên có khả nảy mầm thấp, vườn ươm tỷ lệ nảy mầm không cao, đạt khoảng 5-10% [28] [42] Để khắc phục nhược điểm giải pháp nhân giống sinh dưỡng ngày quan tâm Tuy nhiên loài Tếch phương pháp nhân giống vô tính hom gặp nhiều khó khăn tỷ lệ rễ không cao đạt khoảng 24-30% [3] Chính lý nên giải pháp nhân giống sinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào quan tâm nghiên cứu Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, gọi nhân giống in vitro, phương pháp sản xuất từ chồi vượt mẹ d oa nl w lu nf va an b»ng c¸ch nuôi cấy chúng ống nghiệm, điều kiện vô trùng tuyệt môi trường thích hợp kiểm soát điều kiện hoàn cảnh đồng Nuôi cấy mô tế bào nhân nhanh với số lượng lớn khoảng thời gian ngắn, tiến hành điều kiện phòng thí nghiệm nên hoàn toàn chủ động sản xuất Ngoài ra, kỹ thuật giúp tạo giống mới, tạo nguồn bệnh, tạo có độ đồng cao trì đặc tính tốt mẹ Từ lý đề tài Nghiên cứu nhân giống mét sè dßng z at nh oi lm ul z gm @ l Tếch phương pháp nuôi cấy in vitro tiến hành Đây nội an Lu Tếch có suất cao m co dung đề tài cấp Nghiên cứu tuyển chọn nhân gièng Xoan ta vµ n va ac th si Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm Nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật hay gọi vi nhân giống phương pháp sản xuất hàng loạt từ chồi non (cơ quan, mô tế bào) cách nuôi cấy chúng ống nghiệm điều kiện lu vô trùng tuyệt môi trường thích hợp kiểm soát an va Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy in vitro n phạm trù khái niệm tất loại nuôi cấy mô tế bào điều kiện vô gh tn to trùng, bao gồm: p ie Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật Nuôi cấy phận đà tách khỏi thực thể thực vật: nuôi cấy oa nl w quan d Nuôi cấy phôi thành thục hay chưa thành thục đà tách khỏi an lu thể thực vật: nuôi cÊy ph«i lm ul m« sĐo nf va  Nu«i cấy mô bắt nguồn từ quan thực vật: nuôi cÊy m« hay nu«i cÊy z at nh oi  Nuôi cấy tế bào đơn lẻ hay cụm tế bào nhỏ môi trường lỏng Nuôi cấy tế bào thực vật sau đà tách bỏ vỏ tế bào, gọi nuôi cấy tế bào trần (protoplast) [14] z l gm * Tính toàn (totipotence) @ 1.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào co Năm 1902 lần nhà thực vật học người Đức Haberlandt đà đưa m quan niệm: Mỗi tế bào (đà biệt hoá) lấy từ thể thực vật an Lu có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo n va ac th si quan niƯm cđa sinh häc hiƯn đại tế bào riêng rẽ đà biệt hoá chứa toàn thông tin di truyền (ADN) cần thiết thể đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh, tính toàn tế bào thực vật Tính toàn tế bào sở lý luận nuôi cấy mô tế bào Cho đến nay, người đà hoàn toàn chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ * Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trưởng thµnh lµ mét chØnh thĨ thèng nhÊt bao gåm nhiỊu lu an quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực n va chức cụ thể khác Tuy nhiên, tất loại tế bào tn to bắt nguồn từ tế bào phôi sinh gh Sự phân hoá tế bào chuyển hoá tế bào phôi sinh thành tế p ie bào mô chuyên hoá đảm nhận chức khác thể oa nl w Quá trình phân hoá biểu thị sau: d Phân hoá nf va an lu Tế bào dÃn Tế bào chuyên hoá z at nh oi lm ul Tế bào phôi sinh Phản phân hoá z @ l Quá trình gồm có giai đoạn gm Sơ đồ 1.1: Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào an Lu sinh làm cho số lượng tế bào tăng lên cách đáng kể m co - Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy mô phân n va ac th si - Sự dÃn tế bào: Tế bào dÃn chiều ngang chiều dọc làm tăng kích thước quan nói riêng toàn thể nói chung Sau hai giai đoạn với trình biệt hoá tế bào phân hoá thành mô có chức riêng biệt, đảm nhận vai trò khác thể sống Tuy nhiên, tế bào phân hoá thành mô chức chúng không hoàn toàn khả phân chia Trong điều kiện định tế bào lại trở thành dạng tế bào phôi sinh tiếp tục trình phân chia cho tế bào có khả tái sinh thành hoàn chỉnh Đây trình phản phân hoá tế bào lu an Về chất phân hoá phản phân hoá trình điều hoà n va hoạt hoá gen Tại thời điểm trình phát triển cá thể, có tn to số gen bị ức chế hoạt hoá trở lại để tạo tính trạng mới, số gen gh khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình đà p ie mà hoá cấu trúc phân tử ADN tế bào Mặt khác, tế bào nằm w khối mô thể, thường bị ức chế tế bào xung oa nl quanh Khi tế bào tách riêng ra, gặp điều kiện thuận lợi gen d hoạt hoá, trình diễn biến theo chương trình đà định sẵn nf va an lu gen 1.2 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro lm ul 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị z at nh oi Mục đích giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo nguồn mẫu để phục vụ cho bước Giai đoạn coi bước hoá vật liệu để nuôi cấy Cây giống đưa khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích z gm @ ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy chủ động công tác nhân giống Trong trường hợp cần m co l thiết làm trẻ hoá vật liệu giống an Lu n va ac th si 1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động Mục đích giai đoạn tạo chồi từ mô nuôi cấy Khi đà có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu xử lý điều kiện vô trùng Người ta th­êng dïng mét sè ho¸ chÊt nh­ HgCl2, Ca(Ocl)2, H2O2 để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp Về nguyên tắc, mô nuôi cấy phận (thân, rễ, lá, hoa quả) theo Bhatt mô lấy từ phần non có khả nuôi cấy thành lu công cao mô lấy từ phận trưởng thành khác [29] Vì vËy, ng­êi ta an th­êng lÊy chåi ®Ønh hay chåi nách để nuôi cấy in vitro va n Ngoài ra, lựa chọn mô nuôi cấy cần ý tuổi sinh lý mô tn to thấp độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy thời kỳ sinh ie gh trưởng mạnh mùa sinh trưởng cho khả tái sinh tốt p (Anolesnon 1980) Đối với mẫu dễ bị hoá nâu nuôi cấy bổ sung than w hoạt tính Polyvinylpyrroline (PVP) vào môi trường [8] Giai đoạn cần oa nl đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh d trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào việc chän bé phËn nu«i lu nf va an cÊy, lấy mẫu cần đảm bảo nguyên tắc nêu Giai đoạn thường kéo dài tuần lm ul 1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh z at nh oi Một ưu điểm phương pháp nhân giống in vitro so với phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao Vì vậy, coi giai đoạn then chốt toàn trình nhân giống Hệ số nhân giai z gm @ đoạn biến động từ đến 50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường l phương pháp nhân Để tạo hệ số nhân cao cần lựa chọn môi trường điều co kiện ngoại cảnh thích hợp Trong giai đoạn vai trò chất điều hoà m sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) quan trọng để sản sinh lượng an Lu tối đa mà đảm bảo sức sống chất di truyền Theo n va ac th si nguyên tắc chung môi trường có nhiều Cytokinin kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường 25 27oC 10 16 chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 1000 3000lux Yêu cầu giai đoạn tạo số lượng tối đa thời gian ngắn đảm bảo sức sống chất di truyền 1.2.4 Tạo hoàn chỉnh (cho rễ) Đây giai đoạn chuẩn bị cho chuyển hệ thống vô trùng đạt kích thước định, chồi chuyển từ môi trường giai đoạn sang môi trường tạo rễ Thường sau tuần chồi lu an xuất rễ trở thành hoàn chỉnh Môi trường tạo rễ giảm lượng n va Cytokinin tăng lượng Auxin để tạo điều kiện thuận lợi cho rƠ cđa chåi tn to c©y Ng­êi ta th­êng dïng c¸c chÊt NAA (Axit α-naphtyl axetic), IBA (Axit ie gh -indol butyric) IAA (Axit -indol axetic) nồng độ 1mg/lít đến mg/lít p để tạo rễ cho hầu hết loài trồng Giai đoạn thường kéo dài từ w tuần lễ, sau chuyển sang môi trường Auxin để rễ phát triển oa nl giai đoạn nhạy cảm với ẩm độ bệnh tật hoạt động d rễ phát sinh yếu, chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng lu nf va an 1.2.5 Đưa môi trường tự nhiên Đây giai đoạn chuyển dần tõ èng nghiƯm nhµ kÝnh råi lm ul trời Cây mô chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự z at nh oi dưỡng nên phải tập cho quen dần với môi trường tự nhiên, tránh thay đổi đột ngột làm sốc bị chết Khi đà cứng cáp đạt z tiêu chuẩn định chiều cao, số số rễ đưa giá gm @ thể Giá thể tiếp nhận in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước l bệnh Phải giữ ẩm cho đưa từ bình nuôi ra, cần trì độ ẩm m co 50% để không nước làm giàn che để tránh ánh sáng mạnh tương tự chế độ chăm sóc hom từ hạt an Lu Sau tuần đưa mô sinh trưởng ổn định, chăm sóc mô n va ac th si 67 Bảng 3.9: Kết vào mẫu sè dßng TÕch (90 mÉu/dßng) lu an n va Tû lƯ nhiƠm (%) TL chÕt (%) TL bËt chåi (%) ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 TB F SigF 77,78 80 78,89 78,89 77,78 80 78,89 77,78 76,67 76,67 80,00 0,612 0,996 11,11 6,67 10 11,11 13,33 10 8,89 8,89 11,11 8,89 10,00 0,821 0,611 11,11 13,33 11,11 10,00 8,89 10,00 12,22 13,33 12,22 14,44 11,67 0,415 0,912 p ie gh tn to Dßng Cịng giống kết vào mẫu thí nghiệm 1, tû lƯ nhiƠm ë TÕch rÊt oa nl w cao (trên 76,67%) Tỷ lệ bật chồi dòng biến động khoảng 8,89%- d 14,44% trung bình 11,67% gần tương đương với thí nghiệm 1(13,70%) Các an lu dòng VN cho tỷ lệ bật chồi cao nhất, lớn mức trung bình (12,22%- nf va 14,44%) tiếp đến dòng MD ID cho tỷ lệ bật chồi 11,11%-13,33%, lm ul dòng Tếch Thái Lan cho tû lƯ bËt chåi thÊp nhÊt (8,89%-10%) MỈc dù có sai khác song kết phân tích ph­¬ng sai vỊ tû lƯ z at nh oi nhiƠm, tû lƯ bËt chåi cịng nh­ tû lƯ chÕt cđa dòng Tếch khác có xác suất F tính lớn 0,05 tỷ lệ bật chồi dòng Tếch có nguồn z gốc khác sai khác rõ rệt Như vậy, dòng Tếch có phản @ gm ứng với cïng mét c«ng thøc khư trïng hay cã thĨ sư dụng co l loại hoá chất khử trùng cho tất dòng Tếch khác Tóm lại, công an Lu thời gian 10 phút m thức khử trùng thích hợp cho tất dòng TÕch lµ HgCl2 0,05% n va ac th si 68 3.4.2 So sánh khả nhân chồi 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác Thí nghiệm nhân chồi sử dụng môi trường MS cải tiến có bổ sung BAP 0,7mg/l NAA 0,5mg/l Mỗi thí nghiệm tiến hành với 50 chồi lặp lại lần, kết tổng hợp phụ biểu 10, bảng 3.11 hình 3.9 đây: Bảng 4.10: Kết nhân chồi số dòng Tếch Hệ số nhân (lần) Chiều dài chồi (cm) Số TB/chồi (lá) lu an n va Sd X Sd X Sd ID 1,89 0,05 4,63 0,34 6,80 1,00 MD1 2,01 0,05 5,12 0,34 7,23 1,20 MD4 1,65 0,39 4,61 0,36 6,78 0,94 TL1 1,58 0,36 4,61 0,33 6,73 0,96 TL2 1,64 0,35 4,59 0,31 7,13 1,27 1,66 0,30 4,53 0,35 6,75 0,97 1,88 0,24 4,62 0,35 6,79 1,00 2,05 0,11 5,23 0,31 7,17 1,25 1,87 0,10 5,05 0,32 7,14 1,27 VN9 2,04 0,06 4,95 0,32 7,09 1,25 TB 1,83 4,59 0,33 6,96 1,11 ie gh tn to X nf va Dßng p TL5 d an lu VN22 oa VN21 nl w VN18 0,20 SigF 0,000 0,340 1,008 0,961 0,433 z at nh oi 24,24 lm ul F z m co l gm @ an Lu n va ac th si 69 LÇn 2.50 2.00 1.89 2.05 2.01 1.88 2.04 1.87 1.65 1.58 1.64 1.66 1.50 Hệ số nhân (lần) 1.00 0.50 Dßng 0.00 lu ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 an n va H×nh 3.9: BiĨu đồ hệ số nhân chồi số dòng Tếch tn to Kết cho thấy dòng trội Tếch có nguồn gốc khác cho gh kết nhân chồi không giống Hệ số nhân chồi biến động p ie khoảng 1,58-2,05 lần, trung bình 1,83 lần Tốt dòng Tếch w Việt Nam hệ số nhân chồi đạt 1,87-2,05 lần, tiếp đến dòng ID MD oa nl (1,65-2,01lần) cuối dòng TL hệ số nhân chồi thấp giá d trị trung bình (1,58-1,66lần) lu an Kết phân tích phương sai cho thấy x¸c st cđa F tÝnh cđa hƯ sè nf va nhân nhỏ 0,05 nên dòng Tếch khác cã sù sai kh¸c râ rƯt lm ul Cïng nuôi cấy loại môi trường hệ số nhân chồi dòng z at nh oi Tếch có nguồn gốc khác không giống Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy hệ số nhân dòng VN21, VN9 MD1 (2,05lần, 2,04lần 2,01lần) tốt tiếp đến dòng ID, VN18 VN22 (1,89lần, 1,88lần z 1,87lần) cuối dòng TL5, MD4, TL2 TL1 (hệ số nhân @ l gm thấp 1,66lần) Xác suất F tính chiều dài chồi số trung bình/chồi dòng Tếch lớn 0,05 có nghĩa sai co m khác dòng Tếch có nguồn gốc khác Chiều dài chồi cđa tÊt c¶ an Lu n va ac th si 70 dòng lớn 4,53 cm số lá/chồi lớn 6,73lá/chồi, chồi đều, khoẻ đẹp, xanh tốt Trong thí nghiệm nhân chồi dòng Tếch cđa ViƯt Nam cã hƯ sè nh©n chåi tèt nhÊt tiếp đến dòng Malaysia Indoneisa, cuối dòng Tếch Thái Lan Chất lượng chồi tất dòng Tếch thí nghiệm tốt nuôi cấy môi trường dinh dưỡng thích hợp nên chồi lên khoẻ, đẹp, cứng cáp, xanh tốt Như vậy, phản ứng dòng Tếch môi trường nhân chồi không giống nhau, hệ số nhân dòng có sai khác rõ rệt lu an song chất lượng chồi tất dòng tốt nên sử dụng môi n va trường để nhân giống cho dòng trội Tếch Tuy nhiên, cần tiếp tục tn to nghiên cứu để xác định môi trường nhân chồi thích hợp cho dòng p ie gh trội Tếch để nâng cao hệ sè nh©n chåi d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z VN22 VN18 ID MD4 TL5 TL1 TL2 m co l gm MD1 @ VN9 VN21 an Lu ¶nh 6: ¶nh nhân chồi số dòng Tếch n va ac th si 71 4.4.3 So sánh khả rễ 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác Chồi đạt tiêu chuẩn 10 dòng Tếch có nguồn gốc khác xử lý thuốc kích thích rễ IBA 1,0% cấy vào cát Mỗi thí nghiệm tiến hành với 50 mẫu lặp lại lần Kết tổng hợp phụ biểu 12, bảng 3.11 hình 3.10 đây: Bảng 3.11: Kết rễ số dòng TÕch Tû lƯ rƠ (%) lu Dßng Sè rƠ TB/chåi ChiỊu dµi (rƠ) TB/rƠ (cm) ChØ sè rƠ n va X Sd X Sd X Sd ID 89.91 1.57 2.30 0.22 2.27 0.17 4.97 0.83 MD1 92.32 7.46 2.14 0.27 2.02 0.23 4.56 1.00 MD4 96.33 0.96 2.35 0.47 2.01 0.32 4.62 0.66 TL1 91.67 3.46 1.95 0.45 1.91 0.25 4.04 1.01 85.93* 2.49 1.96 0.45 1.70 0.18 3.85 0.98 84.33* 1.71* 0.36 1.85 0.22 3.14 0.60 2.38 0.19 2.04 0.24 4.55 1.11 0.09 2.16 0.38 2.09 0.23 4.19 1.03 p ie gh tn to Sd d an X 2.54 VN18 92.55 4.65 VN21 98.98 VN22 97.98 nf va 0.86 2.11 0.42 2.15 0.30 4.41 1.22 VN9 97.78 0.89 2.50 0.35 2.19 0.34 5.47 1.18 TB 92.78 2.50 z at nh oi TL5 2.02 0.25 4.38 0.96 an lu oa nl w TL2 lm ul SigF 0,000 12,415 13,213 12,621 0,000 0,000 0,000 gm @ 72,141 0.36 z F 2.16 (* Sai kh¸c râ rƯt víi tÊt dòng lại) m co l an Lu n va ac th si 72 % 100.00 98.98 96.33 95.00 92.32 97.98 97.78 92.55 91.67 89.91 90.00 85.93 85.00 TL re 84.33 80.00 lu Dßng an 75.00 MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 n va ID tn to Hình 3.10: Biểu đồ tỷ lệ rƠ cđa mét sè dßng TÕch ie gh Cịng giống kết thí nghiệm 7, dòng trội Tếch cho p tỷ lệ rễ cao, biến động khoảng 84,33%-98,98% trung bình nl w 92,78% Các dòng Tếch khác có phản ứng không giống với oa loại chất kích thích rễ Các dòng VN có tỷ lệ rễ cao d (92,55%-98,98%) tiếp đến dòng MD (92,32-96,33%) cuối lu nf va an dòng ID TL (84,33%-91,67%) Kết phân tích phương sai cho thấy xác suất F tính tỷ lệ lm ul rễ nhỏ 0,05 nên dòng Tếch khác có sai khác râ rƯt Qua z at nh oi tiªu chn cđa Duncan cho thấy dòng VN9, VN22, VN21 MD4 có tỷ lệ sống cao (trên 96,33%) tiếp đến dòng VN18, MD1, TL1 (91,66- z 92,54%) cuối dòng ID, TL2 TL5 tỷ lệ rƠ nhá h¬n 90% m co l gm @ an Lu n va ac th si 73 Còng tương tự kết thí nghiệm số rễ TB/chồi dòng Tếch không cao, biến động khoảng 1,71-2,38rễ/chồi, trung bình 2,16rễ/chồi Trong 10 dòng thí nghiệm dòng TL có số rễ trung bình/chồi thấp (nhỏ 2rễ/chồi) dòng lại số rễ trung bình/chồi lớn 2rễ/chồi Kết phân tích phương sai cho F tính = 12,415 có mức ý nghĩa nhỏ 0,05 điều chứng tỏ có khác số rễ TB/chồi dòng Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy số rễ TB/chồi chia thành nhóm nhóm sai khác rõ ràng Dùng tiêu chuẩn lu an Bonferroni để so sánh cặp với cho thấy dòng TL5 sai khác với n va tất dòng Giữa dòng lại sai khác không rõ rệt tn to Như vậy, phản ứng dòng trội Tếch có nguồn gốc khác gh với loại chất kích thích rễ không giống Song, tỷ lệ rễ p ie tất dòng thí nghiệm cao (trên 84,33%), số rễ w tương đối cao (trên 3,14) nên sử dơng thc kÝch thÝch rƠ IBA 1,0% oa nl để rễ cho Tếch Song, cần tiếp tục nghiên cứu thí nghiệm rễ cho d dòng trội để tìm loại hoá chất nồng độ xử lý thích hợp lu nf va an Nhìn chung, từ giai đoạn vào mẫu đến nhân chồi rễ dòng Tếch Việt Nam cho kết tốt tiếp đến dòng có nguồn gốc từ lm ul Inđonêsia Malaysia cuối dòng Tếch Thái Lan z at nh oi Kết giải thích sau: Quá trình nhân giống in vitro chịu ảnh hưởng nhiều nhân tố khác môi trường nuôi cấy (các loại chất khoáng đa lượng, vi lượng, Vitamin ), điều kiện nuôi cấy (ánh z gm @ sáng, nhiệt độ, độ ẩm,), nhân tố di truyền, thời gian cấy chuyển ảnh hưởng qua lại nhân tố Trong đó, nhân tố di truyền có ảnh hưởng l co lớn đến khả nhân giống sinh trưởng phát triển sau m Hơn nữa, từ dẫn giống vườn ươm dòng Việt Nam đà an Lu sinh tr­ëng ph¸t triĨn tèt thÝch nghi với điều kiện khí hậu địa phương Các n va ac th si 74 dòng Tếch dẫn giống từ Thái Lan, Indonesia Malaysia nằm khu vực Đông Nam điều kiện khí hậu thời tiết có khác biệt nên từ giai đoạn đầu đà sinh trưởng phát triển dòng Tếch Việt Nam Mặc dù môi trường nuôi cấy tất dòng Tếch đồng nhÊt nh­ng u tè di trun vµ søc sèng ban đầu có ảnh hưởng đến tỷ lệ bật chồi, hệ số nhân tỷ lệ rễ nên dòng Tếch khác cho kết không giống từ giai đoạn vào mẫu, nhân chồi đến rễ Tóm lại, phương pháp nhân giống in vitro thích hợp Tếch Các kết thí nghiệm áp dụng rộng rÃi cho nhiều dòng tréi TÕch lu an cã nguån gèc kh¸c n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 75 Ch­¬ng KÕt luËn, tồn kiến nghị 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu bước đầu nhân giống in vitro số dòng Tếch, đề tài đà đến mét sè kÕt ln sau: C¸c chÊt khư trïng khác có ảnh hưởng tới khả bật chồi mẫu cấy không giống Cùng loại hoá chất sử dụng nồng độ thời gian khác cho kết vào mẫu khác Khư trïng mÉu lu b»ng HgCl2 0,05% kho¶ng thời gian 10 phút thích hợp nhất, tỷ lệ an n va nhiƠm Ýt vµ tû lƯ bËt chåi cao bật chồi Thời gian vào mẫu phù hợp với loài Tếch mùa Xuân mùa Hè (từ gh tn to Thêi gian lÊy mÉu cÊy ¶nh h­ëng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ mẫu p ie tháng đến tháng 7) Tỷ lệ mẫu bật chồi vào mùa Xuân (15%) mùa Hè (13,89%) cao so với mùa Thu (6,67%) mùa Đông (3,33%) nl w Môi trường có tác dụng tốt nhân chồi MS WMP cải tiến Môi d oa trường MS cải tiến cho hệ số nhân chồi (1,73lần) chất lượng chồi tốt (5,09 an lu cm/chồi 6,33 lá/chồi) Môi trường WMP cho hƯ sè nh©n chåi cao nhÊt lm ul tr­êng MS cải tiến nf va (2,10lần) chất lượng chồi (4,45 cm/chồi 5,75lá/chồi) môi Môi trường MS cải tiến bổ sung BAP Kinetin có ảnh h­ëng râ rƯt z at nh oi ®Õn hƯ sè nhân sinh trưởng chồi Môi trường thích hợp môi trường có bổ sung thêm 0.5mg/l BAP hệ số nhân chồi đạt 1,99 lần, chiều cao z bình quân chồi đạt 4,45cm số bình quân 7,57 lá/chồi @ gm Môi trường MS cải tiến có bổ sung chất kích thích sinh trưởng BAP co l NAA nồng độ khác ảnh hưởng rõ rệt đến khả nhân nhanh vµ kÐo m dµi chåi cđa chåi TÕch in vitro Môi trường MS cải tiến có bổ sung thêm an Lu n va ac th si 76 0.7mg/l BAP 0,5mg/l NAA thích hợp nhất, hệ số nhân chồi đạt 2,04 lần, chiều cao chồi đạt 4,93 cm số TB/chồi (8,24 lá/chồi) Môi trường MS/2 có bæ sung mét sè chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng ë nồng độ khác cho tỷ lệ rễ khác Môi trường thích hợp môi trường MS/2 cã bỉ sung 1.5mg/l IBA cho tû lƯ rƠ lµ 89,48%, sè rƠ TB/chåi lµ 2,3 rƠ/chåi, chiỊu dµi TB/rƠ lµ 1,6 cm/rƠ chØ sè rƠ lµ 3,7 Phương pháp cho rễ trực tiếp tỏ hiệu rút ngắn thời gian rƠ ®ång thêi tû lƯ rƠ cịng cao phương pháp rễ ống nghiệm Công thức thÝ nghiÖm tèt nhÊt IBA 1,0% cho tû lÖ rễ cao lu an 98,15%, số rễ bình quân chồi 2,4rễ/chồi, chiều dài rễ 1,8cm/rễ chØ n va sè rƠ lµ 4,3 tn to Tû lƯ rƠ cđa chåi TÕch ë v­ên ươm phụ thuộc nhiều vào mùa vụ rễ gh Mùa rễ thích hợp cho loài Tếch mùa Xuân mùa Thu tỷ lệ rễ p ie 94,81% 86,37% w Các dòng Tếch khác cho kết vào mẫu, nhân chồi rễ khác oa nl điều chứng tỏ nhân tố di truyền có ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro d Tếch Trong đó, tốt dòng trội có nguồn gốc Việt Nam (VN9, lu nf va an VN18, VN21 vµ VN22) tiếp đến dòng Malaysia (MD1 MD4) Indonesia (ID), cuối dòng Tếch Thái Lan (TL1, TL2 TL5) lm ul 10 Mặc dù kết có khác dòng kết vào mẫu, z at nh oi nhân chồi rễ dòng tương đối tốt nên áp dụng công thức thí nghiệm thích hợp vào nhân giống cho dòng trội Tếch có nguồn gốc khác z gm @ 4.2 Tồn Do thời gian hạn chế kinh nghiệm tác giả có hạn nên đề tài co l nhiều hạn chế m - Chưa nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp ánh sáng, nhiệt độ an Lu n va ac th si 77 - Các thí nghiệm môi trường dinh dưỡng phối hợp chất điều hoà sinh tr­ëng ch­a nhiỊu - Ch­a tiÕn hµnh thÝ nghiƯm giá thể thích hợp cho Tếch 4.3 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu môi trường sinh dưỡng khác với nhiều tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng khác để có môi trường nuôi cấy tối ưu cho Tếch - Tiếp tục nghiên cứu môi trường nhân chồi rễ thích hợp cho lu dòng trội Tếch an - Nghiên cứu nhân giống Tếch loại vật liệu khác phôi hạt, va n quả, phôi vô tính mà có hiệu kinh tế p ie gh tn to - Nghiªn cøu thư nghiƯm thªm vỊ mét sè loại giá thể phù hợp với Tếch d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 78 Môc lôc Trang Lời nói đầu Mục lục Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình, ảnh sơ đồ Đặt vấn đề Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu lu an n va p ie gh tn to 1.1 Khái niệm sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thùc vËt 1.1.1 Kh¸i niƯm 1.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tÕ bµo 1.2 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị 1.2.2 Giai đoạn cấy khởi ®éng 1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh 1.2.4 Tạo hoàn chỉnh (cho rễ) 1.2.5 Đưa môi trường tự nhiên 1.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới trình nhân giống in vitro 1.3.1 M«i tr­êng nu«i cÊy 1.3.2 Các chất điều hoà sinh trưởng 10 1.3.3 M«i tr­êng vËt lý 12 1.3.4 VËt liƯu nu«i cÊy 13 1.3.5 Điều kiện vô trùng 13 1.3.6 Buång nu«i cÊy 14 1.4 øng dơng nu«i cÊy mô tế bào thực vật công tác giống rõng 15 1.4.1 Trªn thÕ giíi 15 1.4.2 ë ViÖt nam 17 1.5 Loµi TÕch ( Tectona grandis Linn) 19 1.5.1 Đặc điểm sinh vật học sinh thái học 19 1.5.2 Giá trị kinh tế Tếch 20 1.5.3 Các nghiên cứu Tếch 20 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z gm @ co l Ch­¬ng Mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 24 m 2.1 Mơc tiªu nghiªn cøu 24 2.2 Đối tượng nghiên cứu 24 2.3 Néi dơng nghiªn cøu 24 an Lu n va ac th si 79 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4 VËt liƯu nu«i cÊy 24 2.4.2 Địa ®iĨm, ®iỊu kiƯn bè trÝ thÝ nghiƯm 25 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 27 2.5 Ph­¬ng pháp thống kê sử lí số liệu 32 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 36 lu an n va p ie gh tn to 3.1 Khö trïng mÉu vËt 36 3.1.1 ¶nh h­ëng cđa loại hoá chất đến khử trùng mẫu vật 36 3.1.2 ¶nh h­ëng cđa mïa vơ đến khả tái sinh chồi bất định ban đầu 39 3.2 ảnh hưởng môi trường chất điều hoà sinh trưởng đến nhân chồi Tếch 43 3.2.1 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 43 3.2.2 ảnh hưởng loại chất điều hoà sinh trưởng đến khả tạo chồi phát triển chåi TÕch 46 3.3 ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng, mùa vụ phương thức rƠ cđa chåi TÕch 54 3.3.1 ảnh hưởng NAA IBA đến khả t¹o rƠ cđa chåi TÕch èng nghiƯm 55 3.3.2 ảnh hưởng IBA NAA đến khả rễ chồi Tếch v­êm ­¬m 58 3.3.4 ¶nh hưởng mùa vụ đến trình rễ chồi Tếch nuôi cấy mô 63 3.4 Khả nhân giống nuôi cấy mô cho dòng tréi TÕch cã nguån gèc kh¸c 65 3.4.1 So sánh kết vào mẫu 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 66 3.4.2 So sánh khả nhân chồi 10 dòng trội Tếch có nguồn gèc kh¸c 68 4.4.3 So sánh khả rễ 10 dòng tréi TÕch cã nguån gèc kh¸c 71 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z Ch­¬ng Kết luận, tồn kiến nghị 75 m co l gm @ 4.1 KÕt luËn 75 4.2 Tån t¹i 76 4.3 KiÕn nghÞ 77 Tài liệu tham khảo Phụ lục an Lu n va ac th si 80 Danh mục bảng TT Tên bảng Trang ảnh hưởng loại hoá chất thời gian khử trùng đến kết vào mẫu 37 4.2 ảnh hưởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban đầu 41 4.3 ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tái sinh chồi Tếch (sau tuần) 44 4.4 ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh kéo dài chồi Tếch 48 4.5 ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả nhân nhanh kéo dài chồi Tếch 52 4.6 ảnh hưởng IBA NAA ®Õn tû lƯ rƠ cđa chåi TÕch 57 4.7 ảnh hưởng IBA NAA đến tỷ lệ rƠ cđa chåi TÕch ë v­ên ­¬m 60 lu 4.1 an n va p ie gh tn to ¶nh h­ëng cđa mïa vơ ®Õn tû lƯ rƠ cđa chồi Tếch vườn ươm Kết vào mẫu số dòng Tếch (90 mẫu/dòng) Kết nhân chồi số dòng Tếch Kết rễ mét sè dßng TÕch 60 65 69 72 d nf va an lu 4.9 4.10 4.11 oa nl w 4.8 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 81 Danh mục hình, ảnh sơ đồ TT 4.1 4.2 4.3 4.4 lu 4.5 an va n 4.6 gh tn to 4.8 p ie 4.9 4.10 w Tên Trang Biểu đồ ảnh hưởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban 41 đầu Biểu đồ ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tái 44 sinh chồi Tếch Biểu đồ ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân 49 nhanh kéo dài chồi Tếch Biểu đồ ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả nhân 52 nhanh kéo dài chồi Tếch ảnh hưởng BAP NAA đến tỷ lệ rễ chồi Tếch in 56 vitro ảnh hưởng IBA NAA đến tû lƯ rƠ cđa chåi TÕch ë 60 v­ên ươm Biểu đồ ảnh hưởng mùa vụ đến tỷ lƯ rƠ cđa chåi TÕch ë 64 v­ên ­¬m Biểu đồ hệ số nhân chồi số dòng TÕch 69 BiĨu ®å tû lƯ rƠ cđa mét số dòng Tếch 72 z at nh oi ảnh so sánh công thức tốt dùng BAP riên rẽ BAP kết hợp với NAA Chồi Tếch rễ trực tiếp vườn ươm sau 25 ngày z @ ảnh nhân chồi số dòng Tếch Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào Các b­íc nh©n gièng in vitro 54 62 70 25 m co l gm 2.1 3.1 lm ul nf va an Tªn Trang Chåi Tếch sau vào mẫu 30 ngày 39 Chồi Tếch nuôi cấy sau tuần loại môi trường khác 46 Chồi Tếch hai công thức cho kết nhân chồi tốt 51 lu TT d oa nl Danh mục ảnh sơ ®å an Lu n va ac th si