Phân lập và định danh chủng tảo chlorococcum sp tại cần giờ

lOMoAR cPSD| 27827034 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH VIỆN KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ CAO NTT NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG TẢO CHLOROCOCCUM SP TẠI CẦN GIỜ GVHD : ThS NGUYỄN THÀNH CƠNG SVTH : NGUYỄN ĐỒN THÚY VY MSSV : 1800005061 LỚP 18DSH1A : TP HCM, tháng 05 năm 2022 lOMoAR cPSD| 27827034 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Khoa Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện giúp đỡ em q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Đặc biệt em xin bày tỏ lịng biêt sơn sâu sắc đến hai thầy hướng dẫn khóa luận: Thầy Nguyễn Thành Cơng Thầy Ơng Bỉnh Ngun, hai Thầy tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ, động viên em suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Cuối em xin gửi lời cảm ơn bạn bè gia đình động viên, khích lệ suốt q trình học nghiên cứu khoa học để em hồn thành tốt khóa luận Tuy nhiên, luận văn em chắn khơng thể tránh hạn chế, thiếu sót Em mong góp ý chân thành từ Thầy, Cơ người để em hồn thành xuất sắc khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên (ký ghi rõ họ tên) lOMoAR cPSD| 27827034 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN ii NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ viii KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ix LỜI MỞ ĐẦU x Tính cấp thiết đề tài x CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Cần Giờ khu vực sinh Cần Giờ 1.2 Đặc điểm sinh học Chlorococcum sp .2 1.2.1 Ứng dụng Chlorococcum sp .2 1.2.2 Chỉ thị mã vạch DNA (DNA barcode) 1.3 Phân lập nghiên cứu ứng dụng vi tảo Chlorococcum sp Việt Nam 1.4 Phân lập nghiên cứu vi tảo Chlorococcum sp nước CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nơi thực 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu iv lOMoAR cPSD| 27827034 2.5 Phương pháp phân lập, nuôi cấy giữ giống 10 2.5.1 Phương pháp làm giống vi tảo môi trường thạch 11 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy vi tảo 11 2.6 Phương pháp tách chiết DNA .12 2.6.1 Tách DNA tổng số .12 2.7 Kỹ thuật điện di DNA gel agarose 13 2.7.1 Phương pháp khuếch đại trình tự DNA 13 2.8 Định danh phân tử chủng vi tảo phân lập 15 2.8.1 Giải trình tự sản phẩm PCR 15 2.9 Hiệu chỉnh trình tự 15 2.9.1 Loại bỏ tín hiệu khơng xác hai đầu trình tự khảo sát 16 2.9.2 Kiểm tra sai lệch hai kết giải trình tự 16 2.9.3 Tạo trình tự đồng 17 2.10 Các phần mềm sử dụng nghiên cứu 17 2.11 Xây dựng phát sinh loài 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .19 3.1 Thu thập mẫu xử lý mẫu 19 3.2 Kết phân lập chủng tạo 23 3.3 Kết tách chiết DNA tổng số từ tảo Cần Giờ 26 3.4 Kết khuyếch đại sản phẩm PCR 28 3.5 Kết giải trình tự hiệu chỉnh trình tự 29 3.5.1 Kết giải trình tự 29 30 3.5.2 Hiệu chỉnh lắp ráp trình tự .31 v lOMoAR cPSD| 27827034 3.5.3 So sánh trình tự truy vấn mẫu nghiên cứu với sở liệu GenBank 32 3.6 Xây dựng phát sinh chủng loài 34 CHƯƠNG 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 PHỤ LỤC .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 vi lOMoAR cPSD| 27827034 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trường SFM 11 Bảng 2.2 Cặp mồi sử dụng định danh phân tử chủng tảo 13 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 14 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt khuếch đại vùng 14 Bảng 2.5 Cặp mồi sử dụng phản ứng giải trình tự .15 Bảng 3.1 Vĩ độ, hình ảnh thu mẫu, hình ảnh soi kính 100x 19 Bảng 3.2 kết đo OD hai mẫu vi tảo 26 vii lOMoAR cPSD| 27827034 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Vi tảo chlorococcum sp Hình 2.1 Sơ đồ bố trí trí nghiệm .8 Hình 2.2 Sơ đồ Cần Giờ Hình 2.3 Phương pháp thu mẫu thực tế Hình 2.4 Sơ đồ bước định danh phân tử vi tảo .17 Hình 3.1 tế bào đơn nuôi cấy môi trường SFM 23 Hình 3.2 Tảo cấy ria đĩa petri soi vật kính dầu dầu 100x 23 Hình 3.3 Tảo ni bình erlen 250ml 23 Hình 3.4 kết điện di DNA tổng số hai mẫu vi tảo 23 Hình 3.5 kết điện di PCR hai vùng ITS 18S .24 Hình 3.6 kết giải trình tự ITS 24 Hình 3.7 kết giải trinh tự 18S 25 Hình 3.8 Kết hiệu chỉnh trình tự ITS 18S 25 Hình 3.9 kết so sánh liệu GenBank 18S 26 viii lOMoAR cPSD| 27827034 KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT DNA CTAB PCR TBE SFM STE TE RNA ITS EtBr ABI NCBI OD NICEM rDNA rRNA GIẢI THÍCH Deoxyribonucleic Acid Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Polymerase Chain Reaction Tris HCL – Borate – EDTA Tris HCL – EDTA Ribonucleic Acid Internal Transcribeb Acetic Acid Ribosom deoxyribonucleic acid Ribosom ribonucleic acid ix lOMoAR cPSD| 27827034 LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cần huyện ngoại thành ven biển, nằm phía Đơng Nam Thành phố Hồ Chí Minh Hằng năm, khu vực nhận lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, với ảnh hưởng biển kề cận đợt thủy triều, hình thành nên nhiều khu hệ thủy vực đa dạng Rừng cần giừo xem khu dự trữ sinh mức độ đa dạng lồi vi tảo Nhiều lòai vi tảo Cần Giờ như: Silic Thalassiosira sp., Chaetoceros lauderi Ralfs, Silic Entomoneis,… phân lập nghiên cứu Vi tảo loài thực vật phù du có kích thước từ 1- 50µm, quan sát kính hiển vi Hiện nay, có 100.000 lồi vi tảo xác định chúng có kích thước nhỏ, đa dạng lồi, tăng sinh nhanh chứa nhiều thành phần khai thác sử dụng nhiều lĩnh vực như: dùng làm nguồn cung cấp thức ăn cho động vật, xử lý mơi trường nước, bên cạnh vi tảo sử dụng làm nhiên liệu sinh học, mỹ phẩm y dược Vi tảo Chlorococcum sp vi tảo lục, sống môi trường nước mặn, chịu nhiệt độ ánh sáng cao Chlorococcum sp có hàm lượng như: flavonoid chiếm 10,57mg/g, lipid chiếm 27,87%, protein chiếm 22,38mg/g, carotenoid chiếm 8,58µg/l, astaxanthin chiếm 1,24mg, hàm lượng diệp lục 13,65µg/ml-1 Một số nghiên cứu cho thấy vi tảo Chlorococcum sp tổng hợp astasxanthin từ β – caroten thơng qua canthanxanthin adonoxanthin Ngồi phân tích hóa học cho thấy tồn hợp tính sinh học carotenoid, alkaloids, favanoids, fatacid, saponin, aminoacid carbohydrate có vi tảo Chlorococcum sp cho thấy hoạt tính ức chế phát triển chủng vi khuẩn nấm độc gây bệnh cho người như: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Vibreo cholerae, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus niger Aspergillus niger Hiện nay, vi tảo biết đến nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho nhiều đối tượng nuôi trồng thủy hải sản, thành phần hoạt tính sinh học có tiềm người Các kết nghiên cứu đặc điểm sinh học nuôi đủ sinh khối tảo cho tách chiết hợp chất có giá trị từ vi tảo Chlorococcum sp hồn tồn với Việt Nam Do đó, tơi thực đề tài phân lập định danh chủng tảo Chlorococcum sp Cần Giờ x lOMoAR cPSD| 27827034 Mục tiêu đề tài Thu nhận phân lập thành công chủng tảo Chlorococcum sp Định danh hình thái Chlorococcum sp xi lOMoAR cPSD| 27827034 Sau hai tuần mẫu tảo lên tiến hành phương pháp phân lập cách cấy ria đĩa thạch Các chủng vi tảo khuẩn phân lập, mẫu Hình 3.6 tế bào đơn nuôi cấy môi trường SFM cấy chuyền lưu giữ giữ môi trường thạch, nuôi nguồn sáng đèn huỳnh quang 50µmol.m-2.s-1, chu kỳ sáng 12 sáng/12 tối nhiệt độ 25oC Hình 3.7 Tảo cấy ria đĩa petri soi vật kính dầu dầu 100x Sau cấy chuyền đĩa thạch tiếng hành cấy sang bình erlen 250ml với thể tích mơi trường SFM vào khoảng 100ml (có sục khí, chiếu sáng liên trục đèn huỳnh quang 100µmol.m-2.s-1) hình 3.3 24 lOMoAR cPSD| 27827034 Hình 3.8 Tảo ni bình erlen 250ml 3.3 Kết tách chiết DNA tổng số từ vi tảo thu thập huyện Cần Giờ DNA tổng số từ vi tảo tách chiết phương pháp CTAB theo (Doyle and Doyle 1987) hiệu chỉnh cải tiến phù hợp với thực trạng mẫu Qua đó, chúng tơi tách chiết thành công DNA tổng số, sau đước tiến hành kiểm tra phương pháp điện di gel Agarose 1% M1: mẫu 1; M2: mẫu 2; Ladder: merker chuẩn phân tử 5bp Kết điện di gel Agarose 1% cho thấy băng DNA tương ứng với hai mẫu hai mẫu vi tảo có vết sáng chứng tỏa thu DNA sử dụng trữ điều kiện -20oC cho thí nghiệm 25 Hình 3.9 kết điện di DNA tổng số hai mẫu vi lOMoAR cPSD| 27827034 Kết đo OD cho thấy nồng độ DNA mẫu vi tảo dao động khoảng 201.114.0ng/µl với có nồng độ tính cao (1,8- 2,0) Các mẫu DNA tổng số bảo quuản -20oC sử dụng Bảng 3.7 kết đo OD hai mẫu vi tảo Tên mẫu Mẫu vi tảo số 1(M1) Mẫu vi tảo số 2(M2) Nồng độ DNA Tỷ số OD 260nm/298nm Tỷ số OD 260nm/230nm 1.86 1.25 36.0 1.88 1.23 18.0 (ng/µl) 3.4 Kết khuyếch đại sản phẩm PCR Sản phẩm DNA tổng số thu tiến hành phản ứng khuếch đại vùng gen mục tiêu phương pháp PCR kiểm tra phương pháp điện di gel Agarose 1% Sản phẩm điện di PCR kiểm tra gel Agarose 1% theo hình … chạy theo chu trình điện di Sau chu trình điện di kết thúc, miếng gel xuất vạch băng sáng thang DNA (DNA ladder) DNA ladder dùng để đo kích 26 lOMoAR cPSD| 27827034 thước sản phẩm PCR, băng sáng biểu diễn đoạn DNA với khối lượng phân tử khác 3.5 Kết giải trình tự hiệu chỉnh trình tự 3.5.1 Kết giải trình tự Sản phẩm PCR Sản phẩm PCR tảo gửi giải trình trự cặp mồi 18s- MZ- F, 18s- MZ- R SSU- 536R, SSU- 82F STBASE - MALAYSIA phương pháp Sanger Kết giải trình tự thị phần mềm FinchTV dạng đồ thị phát huỳnh quang đặc trưng cho màu sắc lồi nucleotide Mỗi mẫu có hai đồ thị tương ứng với hai lOMoAR cPSD| 27827034 mạch DNA bao gồm mạch giải mồi xuôi mạch giải mồi ngược 28 lOMoAR cPSD| 27827034 Hình 3.12 kết giải trinh tự 18S 3.5.2 Hiệu chỉnh lắp ráp trình tự Sử dụng phần mềm FinchTV để hiệu chỉnh, loại bỏ tín hiệu có biên độ khơng ổn định khó phân biệt với tín hiệu nên hai đầu đoạn mồi Hai mạch DNA giữ lại có biên độ đỉnh đồng với khoảng cách không chồng chất phân biệt rõ ràng với tín hiệu Tiến hành so sánh tương đồng hai mạch DNA xuất trình tự đồng phần mềm SeaView 29 lOMoAR cPSD| 27827034 Hình 3.13 Kết hiệu chỉnh trình tự ITS 18S 3.5.3 So sánh trình tự truy vấn mẫu nghiên cứu với sở liệu GenBank Đoạn trình tự 18s ITS mẫu vi tảo so sánh GenBank để đánh giá mức độ tương đồng kết nghiên cứu với nguồn sở liệu trình tự gen công bố giới Tiến hành so sánh trình tự 18s ITS mẫu nghiên cứu với sở liệu ngân hàng gen thu kết thể hình 30 lOMoAR cPSD| 27827034 Hình 3.14 kết so sánh liệu GenBank 18S 31 lOMoAR cPSD| 27827034 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Thu mẫu môi trường bên ngồi, phân lập, tách chiết thu nhận thành cơng DNA tổng số vi tảo Chlorococcum sp - Khuếch đại hiệu chỉnh thành công gen vùng 18s (MZ-F/R) ITS (536R/82F), thu sản phẩm có kích thước so với lý thuyết - So sánh trình tự hai vùng gen với sở liệu GenBank cho thấy hai trình tự vùng gen thuộc lồi Chlorococcum sp Cần ngắn gọn, khơng có lời bàn bình luận Chỉ kết luận vấn đề đề tài thực Khẳng định kết đạt Nhấn mạnh đóng góp Đề nghị Phải xuất phát từ nội dung nghiên cứu, phải cụ thể, rõ ràng, thiết thực áp dụng 32 lOMoAR cPSD| 27827034 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng thống kê Anova thí nghiệm Phụ lục ………… Đồ thị, bảng biểu hình ảnh bổ sung liên quan đến khóa luận tốt nghiệp để người đọc quan tâm kiểm tra tra cứu - Các số tính tốn thống kê (chủ yếu bảng ANOVA, tương quan…) - Mô tả phương pháp phân tích, phương pháp thực cịn tương đối mà người đọc chưa hoàn toàn quen thuộc - Phiếu điều tra, bảng điều tra theo mẫu quy định - Các tính tốn mẫu điều tra, thống kê trình bày tóm tắt dạng bảng biểu - Các thông số tiêu định mức theo quy định ngành Tồn văn báo cơng bố Giấy xác nhận đăng báo (nếu có) để xét điểm thưởng nghiên cứu khoa học cho khóa luận tốt nghiệp 33 lOMoAR cPSD| 27827034 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi, Thị Yến 2020 Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) Việt Nam dựa thị ITS Hà, Đức %J Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2019 Vi tảo-Sinh vật nhỏ bé có vai trò to lớn đời sống (5A):45 Hà, Nguyễn Thị Hoài 2006 Đa dạng sinh học số chủng vi tảo Chlorella phân lập hồ Hà Nội Khánh, Nguyễn Trần Thiện 2017 Khả xử lý Nitơ Phospho nước thải sinh hoạt vi tảo Chlorella sp Lan, Nguyễn Thị Mỹ, et al SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI TẢO CHỨA LIPID TRÊN MỘT SỐ ĐIỂM Ở MIỀN NAM VIỆT NAM Lan, Trịnh Thị, et al 2021 Phân lâp nuôi sinh khối vi tảo Scenedesmus acutus loại môi trường khác LÊ, THỊ HƯƠNG LIÊN 2021 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG XỬ LÝ NITƠ, PHỐTPHO TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI BẰNG SỰ KẾT HỢP GIỮA VI TẢO CHLORELLA VULGARIS VÀ VI KHUẨN AZOSPIRILLUM BRASILENSE, Trường Đại học Sư Phạm–Đại Học Đà Nẵng Liên, Nguyễn Thị Thu %J Hue University Journal of Science: Agriculture, and Rural Development 2018 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG TẢO SILIC SKELETONEMA COSTATUM TỪ VÙNG BIỂN THỪA THIÊN HUẾ ĐỂ LÀM THỨC ĂN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 127(3B):97–108-97–108 Mai, Nguyễn Thanh, et al 2009 Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy in vitro tảo silic nước mặn Chaetoceros calcistrans Paulsen, 1905 ứng dụng sinh khối tảo làm thức ăn cho tôm he chân trắng (Penaeus vannamei) 12(13-2009) Nguyễn, Thị Sương 34 lOMoAR cPSD| 27827034 2019 Phân lập khảo sát đặc điểm sinh học số loài vi tảo sinh cảnh cát ven hồ huyện Phong Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế, Trường Đại học Sư Phạm-Đại học Đà Nẵng Nhàn, Nguyễn Thị Thanh, Phó Thị Thúy %J TNU Journal of Science Hằng, and Technology 2020 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CỦA VI TẢO CHLORELLA ELLIPSOIDEA TẠI VƯỜN QUỐC GIA XUÂN THỦY 225(08):454-460 Phan, Văn Thuận 2020 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG XỬ LÝ Cr TRONG NƯỚC THẢI DỆT NHUỘM BẰNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS, Trường Đại học Sư Phạm-Đại học Đà Nẵng Tâm, Lưu Thị, et al NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NI SINH KHỐI LỒI VI TẢO LỤC (NANNOCHLORIS ATOMUS) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM CHO TÁCH CHIẾT CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Tiến, Dương Đức, and Võ %J Nhà xuất Nông nghiệp Hành, Hà Nội 1997 Tảo nước Việt Nam–phân loại tảo lục (Chlorococcales) Thành, Nguyễn Đức %J Tạp chí Sinh học 2014 Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật 36(3):265-294 Thảo, Trần Yên, et al 2016 Phân lập chủng vi tảo dầu từ nguồn nước ngọt, nước lợ nước mặn (3 (81)):88 Thắm, Dương Thị, et al Mở đầu Trí, Đỗ Thành, et al 2021 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG BỘT TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS NI TRONG BIOFILM ĐÃ BỊ LI TRÍCH ASTAXANTHIN LÀM THỨC ĂN BỔ SUNG CHO CÁ KOI NHẬT 18(9):1660 Tiếng Anh Alanís, Patricio Luque 2013 Isolation, Characterization and Identification of Microalgae from the Red Sea, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST) Andersen, Robert A 2005 Algal culturing techniques: Elsevier Andersen, Robert A, and Masanobu %J Algal culturing techniques Kawachi 35 lOMoAR cPSD| 27827034 2005 Microalgae isolation techniques 83 Archibald, Patricia %J British Phycological Journal 1979 Descriptions of new edaphic and aquatic species of Chlorococcum Meneghini (Chlorococcales) 14(4):305-312 Archibald, Patricia A %J British Phycological Journal 1988 Chlorococcum pamirum and C salinum, two new species of the Chlorophyceae from Central Asia 23(2):121-128 Bhagavathy, S, P Sumathi, and I Jancy Sherene %J Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine Bell 2011 Green algae Chlorococcum humicola-a new source of bioactive compounds with antimicrobial activity 1(1):S1-S7 Blackwell, John R, Eileen J Cox, and D James %J British phycological journal Gilmour 1991 The morphology and taxonomy of Chlorococcum submarinum (Chlorococcales) isolated from a tidal rockpool 26(2):133-139 Chisti, Yusuf %J Trends in biotechnology 2008 Biodiesel from microalgae beats bioethanol 26(3):126-131 Doyle, J %J NATO ASI Series 1991 DNA protocols for plants Molecular techniques in taxonomy 57:283293 Field, Katharine G, et al 1988 Molecular phylogeny of the animal kingdom 239(4841):748-753 Harwati, Theresia Umi, Thomas Willke, and Klaus D %J Bioresource technology Vorlop 2012 Characterization of the lipid accumulation in a tropical freshwater microalgae Chlorococcum sp 121:54-60 Hebert, Paul DN, et al 2003 Biological identifications through DNA barcodes 270(1512):313-321 Hunter-Cevera, Jennie C, and Angela Belt 1996 Maintaining cultures for biotechnology and industry: Elsevier Lee, Sang Hong, et al 2012 Estimation of pleiotropy between complex diseases using singlenucleotide polymorphism-derived genomic relationships and restricted maximum likelihood 28(19):2540-2542 Liu, Bei-Hui, and Yuan-Kun %J Biotechnology letters Lee 1999 Composition and biosynthetic pathways of carotenoids in the astaxanthin-producing green alga Chlorococcum sp 21(11):1007-1010 36 lOMoAR cPSD| 27827034 Liu, Bei-Hui, and Yuan-Kun %J Journal of applied phycology Lee 2000 Secondary carotenoids formation by the green alga Chlorococcum sp 12(3):301-307 Lv, Junping, et al 2018 The performance of a self-flocculating microalga Chlorococcum sp GD in wastewater with different ammonia concentrations 15(3):434 Mahapatra, Durga Madhab, and TV %J Current science Ramachandra 2013 Algal biofuel: bountiful lipid from Chlorococcum sp proliferating in municipal wastewater.47-55 Meyer, Achim, et al 2010 Fast evolving 18S rRNA sequences from Solenogastres (Mollusca) resist standard PCR amplification and give new insights into mollusk substitution rate heterogeneity 10(1):1-12 Olasehinde, Tosin A, Ademola O Olaniran, and Anthony I %J Journal of food biochemistry Okoh 2021 Cholinesterase inhibitory activity, antioxidant properties, and phytochemical composition of Chlorococcum sp extracts 45(3):e13395 Putri, Dina Soes, Sri Puji Astuti, and Siti Alaa 2019 The growth of microalgae Chlorococcum sp isolated from Ampenan estuary of Lombok Island in Walne’s medium AIP Conference Proceedings, 2019 Vol 2199, pp 050003 AIP Publishing LLC Radha, Boya, et al 2013 Metal hierarchical patterning by direct nanoimprint lithography 3(1):1-8 Rasoul-Amini, Sara, et al 2009 PCR amplification of 18S rRNA, single cell protein production and fatty acid evaluation of some naturally isolated microalgae 116(1):129-136 Reynolds, CS, et al 2000 The regulation of phytoplankton population dynamics in the world's largest lakes 3(1):1-21 Singh, Jasvinder, and Rakesh Chandra Saxena 2015 An introduction to microalgae: diversity and significance In Handbook of marine microalgae Pp 11-24: Elsevier Subramaniyam, Vidhyasri, et al 2015 Chlorococcum sp MM11—a novel phyco-nanofactory for the synthesis of iron nanoparticles 27(5):1861-1869 Surek, B, et al 37 lOMoAR cPSD| 27827034 1994 Ribosomal RNA sequence comparisons demonstrate an evolutionary relationship betweenZygnematales and charophytes 191(3):171-181 Thảo, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Minh Xuân, and Đặng Đức %J Tạp chí Khoa học Công nghệ-Đại học Đà Nẵng Long 2013 Mass culture of spirulina in the low-cost medium