Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm men sacchromyces ứng dụng tạo chế phẩm probiotic trong chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giáo viên hƣớng dẫn tiến hành nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn định danh chủng nấm men ứng dụng tạo chế phẩm Probiotic chăn nuôi’’ Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc tích cực đến đề tài hồn thành Để có đƣợc kết trƣớc hết tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng Th.S Nguyễn Thị Hồng Nhung thuộc môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh - Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp ngƣời tận tình hƣớng dẫn suốt q trình tơi thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, ban lãnh đạo cán nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Mặc dù cố gắng để hoàn thành đề tài song hạn chế mặt thời gian, kinh nghiệm thân điều kiện nghiên cứu nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót tồn định Tơi kính mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Lê Bá Minh Tuấn i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm men 1.1.1 Định nghĩa thuật ngữ nấm men 1.1.2 Các đặc điểm nấm men 1.1.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa nấm men 1.2 Giới thiệu chế phẩm Probiotic sử dụng chăn nuôi 1.3 Đặc điểm chung vi sinh vật Probiotic 1.3.1 Chịu muối mật 1.3.2 Chịu pH thấp 1.3.3 Chịu kháng sinh 1.3.4 Khả bám dính vào tế bào biểu mô ruột 1.4 Vai trị probiotic với vật ni 10 1.5 Phân loại vi sinh vật 11 1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt Nam 11 1.6.1 Trên giới 11 1.6.2 Tại Việt Nam 13 PHẦN 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu nghiên cứu 15 2.4 Môi trƣờng nghiên cứu 16 2.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu 17 ii 2.5.1 Phân lập chủng vi sinh vật hữu ích 17 2.5.2 Phƣơng pháp bảo quản giống 17 2.5.3 Tuyển chọn chủng có đặc tính probiotic 18 2.5.4 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 24 2.5.5 Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi sinh vật 24 2.5.6 Định danh vi khuẩn phƣơng pháp sinh học phân tử 26 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Phân lập chủng nấm men 28 3.2 Tuyển chọn chủng nấm men có đặc tính Probiotic 30 3.2.1 Khảo sát hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định 30 3.2.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 31 3.2.3 Khảo sát khả chịu pH dày 33 3.2.4 Khảo sát khả chịu muối mật 34 3.2.5 Khả đề kháng chất kháng sinh chủng vi sinh 36 3.2.6 Xác định khả bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột 37 3.3 Đặc tính sinh lý sinh hóa chủng Probiotic 38 3.3.1 Định danh vi khuẩn phƣơng pháp sinh học phân tử 40 3.3.2 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng N.CT 41 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 4.1 Kết luận 43 4.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích CFU Colony-Forming Unit CMC Carboxymethiylcellulose ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc ITS MPA MT NN&PTNT Internal Transcribed Spacer Meat-Peptone Agar Môi trƣờng Nông nghiệp phát triển nông thôn OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Axít ribonucleic SDS Sodium Dodecyl Sulfate TB Tế bào TE buffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật World Health Organization WHO Tổ chức Y tế Thế giới iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật hữu ích 28 Bảng 3.2 Kết vòng kháng vi sinh vật kiểm định 30 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi sinh vật 31 Bảng 3.4 Tỉ lệ TB sống sót (%) chủng theo thời gian mức pH33 Bảng 3.5 Tỉ lệ tế bào (%) chủng theo thời gian nồng độ muối mật khác 35 Bảng 3.6 Kết kháng kháng sinh chủng 36 Bảng 3.7 Khả bám dính màng nhầy niêm mạc ruột chủng38 Bảng 3.8 Khả lên men loại đƣờng chủng 39 Bảng 3.9 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng N.CT 41 v DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định chủng Nấm men 31 Hình 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào phân giải chất chủng nấm nem 32 Hình 3.3 Khả kháng kháng sinh Nấm men 37 Hình 3.4 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng nấm men N.CT 39 Hình 3.5 Khả lên men loại đƣờng của chủng N.CT 39 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR chủng N.CT 40 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời cổ đại ngƣời biết sử dụng Vi sinh vật (VSV) để chế biến bảo quản thực phẩm, nhƣng ý tƣởng tạo sản phẩm VSV sống hữu ích để bổ sung vào thức ăn nƣớc uống nhằm cải thiện sức khoẻ nâng cao suất vật nuôi đƣợc quan tâm nhiều vài thập kỷ trở lại Việt Nam đƣợc biết đến nƣớc nông nghiệp nhiên năm trở lại đây, trƣớc thời kỳ cơng nghiệp hóa đại hóa đất nƣớc, nơng nghiệp có bƣớc chuyển dịch từ trồng trọt lƣơng thực sang tập trung phát triển ngành chăn ni, mơ hình trang trại chăn ni đƣợc nhân rộng toàn quốc Đến nay, sản phẩm ngành chăn nuôi đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng nƣớc mà xuất thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân Tuy nhiên, giá thành sản xuất lĩnh vực chăn nuôi Việt Nam cao giới số ngun nhân chính: Cơng nghệ sản xuất, chăn nuôi nƣớc ta chậm đổi không theo kịp nƣớc giới (Ví dụ: Giống heo nƣớc ăn kg cám cho kg thịt, heo nƣớc ta phải ăn 3-3,2 kg cám có kg thịt), sức đề kháng vật nuôi yếu nên bệnh dịch dễ xâm nhập, đặc biệt bệnh đƣờng ruột có ảnh hƣởng lớn đến ngành chăn ni, làm giảm suất, nhiều nguy tiềm tàng khác Bên cạnh đó, việc lạm dụng chất tăng trọng, tạo nạc thuốc kháng sinh làm tồn dƣ hóa chất sản phẩm thịt, trứng, gây ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe ngƣời nhƣ tác động xấu tới môi trƣờng xung quanh Ngƣời tiêu dùng quay lƣng với sản phẩm, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi Việt Nam Một số giải pháp phòng, chữa bệnh đƣờng ruột gia súc gia cầm nhờ tiêm vaccine, sử dụng kháng sinh, Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc kháng sinh chăn ni nảy sinh tính kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh, biến đổi chủng vi sinh vật, dƣ lƣợng thuốc kháng sinh thực phẩm,… (Newman, 2002) gây ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời cân sinh thái Năm 1974, Paker đƣa khái niệm probiotic để vi sinh vật chất làm cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột ngƣời vật ni, kể từ có nhiều phát vai trò, tác dụng vi sinh vật sống nhƣ: Tăng cƣờng sức khoẻ hệ tiêu hố thơng qua cải thiện cân hệ vi sinh vật ruột (Fuller, 1989), tăng đáp ứng miễn dịch, phịng chống ung thƣ đƣờng tiêu hố (FAO/WHO, 2001), giảm colesterol máu (Pereira Gibson, 2002) Các vi sinh vật probiotic thiết phải vi sinh vật sống hữu ích, chúng vi khuẩn (VK) (Thƣờng VK khuẩn Lactic, số chủng Bacillus) nấm men (Chủ yếu chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bouladii Candida tropicalis,…) Trong tự nhiên, vi sinh vật hữu ích phong phú, đa dạng nhƣng chúng vi sinh vật probiotic chúng thoả mãn đƣợc số điều kiện: Có sức sống cao, tồn đƣợc mơi trƣờng đƣờng tiêu hố (pH thấp, muối mật, có khả bám dính vào niêm mạc đƣờng tiêu hoá), phát triển cạnh tranh đƣợc với vi sinh vật có hại đƣờng ruột, có khả sản sinh enzyme tiêu hóa, có khả làm tăng đáp ứng miễn dịch Vì đặc điểm mà việc nghiên cứu phân lập, tuyển chọn vi sinh vật bổ sung vào chế phẩm sử dụng chăn nuôi trở nên khó khăn, phức tạp Hầu nhƣ có chủng vi sinh vật hội đủ điều kiện tuyển chọn Đó lý khiến tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn định danh chủng nấm men ứng dụng tạo chế phẩm Probiotic chăn nuôi’’ PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm men 1.1.1 Định nghĩa thuật ngữ nấm men Thuật ngữ Nấm men (Yeast, levure) tên chung để nhóm vi nấm thƣờng có cấu tạo đơn bào thƣờng sinh sơi nảy nở phƣơng pháp nẩy chồi (Budding) Nấm men không thuộc taxon phân loại định, chúng thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) ngành Nấm đảm (Basidiomycota) Hiện có khoảng 1000 lồi nấm men đƣợc miêu tả [9] 1.1.2 Các đặc điểm nấm men 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, hình ovan elip, hình chanh, hình trụ, hình chùy đơi cịn kéo dài thành sợi Nấm men thay đổi hình dáng kích thƣớc giai đoạn phát triển đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng dinh dƣỡng khác Hình dáng chúng không thay đổi trƣờng hợp giống đƣợc phân lập chƣa qua cấy chuyển nhiều lần môi trƣờng dinh dƣỡng tiêu chuẩn Tế bào nấm men có kích thƣớc tƣơng đối lớn: Đƣờng kính khoảng 1µm, chiều dài khoảng 8µm [9] Tùy vào lồi nấm men mà tế bào có hình dạng khác Có loại nấm men có khuẩn ti khuẩn ti giả Khuẩn ti giả chƣa thành sợi rõ rệt mà nhiều tế bịa nối với thành chuỗi dài Có lồi tạo thành váng ni cấy mơi trƣờng dịch thể [9] 1.1.2.2 Hình thức sinh sản nấm men Nảy chồi cách sinh sản vô tính điển hình nấm men Khi thành tế bào mở để tạo chồi (Bud) Chồi phát triển thành tế bào tách khỏi tế bào mẹ từ nhỏ khơng tách lớn tế bào mẹ Nhiều nhiều hệ dính vào tế bào nẩy chồi tạo thành cành nhiều nhánh tế bào giống nhƣ xƣơng rồng Chồi mọc theo hƣớng (Nẩy chồi đa cực- multilateral budding) nẩy chồi hai cực (Nẩy chồi theo hai cựcBipolar budding) nảy chồi cực định (Nẩy chồi theo cực – monopolar budding) Nấm men cịn có hình thức sinh sản phân cắt nhƣ vi khuẩn Có thể hình thành hay vài vách ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành tế bào phân cắt (Fission cells) Điển hình cho kiểu phân cắt nấm men thuộc chi Schizosaccharomyces Ở số nấm men thuộc ngành Nấm đảm, sinh dạng bào tử có cuống nhỏ (Sterigmatoconidia) bào tử bắn (Ballistoconidia hay ballistospore) Bào tử có cuống nhỏ thƣờng gặp chi nấm men Fellomyces, Kockovaella Sterigmatomyces, chồi sinh nhánh nhỏ tách nhánh bị gẫy Bào tử bắn đƣợc sinh gai nhọn tế bào nấm men bị bắn phí đối diện thành thục Nếu cấy nấm men sinh bào tử bắn thành hình zich zắc thạch nghiêng đĩa Petri sau thời gian nuôi cấy thấy xuất thành ống nghiệm nắp đĩa Petri có hình zích zắc khác đƣợc hình thành bào tử bắn lên Bào tử bắn đặc điểm nấm men thuộc chi Bensingtonia, Bullera, Deoszegia, Kockovaella, Sporobolomyces … Một số nấm men cịn có hình thức sinh sản vơ tính nữa, việc hình thành bào tử đốt (Arthroconidia hay arthrospore) Khi hình thành vách ngăn đầu nấm men dạng sợi, sau tách thành bào tử đốt Loại gặp nấm men thuộc hai ngành: Nấm túi Nấm đảm Thƣờng gặp chi nấm men Galactomyces, Dipodascus (Dạng vơ tính Geotrichum) Trichosporon Nấm men cịn tạo thành dạng tản (Thallus) dƣới dạng khuẩn ty (Sợi nấm- hyphae) hay khuẩn ty giả (Giả sợi nấm – pseudohyphae) [9] Dạng sinh sản hữu tính nấm men dạng bào tử túi (Ascospore) đƣợc sinh từ túi (Asci) Có thể xảy tiếp hợp (Conjugation) hai tế bào nấm men tách rời tế bào mẹ chồi Cịn có biến nạp trực tiếp tế bào sinh dƣỡng (Vegetative cell), tế bào biến thành túi không qua tiếp hợp (Unconjugated ascus) Thƣờng túi có hay đơi có bào tử túi Trong số trƣờng hợp lại có 1-2 bào tử Hình 3.3 Khả kháng kháng sinh Nấm men Qua kết đƣợc ghi bảng 3.6 hình 3.3 tơi đánh giá khả kháng chất kháng sinh chủng nhƣ sau: Cả chủng N.TH N.CT đề kháng đƣợc loại chất kháng sinh Tetracycine, Streptomycin, Gentamycin nồng độ thử nghiệm: 50µg/ml, 10µg/ml Nhƣ vậy, trình điều trị bệnh thƣờng gặp cho vật ni, phối hợp sử dụng chế phẩm probiotic từ chủng với chất kháng sinh (Tetracycine, Streptomycin, Gentamycin) kháng sinh khơng có khả tiêu diệt làm hoạt tính chủng Từ kết trên, định chọn lọc chủng N.TH, N.CT để tiếp tục cho bƣớc nghiên cứu 3.2.6 Xác định khả bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột Các chủng probiotic phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ chúng định cƣ tồn ruột non để từ hình thành khuẩn lạc, tăng khả kết dính đƣờng ruột Khả bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột 37 yếu tố quan trọng để chọn chủng có đặc tính probiotic Vì vậy, tơi tiến hành thí nghiệm thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.7 sau: Bảng 3.7 Khả bám dính màng nhầy niêm mạc ruột chủng TT Ký hiệu chủng Nồng độ ban đầu Khả bám dính (CFU/ml) (CFU/gam ruột) N.TH × 1010 3,16 × 108 N.CT 6.13 × 1010 5,2 × 108 Qua kết đƣợc ghi bảng 3.7 trên, nhận thấy: Cả chủng đƣợc nghiên cứu có khả bám dính màng nhầy ruột non với mật độ cao, cụ thể nhƣ sau: Mật độ tế bào chủng N.CT (5,2 × 108) cao so với chủng N.TH (3,16 × 108) - Mặt khác so sánh với kết nghiên cứu tác giả Trần Quốc Việt cs (2009) [14] khả bám dính màng nhầy niêm mạc ruột chủng vi sinh vật probiotic, nhận thấy kết phù hợp Tổng hợp kết phần 3.2 (Khả kháng vi sinh vật kiểm định, khả sinh enzyme ngoại bào, khả chịu pH thấp muối mật, khả kháng kháng sinh, khả bám dính), tơi định chọn chủng N.CT để nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh đến lồi phƣơng pháp sinh học phân tử 3.3 Đặc tính sinh lý sinh hóa chủng Probiotic Theo phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.5 tơi thu đƣợc kết trình bày hình 3.4; 3.5 bảng 3.8 sau: 38 1: Hình thái tế bào; 2: Hình thái khuẩn lạc Hình 3.4 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng nấm men N.CT Bảng 3.8 Khả lên men loại đƣờng chủng Kí hiệu chủng N.CT Tên đường Mannitol + Glucose + Fructose + Sucrose + Lactose - Ghi chú: +: Có khả lên men -: Khơng có khả lên men Hình 3.5 Khả lên men loại đƣờng của chủng N.CT Qua bảng 3.8 hình 3.5 tơi nhận thấy rằng: Chủng N.CT có khả 39 lên men loại đƣờng: Fructose, sucrose, mannitol, glucose không lên men đƣợc đƣờng lactose 3.3.1 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử Chủng N.NT đƣợc tách chiết DNA theo phƣơng pháp 2.5.6.1 Sau thực phản ứng PCR theo phƣơng pháp 2.5.6.2 Kết thu đƣợc nhƣ hình 3.6 sau: 500bp Giếng 1: Thang DNA 100 bp; Giếng 2: Mẫu âm tính nấm; Giếng 3: Chủng N.NT Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR chủng N.CT Kết hình 3.6 cho thấy, giếng số chủng nấm men N.CT cho sản phẩm PCR vạch kích thƣớc khoảng 500 bp Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Trần Quốc Việt (2009) nghiên cứu đƣợc công bố Sản phẩm PCR chủng nấm men N.CT đƣợc gửi đến Công ty TNHH Phát Triển Công Nghệ Ứng Dụng Việt Nam, để giải trình tự định danh đến lồi 40 3.3.2 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng N.CT Kết tổng hợp số đặc tính nghiên cứu đƣợc chủng N.CT đƣợc trình bày bảng 3.9 sau: Bảng 3.9 Tổng hợp số đặc tính probiotic chủng N.CT Salmonella Đánh giá chung Trung bình (d = 17mm) Shigella Trung bình (d = 18mm) Ecoli Mạnh (d = 23mm) Amylase Trung bình (d = 20mm) Cellulase Trung bình (d = 18mm) Protease Trung bình (d = 19mm) pH = Đạt (50,31%) pH = Đạt (54,37%) pH = Đạt (61,87%) 0,5% 1% Đạt (87,6%) Đạt (72,8%) 2% Đạt (62,8%) 3% Đạt (53,4%) Đặc tính Probiotic Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định Khả sinh enzyme ngoại bào Khả chịu pH thấp Khả chịu muối mật Khả kháng kháng sinh Tetracycline Đạt (10 µg/ml 50 µg/ml) Streptomycin Đạt (10 µg/ml 50 µg/ml) Gentamycin Đạt (10 µg/ml 50 µg/ml) Khả bám dính niêm mạc ruột Cao (5,2 × 108 CFU/ml) Nhƣ vậy, thấy chủng N.CT có đặc tính phù hợp với yêu cầu tạo chế phẩm probiotic ứng dụng chăn nuôi Tôi gửi chủng N.CT đến Công ty TNHH Phát Triển Công Nghệ Ứng Dụng Việt Nam để định danh cách giải trình tự gen ITS rARN so 41 sánh với ngân hàng gen Kết quả, trình tự gen ITS rRNA chủng N.CT nhƣ sau: ATTGCTTATTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCT TTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCA AACTTTTTATTTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAA ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCA GCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATC GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATG CCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGA GCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTACGTGGAAACTTATTT TAAGCGACTTAGGTTTATCCAAAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCAC CACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCC GCTGAACTTAAGCATATCAATA Chủng N.CT đƣợc xác định dựa quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào nhƣ có đƣợc số kết sinh hóa nêu phần 3.3 Trong phát sinh lồi dựa trình tự gen ITS rRNA, chủng N.CT nằm nhóm nguồn gốc di truyền với Candida tropicalis Chuỗi gen ITS rRNA chủng cho thấy độ tƣơng đồng 100% với lồi Candida tropicalis thơng qua BLAST Kết cho phép kết luận chủng N.CT Candida tropicalis gọi chủng Candida tropicalis N.CT Đƣợc biết C tropicalis phổ biến, đƣợc tìm thấy thực vật, số loại thực phẩm nhƣ hệ tiêu hóa động vật có vú Đây chủng nấm men an toàn cho ngƣời động vật, đƣợc ứng dụng nhiều cơng nghiệp sản xuất enzyme có khả sinh loại enzyme nhƣ amylase, metallo protease, xenlulase xylanase Ngồi ra, C tropicalis cịn đƣợc ứng dụng lĩnh vực khác khả tạo sinh khối sản xuất protein đơn bào (Single cell protein), tổng hợp tách chiết β-Glucan, chất kháng khuẩn (bacteriocin) [47, 48] Ngồi ra, chủng C tropicalis mà tơi nghiên cứu đƣợc phân lập từ số chế phẩm vi sinh nên có độ an tồn cao Từ cho thấy chủng nghiên cứu tuyển chọn đƣợc dùng tạo chế phẩm probiotic hồn tồn có sở 42 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Phân lập đƣợc 10 chủng nghi ngờ nấm men từ nguồn: Mẫu chế phẩm (Bcomplex, T&D, Vime – Bacilac), hoa lên men Đƣợc kí hiệu: N.TH, N.CP, N.CT, N.VM, NM1, NM2, N.BP, NM3, NM4, NM5 Tuyển chọn đƣợc chủng nấm men N.CT có tiềm ứng dụng làm Probiotic dựa kết nghiên cứu khả năng: Kháng vsv kiểm định, sinh enzyme ngoại bào, chịu đƣợc pH thấp, chịu muối mật,…Nghiên cứu đƣợc đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng nấm men đƣợc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học bổ sung thức ăn chăn nuôi định danh đƣợc chủng nấm men nghiên cứu Candida tropicalis N.CT 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu đƣợc ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển chủng nấm men tối ƣu đƣợc điều kiện ni cấy chủng - Tiếp tục hồn thiện quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm vi sinh từ chủng nghiên cứu - Thử nghiệm chế phẩm tạo quy mô lớn để đánh giá hiệu sử dụng chế phẩm làm sở cho sản xuất sử dụng chế phẩm phổ biến 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đào Thị Thanh Xuân, in Nghiên cứu sử dụng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lý môi trường nước nuôi thủy sản, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Hà Nội, 2008, pp 15 - 27, 32 - 35, 47 - 53 [2] Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu, "Nghiên cứu khả sống mơi trƣờng đƣờng tiêu hóa động vật số chủng VSV nhằm bƣớc chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics", 82 - 84, Tạp chí khoa học, Trƣờng Đại học Nơng lâm, Đại học Huế, 2009 [3] Hội Chăn nuôi Việt Nam, Probiotic - lợi ích triển vọng, Tạp chí chăn nuôi: tr.5 -9, 2008 [4] Kiều Hữu Ảnh, Giáo trình VSV Cơng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật: 100 -108, 1999 [5] Lê Khắc Quảng, Công nghệ EM - Một giải pháp phịng bệnh cho gia cầm có hiệu quả, Báo cáo chuyên đề khoa học, 2004 [6] Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng, Trƣơng Thị Hồng Vân, Võ Minh Sơn , "Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II kết thử nghiệm ao nuôi tôm," in Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003, pp 75 - 79, 2003 [7] Lƣơng Đức Phẩm, Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội: 112 -152, 2008 [8] Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ, in Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp.HCM, 2008, pp - 11, 17 - 19 [9] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I,II, III, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 1972, 1976, 1978 [10] Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thuỳ Châu, "Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic," in Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 251-255, 2003 [11] Phạm Hồng Sơn, Bùi Quang Anh, Giáo trình Bệnh truyền nhiễm thú y, NXB Đại học Huế, 2008 [12] Phạm Thị Trân Châu, Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, 2007 [13] Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, Công nghệ vi sinh môi trƣờng, NXB Giáo dục, 2009 [14] Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dƣơng Văn Hợp (2009), “Phân lập, tuyển chọn đánh giá đặc tính probiotic số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn ni”, in Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn nuôi - Số 16- Tháng 2/2009 [15] Trần Thị Ái Liên, "Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic," Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM, 2011, pp7- 9, 39 - 40 [16] Trần Thị Thu Thủy (2003), "Khảo sát tác dụng thay Kháng sinh probiotic phòng ngừa tiêu chảy E.coli heo con," in Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nơng nghiệp, Trƣờng ĐH Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh, 2003, pp 21 - 24, 28 - 43 [17] Văn Thị Thủy, Phân lập chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao ni cá tra, in Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Nông Lâm Tp HCM, 2011, pp 36, 52 - 54 Tài liệu tiếng Anh [18] Apajalahti J.H.A, L.K Sarkilabti, B.R.E Maki, J.P Heikkinen, P.H Nurminen and W.E Holben, Effective recovery of bacteria DNA and percent- guanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens, Appl Environ Microbiol: 64, pp 4084 - 4088., 1998 [19] Asli M.M., Hosseini S.A., Lotfollahian H., and Shariatmadari F Effect of probiotics, yeast, vitamin E and vitamin C supplements on performance and immune response of laying hen during high environmental temperature International Journal of Poultry Science, 6(12), (2007), 895900 [20] Breton J and Munoz A, Effects of probiotics in the incidence and treatment of neonatal diarrhea, 15th International Pig Veterinary Society Congress Nottingham University Press: pp 24-32, 1998 [21] Dai D., Nanthkumar N N., Newburg D S and Walker W.A , Role of oligosaccharides and glycol conjugates in intestinal host defense, J Pediatric Gastroenterol Nutr: 30, pp S23–S33, 2002 [22] FAO/WHO, Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Joint [23] Fontaine N., Meslin J C., Lory V and Andrieux C, Intestinal mucin distribution in the germ-free and in the heteroxenic rather boring a human bacterial flora: Effect of inulin in the diet, Br J Nutr: 75, pp 881–892, 1996 [24] Fuller R., Probiotics in man and animals, J Appl Bacteriol: 66, pp 65– 78, 1989 [25] Galassi G.; Sandrucci A.; Tamburini A.; Succi G., "Energy utilization of a low N-diet added with an antibiotic or with a probiotic in fattening pigs," in Animal physiology – Nutrition, Proceedings of the 15th symposium on energy metabolism in animals, Wageningen, p 145-148, 2001 [26] Garrity (G.M.), Bell (J.A.) And Lilburn (T.G.) (2004) Taxonomic Outline of the Procaryotes Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition., Release 5.0., Springer-Verlag, New York 401 pages DOI: 10.1007/bergeysoutline200405 [27] Ghasemi H.A., Tahmasbi A.M., Moghaddam Gh., Mehri M., Alijani S., Kashefi E., and Fasihi A The effect of phytase and Saccharomyces cerevisiae (Sc47) supplementation on performance, serum parameter, phosphorous and calcium retention of broiler chickens International Journal of Poultry Science, 5(2), (2006), 162-168 [28] Gibson G R and Fuller R., Aspect of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use, J Nut: 130, pp 391-395, 2000 [29] Gong J, Forster R J., Yu H., Chamber J.R., Sabour P.M., Wheatcroft R and Chen S., Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the muscosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen, FEMS Microbiol Lett: 208, pp - 7, 2002 [30] Havenaar, R and J.H.J Huis in't Veld, 1992 Probiotics: A General View In: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease, Wood, B.J.B (Ed.) Chapman and Hall, New York, USA., pp: 209-224 [31] Henrich S, Acute pancreatitis: ABCs, Ann Surg: 243, pp 154–168, 2006 [32] Hong H.A., Duc le, H., and Cutting, S.M., The use of the bacterial spore formers as probiotics, FEMS Microbiol Rev 29: pp 813 - 835, 2005 [33] McCracken V J and R G Lorenz, The gastrointestinal ecosystem: Aprecarious alliance among epithelium, immunity and microbiota, Cell Microbiol: 3, pp 1–11, 2001 [34] Navas Sánchez, Yannellys; Quintero Moreno, Armando; Ventura, Max; Casanova, Angel; Páez, Angel y Romero, Santos, Use of probiotics in the feeding of pigs in the postweaning phase, Revista Científica, 5(3): pp.193198, 1995 [35] Netherwood T, Gilbert H.J., Parker D.S and O’Donnell A.G., Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointetinal tract, Appl Environ Microbiol: 65, pp 5134-5138, 1999 [36] Ng S C., Hart A L., Kamm M A., Stagg A J and Knight S C., Mechanisms of Action of Probiotics: Recent Advances, Inflamm Bowel Dis: 15(2), pp 300 – 310, 2009 [37] Patterson J.A and Burkholder K.M, Application of prebiotics and probiotics in poultry production, J Animal Science: 82, pp 627-631, 2003 [38] Rolfe R.D., The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health, J Nutr: 130, pp 396S–402S, 2000 [39] Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K., Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam, Int J Syst Evol Microbiol: 59, pp 550-554, 2009 [40] Sander,M.E., Morelli, L and Tompkins, T A., Sporeformers as human probiotic: Bacillus, sporolactobacillus, and Brevibacillus, Comprehensive Review in food Science and food Safety 2: pp 101 - 110, 2003 [41] Savage D.C., Factors influencing biocontrol of bacterial pathogens in the intestine, Food Technol: 41, pp 82-97, 1987 [42] SCAN, "Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the Safety of Use of Bacillus Species in Animal Nutrition," European Commission Health & Consumer Protection Directorate-General., 2002 [43] Schat K.A and Myers T J., Avian Intestinal Immunity, Crit Rev Poult Biol: 3, pp 19–34, 1991 [44] Szajewska H., Horvath A., Piwowarczyk A Meta-analysis: The effects of Saccharomyces boulardii supplementation on Helicobacter pylori eradication rates and side effects during treatment (2010) [45] Vahjen W., Glaser V and Simon O., Influence of xylanase supplemented feed on the development of selected bacterial groups in the intestinal tract of broiler chicks, J Agr Sci.: 130, pp 489-500, 1998 [46] Zhu S.Y., Zhong T., Pandya Y and Joerger R D., 16S rRNA- based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens, Appl Microbiol: 68, pp 124–137, 2002 [47] Yanliang Bi, Chuntao Yang, Qiyu Diao, Yan Tu, “Effects of dietary supplementation with two alternatives to antibiotics on intestinal microbiota of preweaned calves challenged with Escherichia coli K99”, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, 100081 Beijing, China, 30/5/2017 [48] Anu Jose Mattam, Arindam Kuila, Niranjan Suralikerimath, Nettem Choudary, Peddy V C Rao, Harshad Ravindra Velankar,“Cellulolytic enzyme expression and simultaneous conversion of lignocellulosic sugars into ethanol and xylitol by a new Candida tropicalis strain”, 2016 [49] Saeedi M, Shahidi F, Mortazavi SA, Milani E, Yazdi FT (2015) Isolation and identification of lactic acid bacteria in winter salad (Local Pickle) during fermentation using 16S rRNA gene sequence analysis J Food Saf 35:287–294 PHỤ LỤC BẢNG Bảng PL1 Mật độ tế bào (CFU/ml) chủng tới giá trị pH thời gian khác Kí hiệu Thời gian (giờ) pH N.TH N.CT × 108 3,38 × 108 2,87 × 108 2,3 × 108 × 108 3,92 × 108 3,14 × 108 3,02 × 108 × 108 4,15 × 108 3,45 × 108 3,21 × 108 3,2 × 108 2,05 × 108 1,75 × 108 1,61 × 108 3,2 × 108 2,23 × 108 2,03 × 108 1,74 × 108 3,2 × 108 2,64 × 108 2,16 × 108 1,98 × 108 Bảng PL2 Mật độ tế bào (CFU/ml) chủng nồng độ muối mật thời gian khác Thời gian (giờ) Kí hiệu Nồng độ muối mật (%) 0,5 N.CT N.TH 3,2 × 108 2,96 × 108 2,77 × 108 2,59 × 108 3,2 × 108 2,61 × 108 2,38 × 108 2,13 × 108 3,2 × 108 2,35 × 108 2,05 × 108 1,94 × 108 3,2 × 108 2,13 × 108 1,83 × 108 1,66 × 108 0,5 × 108 4,62 × 108 4,53 × 108 4,38 × 108 × 108 4,16 × 108 3,82 × 108 3,64 × 108 × 108 3,71 × 108 3,43 × 108 3,14 × 108 × 108 3,36 × 108 3,07 × 108 2,67 × 108 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH a N.TH b N.CT c.N.BP d NM4 Hình PL1 Hình ảnh khuẩn lạc số chủng Nấm men