Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn salmonella s1

LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp ngƣời khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trƣờng đến nay, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Cơ Phịng Vi Sinh - Hóa Sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng ĐH Lâm Nghiệp Việt Nam với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập trƣờng Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Thị Minh Hằng nhiệt tình hƣớng dẫn em hoàn thành tốt báo cáo nghiên cứu khoa học Nếu khơng có lời hƣớng dẫn, dạy bảo thầy em nghĩ báo cáo khóa luận tốt nghiệp em khó hồn thiện đƣợc Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bƣớc đầu vào thực tế em hạn chế nhiều bỡ ngỡ, trình độ lý luận nhƣ kinh nghiệm thực tiễn cịn hạn chế Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp quý báu quý Thầy Cô để kiến thức em lĩnh vực đƣợc hoàn thiện hơn, giúp em học hỏi thêm đƣợc nhiều kinh nghiệm hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp tới Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 20 tháng năm 2018 Sinh viên thực Kim Thị Linh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Salmonella 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm Salmonella 1.1.4 Cấu trúc Salmonella 1.1.5 Yếu tố độc lực 1.1.6 Cơ chế gây bệnh 11 1.1.7 Nguồn gốc lây nhiễm 14 1.1.8 Tình hình nhiễm Salmonella nƣớc giới 15 1.2 Các phƣơng pháp phát Salmonella 17 1.2.1 Phƣơng pháp truyền thống 17 1.2.2 Phƣơng pháp đại 22 1.3 Các iện pháp iểm soát Salmonella thực ph m 27 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 29 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.3 Địa điểm thời gian nghiêm cứu 29 2.4 Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.5 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 29 ii 2.5.1 Vật liệu 29 2.5.2 Thiết bị dụng cụ 30 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.6.1 Phƣơng pháp hoạt hóa nhân giống chủng vi khu n Salmonella S1 31 2.6.2 Phƣơng pháp nhuộm Gram 31 2.6.3 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chủng Salmonella S1 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết xác định số đặc điểm sinh học chủng Salmonella S1 38 3.1.1 Hình thái khu n lạc 38 3.1.2 Hình dạng tế bào 38 3.2 Kết xác định số đặc điểm sinh hóa chủng Salmonella S1 39 3.2.1 Lên men đƣờng glucose, lactose 39 3.2.2 Khả sản sinh H2S 40 3.2.3 Khả phân giải Urea 41 3.2.4 Khả phân giải đƣờng Manitol 41 3.2.5 Khả lên men đƣờng Saccharose 43 3.6 Tính nhạy cảm với kháng sinh Gentamicin Sulfate 43 3.7 Nhận xét đặc tính sinh hóa đặc hiệu Salmonella S1 thu đƣợc 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT TÀI LIỆU TIẾNG ANH iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ATVSTP An toàn vệ sinh thực ph m BS Bismuth Sulphite Agar BPLS Birllian Green Phenol Red Lactose Sucrose BPW Buffered Pepton Water CLSI Clinical and Labolatery Standards Institute (Viện chu n mực DPF độc tố th m xuất chậm Delayed permeability facto HE Hektoen Entric Agar KS Kháng sinh kDa kiloDalton LT Heat-la ile toxin độc tố không chịu nhiệt LPS lipopolysaccharide LB Lysogeny Broth môi trƣờng nuôi khu n thông thƣờng MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) Lâm sàng xét nghiệm) RV Rappaport Vassiliadis RPF Độc tố th m xuất nhanh Rapid permeability facto ST Heat-sta le toxin độc tố chịu nhiệt TT Tetrathionate Muler Kauffmanm Borth TSI Triple Sugar Iron VSV Vi sinh vật VK Vi khu n XLD Xylose Lysine Deoxycholate iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Biểu đặc trƣng Salmonella test sinh hóa 22 Bảng 2.1 : Hóa chất dùng nghiên cứu 30 Bảng 2.2: Các thiết bị máy móc 30 Bảng 2.3: Các dụng cụ nghiên cứu 30 Bảng 2.4: Công thức môi trƣờng KIA 33 Bảng 2.5: Công thức môi trƣờng RSU 34 Bảng 2.6: Công thức môi trƣờng phân giải Manitol 35 Bảng 3.1: Kết nhận định tính sinh hóa Salmonella S1 44 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Vi khu n Salmonella [Wattal , C., Kaul, V, Chugh, T.T, Kler, N, Bhandari, S.K (1994)] Hình 1.2: Khu n lạc đặc trƣng Salmonella môi trƣờng XLD [Wu, S.X, Tang, Y (1993)] 20 Hình 1.3: Khu n lạc đặc trƣng Salmonella môi trƣờng HE [Wu, S.X, Tang, Y (1993)] 21 Hình 3.1: Khu n lạc Salmonella S1 sau ngày ni cấy 38 Hình 3.2: Tiêu Salmonella S1 phƣơng pháp nhuộm Gram 38 Hình 3.3: Hình ảnh lên men đƣờng glucose, lactose 39 Hình 3.4: Salmonella S1 lên men đƣờng glucose sinh H2S 40 Hình 3.5: Mơi trƣờng RSU trƣớc sau ni cấy 41 Hình 3.6: Mơi trƣờng Manitol trƣớc nuôi cấy 42 Hình 3.7: Mơi trƣờng Manitol sau ni 42 Hình 3.8: Kết lên men đƣờng saccharose 43 Hình 3.9: Kết đề kháng kháng sinh Salmonella S1 43 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực ph m trở nên cấp thiết, báo cáo cho thấy phần lớn vụ ngộ độc thức ăn ngƣời thức ăn gia xúc vi sinh vật Đã có nhiều cảnh áo nhƣng tình trạng ngộ độc thực ph m ngày leo thang, diễn biến phức tạp ngày nghiêm trọng cho ngƣời động vật vị nhiễm bệnh vi sinh vật gây nên Có nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực ph m gây bệnh lý đƣờng ruột, ví dụ nhƣ Salmonella, Clotridium butolinum, Escherichia Coli, Literia monocytogenes…Trong đó, Salmonella lồi vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, gây bệnh thƣơng hàn, nhiễm trùng huyết nhiều bệnh nghiêm trọng khác không ngƣời mà gia xúc, gia cầm hay lồi động vật khác Theo dự đốn WHO, tồn giới có 16 triệu ca bệnh thƣơng hàn hàng năm, nửa triệu số tử vong Riêng Việt Nam có nhiều trƣờng hợp ngộ độc hàng loạt trực khu n Salmonella, nhƣ Thành phố Đồng Hới với gần 250 ngƣời phải nhập viện từ ngày 14 tháng 10 năm 2015 ánh mì thịt, bánh mì trứng nhiễm khu n, gần 800 công nhân Tiền Giang phải nhập viện từ ngày tháng 10 năm 2013.Tại TP Hồ Chí Minh, đợt giám sát thí điểm năm 2013, sau lấy 1.618 mẫu chợ đầu mối Bình Điên, Hóc Mơn, Thủ Đức phát Salmonella 30% mẫu thịt heo 45% mẫu thịt gà Các thực ph m đƣợc chế biến nhƣ thịt, cá, trứng, sữa, sảm ph m làm từ dừa ị nhiễm khu n Samonella Trƣờng hợp nhƣ quan An toàn thực ph m Canada cảnh báo ngƣời dân ngƣng dùng sản ph m dừa Diwa Brand Grated có nguy nhiễm khu n Salmonella(2013) Đây sản ph m dừa đông lạnh, xuất xứ từ Philippines, có ghi dành xuất kh u Sữa nhiễm hu n salmonella Pháp ảnh hƣởng đến 83 quốc gia 12 triệu hộp sữa đƣợc thu hồi (2018) Tuy nhiên việc thu hồi thực thách thức lớn ởi Lactalis, công ty sữa lớn giới, xuất h u sản ph m đến 83 quốc gia toàn giới từ châu u, châu Phi đến châu Á Vẫn đề nhiễm khu n ngộ độc thực ph m từ vi sinh vật đề lớn không nƣớc mà toàn cầu Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu độc tố, khả gây ệnh cách phát nhƣ cách phòng chống bệnh nhiễm vi khu n salmonella, thực nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Salmonella S1 ” để có nhìn tổng quan vi khu n Salmonella Chủng Salmonella chủng môn Vi Sinh – Hóa Sinh thuộc viện Cơng Nghệ Sinh học Lâm Nghiệp cung cấp CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Salmonella 1.1.1 Lịch sử phát - Năm 1874 nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả loại vi khu n nguyên nhân gây bệnh thƣơng hàn - Năm 1880 Karl Joseph E erth Ro ert Koch phát tác nhân gây bệnh sốt thƣơng hàn ngƣời - Năm1884, Georg Gaff y thành công việc cấy mầm bệnh môi trƣờng nuôi cấy khiết - Năm 1885 Slamon Smith ( Mỹ ) tìm đƣợc Salmonella từ lợn mắc dịch bệnh tả gọi tên Bacilus cholerasuis, gọi Salmonella Nhƣng sau Schweinittz Dorset 1903 chứng minh dịch bệnh tả loại virus gây nên xác định s.choleraesui vi khu n gây bệnh phó thƣơng hàn - Năm 1888 A.Garter phân lập đƣợc mầm bệnh từ thịt ị lách ngƣời bệnh, ơng gọi vi khu n Bacilus enteritidis ngày vi khu n đƣợc gọi S.enteritidis Vi khu n đƣợc gọi nhiều tên hác nhƣ: Bacterium enteritidis, Bacilus gartner, - Năm 1889 Klein phân lập đƣợc S.gallinarum Rettger phân lập đƣợc S.pullorum năm 1909 Trƣớc ngƣời ta cho hai loại vi khu n gây hai loại bệnh hác nên gọi chung bệnh phó thƣơng hàn gà (Typhus avium) ệnh có tên chung S.gallinarum-pullorum - Năm 1896 C.Archar Ro ensauded phân lập đƣợc vi khu n S.paratiphi equi S.paratyphi bacillus Ngày vi khu n đƣợc gọi S.paratyphi B đến năm 1898, S.paratyphi A tìm đƣợc N.Guyn H Keyser 1.1.2 Phân loại Về phân loại khoa học Salmonella đƣợc xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: enterobacteriaceae Giống: Salmonella lignieres 1900, Salmonella bongori, Salmonella enterica  Các loại Salmonella điển hình: - Salmonella typhi: Gây bệnh thƣơng hàn - Salmonella paratyphi: Gây bệnh phó thƣơng hàn - Salmonella cholera – suis: Gây nhiễm trùng máu - Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa  Một số chủng Salmonella khác: S.thompson, S.derby, S.newport, S.meleagnidis, S.anatum, S.panama, S.dublin, S.gallinarum, S.pullorum… Lúc đầu, loài Salmonella đƣợc đặt tên theo hội chứng lâm sàng chúng nhƣ S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thƣơng hàn, para = phó), theo vật chủ nhƣ S.typhimurium gây bệnh chuột (murine = chuột), sau ngƣời ta thấy lồi Salmonella gây nhiều hội chứng phân lập đƣợc nhiều lồi khác Vì lý mà chủng Salmonella phát đƣợc đặt tên theo nơi mà đƣợc phân lập nhƣ S.teheran, S.congo, S.lodon.[ BibekRay (2009)] Salmonella đƣợc chia thành chi phụ nhiều lồi, lồi lại có khả có chi phụ Ví dụ nhƣ lồi Salmonella enterica đƣợc chia thành loài phụ gồm S.enteria, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae S.indica Bằng kỹ thuật sinh học phân tử đại, nghiên cứu sau cho phép xếp tất loài Salmonella vào loài Mặc dù ý kiến đƣợc nêu nhƣng cách truyền thống đƣợc sử dụng quen thuộc có ý nghĩa riêng nên hơng đƣợc chấp nhận Do vậy, kết sau nhuộm vi khu n Gram dƣơng giữ đƣợc màu tím gentians, cịn vi khu n Gram âm bắt màu hồng fucshin  Tiến hành: - Làm tiêu mẫu cần nhuộm: Nhỏ giọt nƣớc cất lên lam kính sạch, sau lấy 1/3 khu n lạc dàn tan hoàn toàn giọt nƣớc - Cố định mẫu lửa đèn cồn: Cố định tiêu phiến kính cách hơ cao lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải mu bàn tay) Chú ý: nóng quá, hơ lâu, vi hu n biến dạng - Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể hay tím gentian nhuộm mẫu phút - Rửa nƣớc tối đa giây - Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) phút - Rửa rƣợu 10 giây - Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần không xuất thêm màu mẫu (khoảng phút) - Nhuộm tiếp với safranin fuchsin Thời gian: phút theo tài liệu - Rửa qua nƣớc, để khô - Soi dƣới kính hiển vi vật kính 100x có giọt dầu 2.6.3 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chủng Salmonella S1 2.6.3.1 Phân giải đường glucose, lactose sinh H2S  Thử nghiệm sinh H2S môi trƣờng KIA (Kiliger Iron Agar): Môi trƣờng KIA đƣợc sử dụng thử nghiệm khả sử dụng nguồn cacbon khác nhƣ glucose, lactose sinh H2S Dựa vào lên men glucose, lactose, sinh lƣu huỳnh để phân biệt thành viên lên men khơng lên men họ Entero acteriaceae Nhóm hơng lên men lactose thƣờng có huynh hƣớng gây bệnh đƣờng ruột  Về nguồn car on, môi trƣờng KIA chứa hai loại đƣờng 1% Lactose 0,1% glucose Khi cấy chủng vi sinh vật lên mơi trƣờng có a trƣờng hợp xảy tăng trƣởng VSV: 32 - Thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH môi trƣờng, thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng thạch nuôi cấy chuyển từ đỏ sang vàng - Thứ hai: Sử dụng lactose biến dƣỡng acid amin, tạo NH3, làm pH môi trƣờng tăng thị Phenol Red chuyển từ vàng sang đỏ Môi trƣờng chia phần đỏ/ vàng sau 18 – 24 nuôi cấy - Thứ ba: Không sử dụng hai đƣờng Acid amin nguồn dinh dƣỡng nhất, tạo NH3, giữ nguyên pH môi trƣờng, thị phenol red không đổi màu, thạch giữ ngun màu đỏ suốtq trình ni cấy - Nếu vi sinh vật có khả lƣu huỳnh thành H2S tạo kết tủa đen Các vi sinh vật thƣờng thuộc nhóm lên men glucose, khơng lên men lactose (đỏ/vàng) - Salmonella lên men đƣợc đƣờng glucose nên phần nghiêng mơi trƣờng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng  Về sinh hơi: Đa số dịng Salmonella có khả sinh H2S nên có xuất vệt màu đen mơi trƣờng Ngồi thấy rõ tƣợng sinh qua tƣợng làm vỡ thạch môi trƣờng bị đ y lên tạo khoảng trống ên dƣới đáy ống nghiệm  Tiến hành: Chu n bị mơi trƣờng KIA có pH = 6,8 0,2 Sau hi pha xong môi trƣờng đem chu n độ pH từ 6,8 ± 0,2 Bảng 2.4: Công thức ôi trƣờng KIA Khối lƣợng 20 g 20 g 1g 5g 0,5 g 0,5 g 15 g 0,0,25 g lít Hóa chất Pepton Lactose Glucose NaCl Feric ammonium citrate(FeSO4) Sodium thiosulfate Agar Phenol Red Nƣớc cất 33 Sau pha chu n độ xong pH đem hấp khử trùng 121 - Sau hấp khử trùng xong đổ môi trƣờng vào ống nghiệm ống ngiệm 3ml để nghiêng chờ cho ống nguội - Khi môi trƣờng nguội dùng que cấy nhúng cồn hơ nóng đỏ để nguội : Lấy lƣợng sinh khối lớn khu n lạc đƣợc chọn cấy thấu xuống đáy nghiệm ria bề mặt nghiêng - Sau cấy VSV xong nuôi 37 ủ từ 18 – 24 ủ đến 48 để theo dõi kết 2.6.3.2 Thử nghiệm khả phân giải Urea  Thử nghiệm khả phân giải urea: Đƣợc thực môi trƣờng urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Borth), chứa thị phenol red, chuyển từ màu vàng sang đỏ ( vùng chuyển màu pH 6.8 – 8,4)  Nguyên tắc: Sử dụng để phát khả phân cắt Urea thành ammonia hóa hoạt tính urea từ vi sinh vật kết mơi trƣờng bị kiềm hóa pH tăng lên NH3 đƣợc tạo  Tiến hành: Chu n bị môi trƣờng RSU(Rustigian – Stuart – Urea Borth) Có pH = 6,8 Bảng 2.5: Cơng thức trƣờng RSU Hóa chất Khối lƣợng Uera 20 g Cao nấm men 0,1 g K2HPO4 9,5 g KH2PO4 9,1 g Phenol Red 0,01 g Nƣớc cất lít - Sau hi pha xong môi trƣờng đem chu n độ pH từ 6,8 34 - Hấp khử trùng môi trƣờng đầu côn 20 - 100 121 20 phút, sau lấy để nguội - Tiến hành hút 100 dịch Salmonella nuôi lỏng lắc cho vào 30ml môi trƣờng RSU nguội lắc nuôi 37 48 - Mơi trƣờng có màu hồng nhạt 2.6.3.3 Thử nghiệm phân giải đường Manitol  Thử nghiệm lên men đƣờng đƣợc thực môi trƣờng lỏng chứa đƣờng Manitol thị Phenol Red  Nguyên tắc: Mơi trƣờng có chứa thị Phenol Red dùng để nhận biết phân giải đƣờng Manitol Nếu VSV lên men phân giải đƣờng tạo sản ph m phụ mang tính acid làm pH canh trƣờng hạ xuống Môi trƣờng từ màu đỏ cam chuyển sang màu vàng  Tiến hành: Công thức môi trƣờng: Bảng 2.6: Công thức ôi trƣờng phân giải Manitol Hóa chất Khối lƣợng Đƣờng Manitol 10 g Pepton 10 g NaCl 5g Phenol Red 0,025 g Nƣớc lít - Đem môi trƣờng tiến hành chu n độ pH = 6,8 – 7,5 - Sau hi pha xong môi trƣờng đem chia môi trƣờng vào lọ thủy tinh chịu nhiệt nhỏ, hấp khử trùng với đầu côn - Sau hấp xong để nguội môi trƣờng tiến hành nuôi lỏng Lắc dịch nuôi lỏng chứa lƣợng sinh khối lớn môi trƣờng LB lỏng Hút 100 dịch nuôi lỏng ơm vào lọ môi trƣờng hấp Sau ni lắc 37 24 quan sát 35 2.6.3.4 Phân giải Saccharose Mơi trƣờng để thử hoạt tính phân giải saccharose tƣơng tự môi trƣờng KIA nhƣng thay đƣờng lactose saccharose chứa đƣờng glucose  Về nguồn car on, môi trƣờng KIA chứa hai loại đƣờng 1% Saccarose 0,1% glucose Khi cấy chủng vi sinh vật lên mơi trƣờng có ba trƣờng hợp xảy tăng trƣởng VSV: - Thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH môi trƣờng, thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng thạch nuôi cấy chuyển từ đỏ sang vàng - Thứ hai: Sử dụng lactose biến dƣỡng acid amin, tạo NH3, làm pH môi trƣờng tăng thị Phenol Red chuyển từ vàng sang đỏ Môi trƣờng chia phần đỏ/ vàng sau 18 – 24 nuôi cấy - Thứ ba: Không sử dụng hai đƣờng Acid amin nguồn dinh dƣỡng nhất, tạo NH3, giữ nguyên pH môi trƣờng, thị phenol red không đổi màu, thạch giữ nguyên màu đỏ suốtquá trình ni cấy - Nếu vi sinh vật có khả lƣu huỳnh thành H2S tạo kết tủa đen Các vi sinh vật thƣờng thuộc nhóm lên men glucose, không lên men lactose (đỏ/vàng) - Salmonella lên men đƣợc đƣờng glucose nên phần nghiêng môi trƣờng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng  Về sinh hơi: Đa số dịng Salmonella có khả sinh H2S nên có xuất vệt màu đen mơi trƣờng Ngồi thấy rõ tƣợng sinh qua tƣợng làm vỡ thạch môi trƣờng bị đ y lên tạo khoảng trống ên dƣới đáy ống nghiệm 2.6.3.5 Khả đề kháng kháng sinh Một vi khu n đƣợc gọi đề kháng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khu n cao nồng độ ức chế đa số chủng vi khu n khác lồi Các mức độ MIC xác định cho tính nhạy cảm, tính trung gian tính đề háng lồi vi khu n Một số chủng đƣợc gọi đề kháng 36 nồng độ KS mà vi khu n chịu đựng đƣợc tăng cao tăng cao nồng độ háng sinh đạt đƣợc thể sau dùng thuốc  Đối với thử nghiệm khả háng háng sinh Salmonella S1 Đƣợc tiến hành môi trƣờng LB đặc, trải dịch VSV lên bề mặt thạch sau dùng phƣơng pháp đục lỗ thạch Sau nhỏ lƣợng kháng sinh vừa đủ kín lỗ thạch Kháng sinh đƣợc dùng thí nghiệm kháng sinh Gentamicin sulfate Nồng độ 40mg/ml Có hai trƣờng hợp xảy ra: - Thứ nhất: VSV nhạy cảm với kháng sinh Gentamicin sulfate nên phát triển phát triển đƣợc xung quanh lỗ thạch có kháng sinh - Thứ hai: VSV phát triển ình thƣờng xung quanh lỗ thạch 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết xác định số đặc điểm sinh học chủng Salmonella S1 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc Salmonella S1 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB đặc Sau 48 ta có kết nhƣ hình 3.1 Hình 3.1: Khuẩn lạc Salmonella S1 sau ngày ni cấy  Hình thái: Khu n lạc riêng rẽ màu trắng đục, hình trịn lồi, bờ đều, trơn láng Kích thƣớc – mm 3.1.2 Hình dạng tế bào Hình 3.2: Tiêu Salmonella S1 phương pháp nhuộm Gram 38  Hình ảnh Salmonella S1 qua phƣơng pháp nhuộm Gram: - Salmonella S1 vi khu n Gram (-) nên bắt màu tím hồng fucshin Vì lớp thành tế bào peptidoglycan vi khu n Gram âm mỏng Gram dƣơng thƣờng có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngồi Sau nhuộm với phức hợp tím kết tinh - lugol, mẫu đƣợc xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu, làm nƣớc lớp peptidoglycan thành tế bào Gram dƣơng, từ làm giảm khoảng trống phân tử khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím kết tinh – lugol bên tế bào Đối với vi khu n Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trị chất hồ tan lipit làm tan màng thành tế bào Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) giữ lại phức hợp tím kết tinh – lugol tế bào Gram âm bị khử màu bắt màu thuốc nhuộm fucshin Kết thu đƣợc nhƣ hình 3.1 Nhƣ vậy, chủng Salmonella S1 có dạng hình que, vi khu n Gram (-) 3.2 Kết xác định số đặc điểm sinh hóa chủng Salmonella S1 3.2.1 Lên men đƣờng glucose, lactose Thử nghiệm lên men glucose, latose sinh H2S môi trƣờng KIA (Kiliger Iron Agar) chứa thị phenol red có pH = 6,8 ± 0,2 Sau 18 – 24 nuôi cấy ta đƣợc kết nhƣ hình 3.3 Hình 3.3: Hình ảnh lên men đường glucose, lactose 39  Nhận xét: - ng nghiệm thứ nhất: Chỉ sử dụng glucose, làm giảm pH môi trƣờng, thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng thạch nuôi cấy chuyển từ đỏ sang vàng - Ở ống nghiệm thứ thấy phần thạch bị đ y hẳn lên khỏi đáy ống chứng tỏ có sinh - Ở ống nghiệm thứ hai: vi sinh vật có khả lƣu huỳnh thành H2S tạo kết tủa đen Và thấy ống nghiệm chia làm màu đỏ phần thạch ghiêng màu vàng phần đáy ống chứng tỏ Salmonella S1 thuộc nhóm lên men glucose, hơng lên men lactose (đỏ/vàng) - Vì phần nghiêng mơi trƣờng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng Nên Salmonella S1 lên men kỵ khí – đáy tạo sản ph m: Các acid hữu cơ, loại aldehyte, loại rƣợu, khí CO2 , H2, H2S lƣợng 3.2.2 Khả ản sinh H2S Thử nghiệm lên men glucose, latose sinh H2S môi trƣờng KIA (Kiliger Iron Agar) chứa thị phenol red có pH = 6,8 ± 0,2 Sau 18 – 24 nuôi cấy ta đƣợc kết nhƣ hình 3.4 Hình 3.4: Salmonella S1 lên men đường glucose sinh H2S 40 Salmonella S1 lên men glucose nên mơi trƣờng có màu vàng sinh khí H2S gây tƣợng vỡ thạch đ y thạch lên Khơng riêng có H2S đƣợc sinh mà hỗn hợp khí gồm CO2 , H2, H2S lên men glucose kỵ khí – đáy 3.2.3 Khả phân giải Urea  Thử nghiệm khả phân giải urea: Đƣợc thực môi trƣờng urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Borth), chứa thị phenol red, chuyển từ màu vàng sang đỏ ( vùng chuyển màu pH 6.8 – 8,4) Sau ni lắc 37 48 lấy ình mơi trƣờng quan sát ta có kết sau: Hình 3.5: Mơi trường U trước sau ni cấy - Màu sắc môi trƣờng RSU trƣớc sau nuôi cấy hông thay đổi màu hồng nhạt Chỉ có canh trƣờng đục sinh hối VSV phát triển (nhƣ hình 3.5) - Chứng tỏ Salmonella S1 không phân giải urea nên môi trƣờng không bị kiềm hóa hơng làm thay đổi màu sắc môi trƣờng 3.2.4 Khả phân giải đƣờng Manitol  Thử nghiệm lên men đƣờng đƣợc thực môi trƣờng lỏng chứa đƣờng Manitol thị Phenol Red Sau nuôi lắc 37 kết : 24 ta có - Mơi trƣờng an đầu màu đỏ cam sau 18 - 24 nuôi lắc đổi màu vàng tƣơi Chứng tỏ Salmonella S1 phân giải đƣờng manitol tốt 41 Hình 3.6: Mơi trường Manitol trước ni cấy Hình 3.7: Mơi trường Manitol sau nuôi Sau nuôi lắc 24 nuôi lắc chủng Salmonella S1 phân giải đƣờng manitol tạo sản ph m phụ mang tính acid làm hạ pH môi trƣờng pH < 6,8 khiến môi trƣờng chuyển từ màu đỏ cam sang vàng pH an đầu môi trƣờng từ 6,8 – 7,5 Kết thí nghiệm sinh acid (+) mơi trƣờng màu đỏ cam -> vàng , sinh (-) xuất bọt khí 42 3.2.5 Khả lên en đƣờng Saccharose  Sau nuôi 37 48 ta có kết sau: Hình 3.8: Kết lên men đường saccharose - Môi trƣờng bị phân màu rõ rệt ống 1, ống 3, ống Chứng tỏ VSV lên men glucose mà khơng lên men saccarose - ng 1, 3, có xuất khoảng trống dƣới đáy ống nghiệm chứng tỏ có tƣợng sinh - Bắt đầu thấy xuất đốm đen sinh ết tủa lƣu huỳnh 3.6 Tính nhạy cảm với kháng sinh Gentamicin Sulfate  Đối với thử nghiệm khả nhạy cảm với kháng sinh Salmonella S1 Đƣợc tiến hành môi trƣờng LB đặc Sau 48 ni 37 ta có kết sau: Hình 3.9: Kết đề kháng kháng sinh Salmonella S1 43 - Xuất vòng tròn quanh lỗ thạch đục có chứa kháng sinh Gentamicin sulfate nồng độ 40 mg/ml Vậy Salmonella S1 nhạy cảm với kháng sinh Gentamicin sulfate nên Salmonella S1 phát triển xung quanh lỗ thạch có chứa kháng sinh nên xuất vòng tròn xung quanh lỗ đục Kháng sinh ức chế phát triển Salmonella 3.7 Nhận xét đặc tính inh hóa đặc hiệu Salmonella S1 thu đƣợc Bảng 3.1: Kết nhận định tính sinh hóa Salmonella S1 Tính chất sinh hóa Dƣơng âm tính Lên men lactose - Lên men saccharose - Lên men glucose + Lên men glucose sinh + Sinh H2S + Phân giải urea + Lên men manitol + Đề kháng kháng sinh - 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian thực đề tài, kết thu đƣợc nhƣ sau: - Đã nuôi cấy đƣợc chủng vi khu n Salmonella S1 môi trƣờng LB đặc - Chủng Salmonelal có khu n lạc nh n, tròn, lồi, màu trắng đục ngả vàng, ích thƣớc 2-5mm - Chủng Salmonella S1 có hình que bắt màu Gram âm - Chủng Salmonella S1 có số đặc điểm hóa sinh nhƣ sau:  Lên men đƣờng glucose  Sản sinh H2S  Không lên men đƣờng lactose, saccharose  Phân giải tốt đƣờng manitol  Nhạy cảm với kháng sinh Gentamicin Sulfate  Không phân giải Urea Kiến nghị Do thời gian ngắn nên chƣa thể hồn thành thí nghiệm để xác định đặc tính sinh hóa khác Salmonella S1 phân lập chúng: - Thử nghiệm khả sinh Indol - Thử nghiệm môi trƣờng LDC - Khả phân giải Gelatin salmonella S1 - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ( PH, nhiệt độ, dinh dƣỡng, thời gian, ) để tạo môi trƣờng tối ƣu cho Salmonella S1 - Phân lập phát Salmonella S1 từ phân gà nguồn thực ph m khác theo cách truyền thống phƣơng pháp PCR đại 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn vi sinh vật trƣờng đại học y Hà Nội (2007), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội Bộ y tế (2008), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội Trần Linh Phƣớc (2009), phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục, Hà Nội Khóa luận tìm hiểu vi khu n Salmonella, Nguyễn Hữu Liêm(2012) TÀI LIỆU TIẾNG ANH Bibek Ray (2009), FUNDAMENTAL FOOD MICROBIOLOGY, Boca Raton London New York Washington, D.C, USA Camilla Giammarini and Mauro Magnani, Listeriolysin O from Listeria monocytogenes, Diatheva, Centre for Biotechnology, University of Urbino, Italy Cynthia L.Sears and James B.Kaper (1996, Enteric Bacterial Toxins: Mechanisms of Action and Linkage to Intestinal Seccretion, American Society for Microbiology FAO and WHO (2009), Salmonella and Campylobacter in chicken meat Jame M.jay (2000), Modern Food Microbiology WHO, Risk assessments of Salmonella in eggs and broiler chickens Wu, S.X, Tang, Y (1993) Molecular epidemiologic study of an outbreak of Salmonella typhimurium infection at a Newborn Nursery China Med J Wattal , C., Kaul, V, Chugh, T.T, Kler, N, Bhandari, S.K (1994) An outbreak of multidrug resistant Salmonella tuphimurium in Delhi (India) J Med Res