Bước đầu nghiên cứu nhân giống xoan ta (melia azedarach linn) bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào

LỜI NĨI ĐẦU Để hồn thành chƣơng trình học tập (2005-2009) giúp sinh viên làm quen với công tác nghiên cứu Đƣợc đồng ý ban chủ nhiệm khoa Lâm học môn Giống & CNSH Tôi tiến hành thực đề tài tốt nghiệp: “Bước đầu nghiên cứu nhân giống Xoan ta (Melia azedarach Linn) công nghệ nuôi cấy mô tế bào.” Bằng tinh thần học hỏi, nghiêm túc công việc, đến khóa luận hồn thành Để có đƣợc thành nhƣ vậy, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn đến KS Kiều Văn Thịnh ThS Đoàn Thị Mai bảo, hƣớng dẫn nhiệt tình suốt q trình học tập làm khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Lâm học, môn Giống CNSH- Trƣờng Đại học Lâm nghiệp bảo, giúp đỡ cho tơi q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn cán viên chức thuộc Trung tâm nghiên cứu giống rừng tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực tập Giúp tơi hồn thành tốt đợt thực tập Trung tâm Sau , xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè ln quan tâm, động viên suốt trình học tập thực Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành lời chúc sức khỏe! ĐHLN, ngày 15 tháng năm 2009 Sinh viên thực Đồng Thị Ƣng ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thập niên trƣớc đây, việc trồng rừng chủ yếu nhằm mục đích phủ xanh trồng rừng sản xuất lại địi hỏi có suất cao Vì cơng tác giống có vai trò quan trọng Tuy nhiên sau chọn đƣợc trội ƣu việt, cần xác định đƣợc phƣơng pháp nhân giống thích hợp để nhanh chóng cung cấp giống tốt cho sản xuất sản xuất đại trà Nhân giống phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật (vi nhân giống) công cụ hiệu để đáp ứng nhu cầu Bằng phƣơng pháp dùng chồi non, mầm, vỏ cây, chí từ bao phấn nhị để tạo thành với hệ số nhân giống cao; nuôi cấy mơ thƣờng đƣợc trẻ hóa cao độ, bệnh mang đầy đủ đặc tính tốt lấy vật liệu ban đầu Xoan ta (Melia azedarach Linn) loài trồng quen thuộc với nhân dân ta có giá trị kinh tế cao, nhƣng trƣớc chƣa đƣợc ý tới Đây loài mọc nhanh, thƣờng đƣợc tái sinh phục hồi đất sau nƣơng rẫy; sinh trƣởng nhanh thích nghi với nhiều loại đất Xoan đa tác dụng: gỗ dùng làm đồ xây dựng, làm phân xanh, hạt ép lấy dầu, vỏ làm thuốc… Trƣớc nhu cầu lớn gỗ, bao gồm gỗ xây dựng, gỗ nguyên liệu sản xuất đồ mộc, hàng xuất ngày tăng nhanh; từ trƣớc đến nguồn cung cấp loại nguyên liệu chủ yếu từ rừng tự nhiên nhập Các nghiên cứu chọn nhân giống rừng gần thƣờng tập trung vào số đối tƣợng nhập nội, mọc nhanh,… Các nghiên cứu gỗ lớn địa thiếu Mặt khác nhân giống công nghệ nuôi cấy mô tế bào việc đảm bảo mặt di truyền, cịn cung cấp đƣợc số lƣợng lớn giống có chất lƣợng cho trồng rừng Do hƣớng nghiên cứu mở rộng nhân, gây trồng loài Xoan ta việc làm cần thiết có ý nghĩa việc bổ xung thêm vào cấu loài trồng rừng kinh tế Với mong muốn góp phần vào cơng tác nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình chọn tạo nhân giống hoàn chỉnh Đƣợc đồng ý ban chủ nhiệm khoa Lâm Học giáo viên hƣớng dẫn Tôi tiến hành thực đề tài: “Bước đầu nghiên cứu nhân giống Xoan ta (Melia azedarach Linn) công nghệ nuôi cấy mô tế bào.” PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nhân giống nuôi cấy mô - tế bào Nhân giống nuôi cấy mô - tế bào thực vật (vi nhân giống) phƣơng pháp sản xuất hàng loạt (bản sao) từ phận nhỏ (các quan, mô, tế bào) cách nuôi cấy chúng môi trƣờng nhân tạo điều kiện vô trùng có mơi trƣờng thích hợp đƣợc kiểm sốt nghiêm ngặt 1.1.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mơ- tế bào + Tính tồn tế bào (Totipotence) Năm 1902 nhà thực vật học ngƣời Đức Haberlandt lần đƣa quan niệm : “Mỗi tế bào sinh vật đa bào tiềm tàng khả phát sinh để thành thể hoàn chỉnh” Sinh học đại ngày quan niệm “Mỗi tế bào riêng rẽ dù đƣợc biệt hóa mức độ chứa đầy đủ thông tin di truyền (AND) đặc trƣng cho thể thực vật gặp điều kiện thuận lợi tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh” Sinh trƣởng phát triển thể thực vật, tổ chức quan đến mô gắn liền với sinh trƣởng phát triển tế bào Do vậy, đặc tính tế bào nhƣ phân hóa, phản phân hóa đặc tính quan trọng tế bào tính tồn tế bào thực vật sở lý luận vững để xây dựng nên kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật + Sự phân hóa phản phân hóa Sự phân hóa tế bào chuyển hóa tế bào phơi sinh thành tế bào mơ chun hóa đảm nhận chức khác thể Cơ thể thực vật trƣởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực chức cụ thể khác Tuy nhiên, tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào phơi sinh Q trình phân hóa thành quan biểu nhƣ sau: Tế bào phôi  tế bào dãn  tế bào phân hóa chức Q trình phân hóa phản phân hóa tế bào nhƣ q trình sống khác xảy theo chƣơng trình đƣợc mã hóa gen (AND) tế bào Các gen gen tế bào không hoạt động đồng thời mà đƣợc hoạt hóa hoạt động phần, làm xuất quan khác Những đặc điểm kiểu hình khác tƣơng ứng với giai đoạn trình phát triển cá thể Tuy nhiên, tế bào nằm khối mô quan thể chúng thƣờng bị tế bào xung quanh ức chế nên khơng xuất tính trạng Nếu tế bào đƣợc tách riêng rẽ gặp điều kiện mơi trƣờng thuận lợi gen đƣợc hoạt hóa q trình phân hóa xảy theo chƣơng trình đƣợc định sẵn gen 1.1.2 Các giai đoạn q trình nhân giống In vitro  Chọn vật liệu gốc ban đầu Mục tiêu giai đoạn tạo đƣợc nguồn mẫu tƣơng đối để phục vụ cho bƣớc Đây đƣợc xem bƣớc khởi đầu q trình hóa vật liệu để ni cấy Vật liệu ban đầu đƣợc đƣa khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với mơi trƣờng Đồng thời giảm bớt khả nhiễm bệnh mẫu nuôi cấy chủ động công tác giống  Ni cấy khởi động Sau có nguồn ngun liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu xử lý điều kiện vô trùng Đặt mẫu cấy vào môi trƣờng nuôi cấy Kết giai đoạn phụ thuộc vào việc chọn mẫu nuôi cấy, nguồn bệnh mơi trƣờng ni cấy Thơng thƣờng số hóa chất nhƣ: HgCl2, Ca(OCl)2, H2O2,…đƣợc sử dụng để khử trùng mẫu vật nuôi cấy Tùy thuộc vào vật liệu mà chọn loại hóa chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp Về ngun tắc, mơ ni cấy phận (thân, rễ, lá, hoa quả) nhƣng theo Bhatt mơ lấy từ phần non có khả nuôi cấy thành công cao mô lấy từ phận trƣởng thành khác Vì chồi đỉnh hay chồi nách thƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy in-vitro Yêu cầu đặt giai đoạn này: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô nuôi cấy sinh trƣởng ổn định phân chia khỏe  Tạo chồi nhân nhanh Đây giai đoạn quan trọng, đảm bảo sản sinh lƣợng tối đa mà đảm bảo sức sống chất di truyền Nó định thành cơng tồn q trình nhân giống Ở giai đoạn chất điều hịa sinh trƣởng có ý nghĩa lớn Khi mơi trƣờng đƣợc bổ sung Cytokinin có tác dụng kích thích tạo chồi  Tạo in-vitro hoàn chỉnh Tạo rễ giai đoan quan trọng để có đƣợc hồn chỉnh Thông thƣờng sau - tuần chồi xuất rễ trở thành hoàn chỉnh Mơi trƣờng tạo rễ có hàm lƣợng auxin tăng lên cytokinin giảm để tạo điều kiện cho rễ chồi Ngƣời ta thƣờng dùng chất NAA, IBA, IAA nồng độ - 5mg/lít để tạo rễ cho hầu hết loại trồng Trong số trƣờng hợp đặc biệt chồi tạo đƣợc nhỏ ngắn, phải bổ xung 15mg/lít GA3 số chất hữu nhƣ nƣớc dừa non,… bổ xung vào môi trƣờng để đạt tiêu chuẩn chuyển sang khu huấn luyện  Huấn luyện chăm sóc ngồi vườn ươm Cây đƣợc chuyển dần từ điều kiện nuôi cấy nhân tạo điều kiện tự nhiên Thông thƣờng tạo đƣợc huấn luyện cách tăng cƣờng độ chiếu sáng chuyển dần điều kiện chiếu sáng trời Tránh thay đổi đột ngột làm bị sốc chết Khi cứng cáp đạt tiêu chuẩn định chiêu cao, số số rễ thi đƣa giá thể Giá thể tiếp nhận in-vitro phải đảm bảo tơi xốp, thoáng nƣớc bệnh Cây sinh trƣởng ổn định bỏ giàn che tƣới nhƣ ƣơm từ hạt 1.1.3 Các nhân tố ảnh hƣởng tới trình nhân giống in- vitro  Môi trường nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc xem phần đệm để cung cấp chất dinh dƣỡng cần thiết cho tăng trƣởng phân hóa mơ suốt q trình ni cấy in- vitro Ngày có nhiều mơi trƣờng dinh duỡng đƣợc tìm nhƣ MS, WPM, B5,…; tùy thuộc vào đối tƣợng mục đích ni cấy mà lựa chọn xác định loại mơi trƣờng thích hợp Nhìn chung mơi trƣờng ni cấy có thành phần sau: − Mơi trường hóa học Cung cấp đầy đủ chất dinh dƣỡng chất cần thiết cho phân chia, phân hóa tế bào nhƣ cho sinh trƣởng bình thƣờng + Nguồn cacbon Mặc dù tế bào mơ ni cấy có khả quang hợp cố định CO nhƣng hiệu thấp Nhƣ vậy, để nuôi cấy mô tế bào thực vật ngƣời ta phải bổ xung vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon thích hợp Nguồn cacbon thƣờng dùng đƣờng saccarose, đƣờng maltose, glucose,…với hàm lƣợng khoảng 20 - 30mg/lít Nó giúp mơ tế bào thực vật tổng hợp hợp chất hữu cơ, làm tế bào tăng sinh khối, chất thẩm thấu mơi trƣờng + Nhóm nguyên tố đa lƣợng Là nguyên tố khoáng nhƣ: N, P, K, S, Mg, Ca đƣợc sử dụng nồng độ 30ppm Các nguyên tố có chức cung cấp nguyên liệu để mô tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc giúp cho trình trao đổi chất tế bào thực vật môi trƣờng đƣợc thuận lợi Việc lựa chọn thành phần hàm lƣợng khoáng cho đối tƣợng ni cấy khó, địi hỏi phải có kiến thức sinh lý thực vật dinh dƣỡng khống + Nhóm ngun tố vi lƣợng Là nguyên tố khoáng : Fe, Cu, Mo, Co, Mn, Bo…và đƣợc sử dụng nồng độ dƣới 30ppm Tuy đƣợc dùng vối nồng độ thấp nhiều so với nguyên tố đa lƣợng nhƣng chúng cần thiết cho phát triển mô tế bào Sắt yếu tố hỗ trợ phân chia tế bào, tham gia tổng hợp mRNA từ DNA Do thiếu Fe trình phân chia tế bào bị rối loạn Bo có tác dụng làm giảm chất ức chế auxin (các Auxinoxidase) Trong điều kiện thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo nhanh, nhƣng mô sẹo lại có độ xốp cao, mọng nƣớc hiệu suất tái sinh thấp + Các vitamin Vitamin hợp chất hữu có khối lƣơng phân tử tƣơng đối nhỏ, có chất hóa học khác nhau, đặc biệt cần thiết cho hoạt động sống bình thƣờng sinh vật dị duỡng Vai trị vitamin góp phần tạo co - enzyme xúc tác cho phản ứng sinh hóa tế bào, tăng khả sinh trƣởng mơ ni cấy Mặc dù in-vitro tự tổng hợp vitamin, nhƣng không đủ cho nhu cầu (Czocnowoki , 1952) Do để sinh trƣởng tối ƣu cần bổ sung thêm vitamin cần thiết vào môi trƣờng nuôi cấy với lƣợng định tùy theo hệ mô giai đoạn nuôi cấy Các vitamin thuờng đƣợc sử dụng: B1 (thiamin), B2 (riboplavin), B3 (nicotine acid), B6 (piridoxin), vitamin H (biotin), Myoinositon với nồng độ 0,1 - 1mg/lít + Nhóm chất hữu bổ sung Đƣợc dùng môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin khoáng chất, tác dụng kích thích sinh trƣởng mơ sẹo quan Các chất thƣờng dùng: nƣớc dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein Trong thành phần nƣớc dừa chứa axit amin, axit hữu cơ, đƣờng, ARN ADN, đặc biệt cịn chứa myoinositol, hợp chất có hoạt tính auxin, gluxit cytokinin quan trọng nuôi cấy mơ + Các chất điều hịa sinh trƣởng Sinh trƣởng phát triển đƣợc đảm bảo hai chế sinh lý trái ngƣợc nhau, tác nhân kích thích tác nhân ức chế Việc cân chất kích thích sinh trƣởng chất ức chế sinh trƣởng có ý nghĩa định việc điều hòa sinh trƣởng Chất điều hòa sinh trƣởng chất có chất hóa học khác khác nhau, nhƣng chúng có chức điều khiển sinh trƣởng phát triển thực vật suốt thời gian sống chúng Phytohormon chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc tổng hợp với hàm lƣợng nhỏ tổ chức mô để điều tiết trình sinh trƣởng phát triển Nhằm đảm bảo mối quan hệ hài hòa quan, phận Ngồi cịn ảnh hƣởng đến q trình lão hóa mơ nhiều q trình khác Các phytohormon chia thành nhóm: auxin, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid Chúng thành phần quan trọng môi trƣờng định đến thành cơng quy trình ni cấy Auxin: loại phytohormon có khả kích thích phân chia mạnh mẽ tế bào, giúp phát triển chiểu ngang kích thích rễ thực vật nhƣng lại kìm hãm phát triển chồi phụ Nhóm gồm chất nhƣ: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Napthyl acetic acid), Gibberellin: phytohormon đƣợc phát sau auxin Gebberellin chủ yếu đƣợc tổng hợp phôi phát triển, quan non Trong khoảng 20 loại hormone thuộc nhóm GA3 (Gibberellic Acid 3) quan trọng GA3 kích thích nảy mầm hạt, củ nên đƣợc sử dụng để phá ngủ nghỉ củ , hạt chồi nách GA3 giúp tăng trƣởng nhanh sinh khối thông qua việc kéo dài thân, lóng Ngồi cịn kích thích hoa, kích thích sinh trƣởng kéo dài cụm hoa rút ngắn thời gian sinh trƣởng dinh dƣỡng Cytokinin: đƣợc phát sau GA Auxin Đây loại phytohormon có tác dụng thúc đẩy phân chia tế bào, tạo chồi, rễ phụ; làm chậm lão hóa lá, tăng cƣờng chất dinh dƣỡng phía phận phát triển (Vũ Văn Vụ, 1983; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989) Các hợp chất thƣờng sử dụng là: Kinetin (6-Furfuryl aminopurine- C10H9NO5), BAP(6Benzyl amino purine), Zip(Izopentenyl adenin), Zeatin Trong Kinetin BAP chất thƣờng đƣợc sử dụng nhiều Bên cạnh đó, ngƣời ta chứng minh đƣợc tỉ lệ hàm lƣợng auxin/cytokinin đóng vai trị định việc phát sinh hình thái mơ ni cấy Để tạo rễ tỉ lệ cần lớn một, nhỏ mô biệt hóa theo hƣớng tạo chồi Cịn tỉ lệ auxin/cytokinin gần mẫu ni biệt hóa tạo mơ sẹo Trong ni cấy để kích thích nhân nhanh, ngƣời ta thƣờng sử dụng Cytokinin với nồng độ 10-6 - 10-4M Ethylen: Là chất có tác dụng kìm hãm hình thành chồi giai đoạn sớm nhƣng lại kích thích phát triển chồi giai đoạn muộn Auxin ethylen tác dụng tƣơng hỗ Auxin kích thích hình thành ethylen Auxin nồng độ thấp có chức kích thích nồng độ cao lại ức chế, ức chế sinh trƣởng auxin kích thích tổng hợp ethylen từ ethylen gây ức chế sinh trƣởng phát triển thực vật + Chất làm đông cứng mơi trƣờng Agar loại polysacharid tảo có khả ngậm nƣớc cao 612g/lít Độ thống khí mơi trƣờng thạch có ảnh hƣởng rõ rệt đến sinh trƣởng mơ ni cấy Ngồi ra, cần phải ý tới độ pH mơi trƣờng ảnh hƣởng trực tiếp đến khả hòa tan chất khống mơi trƣờng, ổn định mơi trƣờng, khả hấp thụ chất dinh dƣỡng Độ pH thấp (7,0) gây ức chế sinh trƣởng, phát triển mô Độ pH thƣờng đƣợc sử dụng ni cấy mơ nói chung từ 5,6 - 5,8 - Môi trường vật lý: Sự sinh trƣởng phát triển tế bào, mô đƣợc điều kiển kết hợp điều kiện vật lý phòng điều kiện dinh dƣỡng ống nghiệm Các yếu tố môi trƣờng vật lý đƣợc quan tâm nhiệt độ, ánh sáng độ ẩm Nhiệt độ: lồi có tốc độ sinh trƣởng tối đa nhiệt độ định, nhƣng thơng thƣờng nhiệt độ phịng ni cấy dao động khoảng 251oC Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng mẫu ni cấy Các lồi hay giai đoạn sinh trƣởng khác đỏi hỏi chế độ lƣợng chồi (trọng lƣợng cụm chồi giảm) Và từ bảng phân tích anova (phụ biểu 04) cho thấy kiểm tra ảnh hƣởng BAP đến chiều dài chồi (dịng PT3) có: FA = 45.284145 > F05 = 2,4300029, giả thuyết H0 bị bác bỏ Nhân tố BAP có tác động khơng đồng tới chiều dài chồi Ta có t = 2,78 > t05 = 1,96; giả thuyết H0 bị bác bỏ Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai rõ rệt ta chọn mơi trƣờng nhân chồi thích hợp MS* + 0,75mg/l BAP.Vì mà mơi trƣờng MS* có bổ sung 0,75mg/l BAP mơi trƣờng thích hợp mơi trƣờng MS* bổ sung 1,0mg/l BAP cm 6.47 5.88 5.5 4.91 4.81 3.91 BAP 0.25mg/l BAP 0.5mg/l 3.34 BAP 0.75mg/l 2.34 BAP 1.0mg/l Dòng PT3 Dòng BV2 Biểu 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến chiều dài chồi hai dòng Xoan hai dịng Xoan Dịng Xoan PT3 sử dụng mơi trƣờng MS* có bổ sung 0,75mg/l BAP cho số chồi/cụm (6,47) gấp 3,7 lần so với môi trƣờng ĐC (1,75 chồi/cụm) khơng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng; chiều dài chồi Xoan dòng PT3 (6,47cm) cao gấp 2,07 lần so với mẫu đối chứng Dòng xoan BV2 cho kết cao sử dụng môi trƣờng bổ sung 0,75mg/l BAP Mơi trƣờng cho 30 kết dịng BV2 (5,5 chồi/cụm) cao gấp 3,37 lần so với môi trƣờng ĐC (1,63 chồi/cụm) chiều dài chồi (5,95cm) gấp 1,84 lần mơi trƣờng ĐC (3,23cm) Bảng phân tích anova (xem phụ biểu 06) dòng BV2 ảnh hƣởng BAP chiều dài chồi ta có: FA = 25,896235 > F05 = 2,4300029; giả thuyết H0 bị bác bỏ Nhân tố BAP tác động không đồng lên chiều dài chồi Tính tốn tra bảng ta có t = 1,325 < t05 = 1,96; H0 đƣợc chấp nhận Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai khơng chênh lệch nhiều ta chọn mơi trƣờng nhân chồi thích hợp MS* + 0,75mg/l BAP MS* + 1,0mg/l BAP  Ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến khả nhân nhanh kéo dài chồi xoan ta Trong môi trƣờng nhân chồi cải tiến MS*có bổ sung kinetin mơi trƣờng MS* + 0,75mg/l Kn cho hiệu tốt Trong môi trƣờng nay, dòng PT3 cho số chồi/cụm (4,38) cao gấp 2,47 lần so với nhân chôi môi trƣờng đối chứng (ĐC – 1,77chồi/cụm); chiều dài chồi (3,83cm) gấp 1,2 lần môi trƣờng ĐC (3,23cm) số đốt lá/chồi (3,66) gấp 1,23 lần mơi trƣờng ĐC (2,97 đốt lá/chồi) Dịng BV2 cho kết cao nhân chồi mơi trƣịng Số chồi/cụm (3,38) cao gấp 2,07 lần so với nhân chôi môi trƣờng đối chứng (ĐC – 1,63chồi/cụm); chiều dài chồi (4,06cm) gấp 1,25 lần môi trƣờng ĐC (3,23cm) số đốt lá/chồi (4,13) gấp 1,24 lần môi trƣờng ĐC (3,34 đốt lá/chồi) 31 MS*+ 0.75mg/l BAP MS* + 0,25mg/l BAP Hình 3.2: Cụm chồi Xoan cm 4.5 4.38 4.25 3.59 3.5 3.38 3.25 2.97 2.78 2.56 2.5 1.5 Kn 0.25mg/l Kn 0.5mg/l Kn 0.75mg/l Kn 1.0mg/l 0.5 Dòng PT3 Dòng BV2 Biểu 3.4: Ảnh hƣởng nồng độ Kinetin đến chiều dài chồi hai dòng Xoan Dựa vào bảng anova (phụ biểu 05) kiểm tra ảnh hƣởng kinetin đến chiều dài chơi ta có: FA = 2,1972124 > F05 = 2,4300029; giả thuyết H0 đƣợc chấp nhận, nhân tố kinetin tác động đồng lên chiều dài chồi Bảng phân tích anova (phụ biểu 07) có: FA = 2,4705589 > F05 = 2,4300029 ; H0 bị bác bỏ Nhân tố kinetin tác động không đồng đến chiều dài chồi Tính tốn ta có: t = 0,304 < t05 = 1,96; Ho đƣợc chấp nhận Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai khơng chênh lệch nhiều vây ta chọn mơi trƣờng nhân chồi thích hợp MS* + 0,75mg/l Kn MS* + 0,5mg/l Kn Nhƣng kết thí nghiệm cho thấy BAP có hiệu kích thích phát sinh chồi in vitro cao Kinetin Ở môi trƣờng nhân chồi thích hợp nhất: mơi trƣờng MS* bổ sung 0,75mg/l Kn cho số chồi trung bình/cụm (4,38 dịng PT3, 3,38 dịng BV2), chiều dài chồi trung bình (3,83cm dòng PT3 4,06cm dòng BV2), 3,66 đốt lá/chồi (ở dòng PT3) 4,13 đốt lá/chồi (ở dòng 32 BV2) cao mơi trƣờng có bổ sung Kinetin Nhƣng so với mơi trƣờng MS* có bổ sung 0,75mg/l BAP thấp nhiều Mơi trƣờng nhân chồi thích hợp Xoan ta: MS* + 0,75mg/l BAP Kết thí nghiệm cho thấy sử dụng mơi trƣờng nhân chồi thích hợp dịng Xoan PT3 cho tiêu đánh giá cao dòng Xoan BV2 Dòng PT3 cho 6,47 chồi/cụm gấp 1,2 lần so với dòng BV2 đạt 5,5 chồi/cụm chiều dài chồi cao (6,47 dòng PT3- 5,95 dòng BV2) Hình 3.3: Chồi xoan mơi trƣờng MS* + 0,75mg/l BAP 3.4 Ảnh hƣởng IBA NAA đến khả rễ Xoan ta in vitro Chồi đƣợc nhân môi trƣờng nhân chồi thông thƣờng nhỏ (2.53cm) Do giai đoạn rễ ống nghiệm khâu vô quan trọng nhằm chuẩn bị cho tự hấp thụ nƣớc, quang hợp môi trƣờng tự nhiên Chồi in vitro cần tuần hồn chỉnh hệ thống rễ nhƣ lông hút, tƣợng tầng libe gỗ thứ cấp Vai trò giai đoạn vừa làm cho có kích thƣớc lớn, vừa giúp rễ (Debergh Maene, 1981) Auxin phytohormon có tác dụng sinh lý đến trình sinh trƣởng tế bào, hoạt động tầng phát sinh, hình thành rễ IBA (3-Indol butyric 33 acid), NAA (Napthyl acetic acid) hai auxin thƣờng đƣợc dùng nuôi cấy mô Môi trƣờng rễ xoan ta môi trƣờng MS* có bổ sung IBA NAA nồng độ từ 0,25mg/l đến 1.0mg/l để thấy đƣợc ảnh hƣởng IBA, NAA tìm mơi trƣờng rễ thích hơp cho xoan mơ Bảng 3.4: ảnh hƣởng IBA, NAA đến khả rễ hai dịng Xoan ta Cơng thức mơi trƣờng MS*+ IBA NAA ĐC Số mẫu cấy Dòng PT3 Dòng BV2 Tỷ lệ rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Số rễ/chồi Tỷ lệ rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Số rễ/chồi 0,25 32 54,17 5,21 4,63 51,04 5,25 5,09 0,5 32 69,79 5,19 4,84 68,75 5,02 5,09 0,75 32 76,04 6,51 5,44 72,92 6,1 5,72 32 60,42 5,83 4,5 57,29 5,58 4,5 0,25 32 42,71 3,71 3,66 39,58 3,75 3,94 0,5 32 48,96 3,81 3,69 46,88 4,23 3,88 0,75 32 58,33 3,61 3,66 54,17 3,58 3,91 32 52,08 3,3 3,19 48,96 3,56 3,31 32 33,33 3,01 2,69 35,42 3,02 3,22  Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Công thức môi trƣờng rễ MS* có bổ sung 0,75mg/l IBA cho tỷ lệ rễ trung bình (76,04% dịng PT3 72,92% dịng BV2), chiều dài rễ trung bình (6,51cm dịng PT3 6,1cm dòng BV2), số rễ/chồi cao vƣớt so với công thức môi trƣờng rễ cịn lại Trong mơi trƣờng MS* bổ sung 0,75mg/l IBA Dòng xoan PT3cho tỷ lệ rễ (76,04%) cao gấp 2,28 lần so với môi trƣờng đối chứng (33,33%) ; chiều dài rễ (6,51cm) gấp 2,16 lần môi trƣờng ĐC (3,01cm); số rễ/ chồi (5,44 –PT3) cao gấp 2,02 lần ĐC (2,69 rễ/chồi) 34 Dòng xoan BV2 đạt 72,92% tỷ lệ rễ cao 2,06 lần môi trƣờng ĐC (35,42%); chiều dài rễ (6,1cm) dài gấp 1,71 lần mơi trƣờng ĐC; số rễ/ chồi (5,72-dịng PT3) nhiều 1,78 lần môi trƣờng ĐC (3,22 rễchồi/) Tỷ lệ % 80 70 76.04 72.92 68.75 69.79 60.42 60 57.29 54.17 51.04 50 IBA 0.25mg/l IBA 0.5mg/l IBA 0.75mg/l IBA 1.0mg/l 40 30 20 10 Dòng PT3 Dòng BV2 Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng nồng độ IBA đến tỷ lệ rễ hai dòng Xoan ta hai dịng Xoan Kết bảng phân tích anova (phụ biểu 14) cho thấy: dịng PT3 có FA = 157,0593 > F05 = 3,47804969; giả thiết H0 bị bác bỏ Nhân tố IBA tác động không đồng đến tỷ lệ rễ Xác định công thức môi trƣờng tốt ,ta có t = 3,354 > t05 = 2,23 (k = 10); giả thuyết Ho bị bác bỏ Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai rõ rệt Công thức môi trƣờng có ảnh hƣởng đến tỷ lệ rế MS* + 0,75mg/l IBA Dòng BV2: FA = 54,132722 > F05 = 3,47804969; giả thiết Ho bị bác bỏ Nhân tố IBA tác động không đồng đến tỷ lệ rễ Tính tốn ta có t = 1,452 < t05 =2,23 (k = 10); giả thiết Ho đƣợc chấp nhận Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai không chênh lệch Công thức môi trƣờng rễ chọn MS* + 0.75mg/l IBA MS* + 0,5mg/l 35 Bảng phân tích anova dòng PT3 (phụ biểu 15) kiểm tra ảnh hƣởng nồng độ IBA đến chiếu dài rễ ta có: FA = 56,524654 > F05 = 2,43000229, giả thiết Ho bị bác bỏ Nồng độ IBA tác động không đồng đến chiều dài rễ Tính tốn ta đƣợc : t = 2,753 > t05 = 1,96; giả thuyết Ho bị bác bỏ Môi trƣờng tác động tốt đến chiều dài rễ MS* + 0,75mg/l IBA Dòng BV2: FA = 31,8298834 > F05 = 2,43000229 Giả thuyết Ho bị bác bỏ nhƣ IBA có tác động khơng đồng đến chiều dài rễ Ta có t = 1,764 < t05 = 1,96;giả thuyết Ho đƣợc chấp nhận Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai không chênh lệch Công thức môi trƣờng rễ chọn MS* + 0,75mg/l IBA MS* + 1,0mg/l  Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ Môi trƣờng rễ MS* cóbổ sung 0,75mg/l NAA cho tỷ lệ rễ trung bình, chiều dài rễ số rễ/ chồi cao Trong môi trƣờng MS* bổ sung 0,75mg/l NAA cho thấy: dịng PT3 có tỷ lệ rễ (58,33%) gấp 1,75 lần môi trƣờng ĐC (33,33%); chiều dài rễ (3,61cm) dài môi trƣờng ĐC (3,01cm); rễ phát triển nhiều (3,66 - dòng PT3) gấp 1,36 lần ĐC (2,96 rễ/chồi) Dòng BV2 đạt tỷ lệ rễ (54,17%) gấp 1,5 lần tỷ lệ rễ môi trƣờng ĐC (35,42%); rễ (3,58cm) phát triên môi trƣờng ĐC(3,02cm); số rễ/chồi Trong cơng thức mơi trƣờng MS* có bổ sung 0,25mg/l NAA cho tỷ lệ rễ trung bình đạt 42,71% (dịng PT3) 39,58% (dịng BV2), chiều dài rễ trung bình có đƣợc 3,71cm (dịng PT3) 3,75cm (dịng BV2), 3,66 rễ/ chồi (dòng PT3) 3,94 rễ/chồi (dòng BV2) thấp môi trƣờng thử Kiểm tra ảnh hƣởng nhân tố NAA đến khả rễ hai dịng xoan ta thơng qua phân tích phƣơng sai nhân tố Dòng PT3 (Phụ biểu 14) cho kết quả: FA = 52,302834 > F05 = 3,4780497; giả thiết Ho bị bác bỏ Nhân tố NAA tác động không đồng đến tỷ lệ rễ 36 Tính tốn ta thu đƣợc : t = 3,354 > t05 = 2,23 (k = 10);giả thuỷết Ho bị bác bỏ Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai rõ rệt Công thức môi trƣờng rễ tốt MS* + 0.75mg/l NAA Tỷ lệ % 60 58.33 54.17 52.08 50 48.96 46.88 48.96 42.71 40 39.58 NAA 0.25mg/l NAA 0.5mg/l NAA 0.75mg/l NAA 1.0mg/l 30 20 10 Dòng PT3 Dòng BV2 Biểu 3.6: Ảnh hƣởng nồng độ NAA đến tỷ lệ rễ hai dòng Xoan ta Đối với dòng BV2: FA = 25,848966 > F05 = 3,4780497; giả thuyết Ho bị bác bỏ Nhân tố NAA tác động không đồng đến tỷ lệ rễ Tính tốn ta đƣợc: t = 2,5 > t05 = 2,23 (k = 10);Ho bị bác bỏ Sai dị hai số trung bình lớn thứ hai rõ rệt Công thức môi trƣờng rễ tốt MS* + 0,75mg/l NAA Ngoài chiều dài rễ tiêu dƣợc quan tâm.bẩng anova (phụ biểu 16) dòng PT3 cho thấy: FA = 2,3927771 < F05 = 2,43000229; Ho đƣợc chấp nhận Nhân tố NAA ảnh hƣởngđồng lên chiều dài rễ Dòng BV2, bảng anova (phụ biểu 18) có: FA = 3,9000147 > F05 = 2,43000229; Ho bị bác bỏ Nhân tố NAA tác động không đồng đến chiều dài rễ Ta có t = 1,54 < t05 = 1,96; Ho đƣợc chấp nhận Sai dị hai số trung 37 bình lớn thứ hai không chênh lệch Công thức môi trƣờng rễ tốt MS* + 0,25mg/l NAA MS* + 0,5mg/l NAA Kết cho thấy: IBA NAA có ảnh hƣởng đến khả rễ Xoan mô Tuy nhiên mơi trƣờng rễ có bổ sung IBA cho hiệu rễ tốt môi trƣờng rễ có bổ sung NAA Ở mơi trƣờng rễ: môi trƣờng MS* bổ sung 0,75mg/l NAA cho tỷ lệ rễ trung bình (58,33% dịng PT3, 54,17% dịng BV2), chiều dài rễ trung bình (3,61cm dòng PT3 3,58cm dòng BV2), 3,66 rễ/chồi (ở dòng PT3) 3,91 rễ/chồi (ở dòng BV2) cao mơi trƣờng có bổ sung NAA Nhƣng so với mơi trƣờng MS* có bổ sung 0,75mg/l IBA thấp nhiều (bảng 3.4) Mơi trƣờng rễ thích hợp Xoan ta: MS* + 0,75mg/l IBA Hình 3.4: Chồi Xoan ta rễ mơi trƣờng MS*+ 0,75mg/l IBA 38 PHẦN 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã xác định đƣợc kỹ thuật nhân giống xoan ta in vitro với kết nhƣ sau: Loại hóa chất, nồng độ hóa chất khử trùng thích hợp cho Xoan ta HgCl2 nồng độ 0,1% thời gian khử trùng 15 phút − Dòng PT3 cho tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 16,3%, tỷ lệ mẫu nhiễm đạt 42,96% − Dòng BV2 Cho tỷ lệ mẫu bật chồi 15,56%, tỷ lệ mẫu nhiễm 51,11% Thời vụ khử trùng thích hợp để vào mẫu Xoan ta khoảng thời gian từ tháng đến tháng − Dòng PT3 khử trùng khoảng thời gian có tỷ lệ mẫu bật chồi 26,67% tỷ lệ mẫu nhiễm 59,26% − Dịng BV2 có cho kết tốt, tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 25,19% tỷ lệ mẫu nhiễm 68,15% Môi trƣờng trƣờng nhân chồi thích hợp cho Xoan ta mơi trƣờng MS* có bổ sung 0,75mg/l BAP Dịng PT3 cho hệ số nhân chồi đạt 6,47 chồi/cụm, dòng BV2 có hệ số nhân chồi 5,5 chồi/cụm; chồi phát triển đồng đều, mập Mơi trƣờng rễ thích hợp cho Xoan ta MS* có bổ sung 0,75mg/l IBA Sử dụng môi trƣờng cho tỷ lệ rễ đạt 76,04% (dòng PT3) 72.92% (dòng BV2); chiều dài rễ 6,51cm (dòng PT3) 6,1cm (dòng BV2); số rễ/chồi 5,44 (dòng PT3) 5,72 (dòng BV2) 39 4.2 Tồn Do thời gian thực đề tài có giới hạn, nên chƣa tiến hành đƣợc thí nghiệm xác định loại, nồng độ thời vụ khử trùng thích hợp cho dịng Xoan ta khác Chƣa tiến hành nghiên cứu đánh giá đƣợc khả sinh trƣởng phát triển xoan mơ ngồi vƣờn ƣơm đƣa vào trồng rừng kinh tế Chƣa xác định đƣợc mùa vụ rễ thích hợp, phƣơng pháp huấn luyện xoan mô 4.3 Khuyến nghị Tiếp tục thí nghiệm khử trùng vào mẫu với dịng xoan ta khác để tìm đƣợc loại, nồng độ hóa chât thời gian nhƣ thời vụ khử trùng tối ƣu cho Xoan Mở rộng nghiên cứu thêm môi trƣờng nhân chồi rễ cho dòng Xoan ta Nghiên cứu xác định mùa vụ rễ , phƣơng pháp huấn luyện Xoan mơ thích hợp Tiến hành nghiên cứu đánh giá sức sống Xoan mơ ngồi vƣờn ƣơm trồng rừng 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đinh Xuân Ái (2007) Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh in vitro xoan ta (Melia azedarach L.) phục vụ tạo giống chuyển gen Khóa luận tốt nghiệp Lê Mộng Chân - Lê Thị Huyền (2000) Thực vật rừng NXB Nông nghiệp Hà Nội Lê Thị Hạnh (2006) Nghiên cứu nhân giống Trầm hương (Aquilaria crassna) phương pháp ni cấy in vitro Khóa luận tốt nghiệp ĐHLN Đinh Thị Huyền (2006) Nghiên cứu nhân giống Vù hương (Cinamomun Balansea H.Lec) Tràm úc (Milaleuca leucadenra L) phương pháp ni cấy in vitro Khóa luận tốt nghiệp ĐHLN Lê Đình Khả Dƣơng Mộng Hùng (2003) Giống rừng NXB Nông nghiệp Ngô Kim Khôi - Nguyễn Hải Tuất - Nguyễn Văn Tuấn (2001) Tin học ứng dụng lâm nghiệp.NXB nông nghiệp Nguyễn Đình Sâm (1995) Sinh lí thực vật Trƣờng ĐH Lâm nghiệp Nguyễn Quang Thạch (1996) Công nghệ sinh học thực vật Trƣờng ĐH Nông nghiệp Nguyễn Đức Thành (2000) Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghíên cứu ứng dụng NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 10 Bùi Thị Tuyết Xuân (2008) Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh invitro xoan ta (Melia azedarach L.) thông qua đa chồi phục vụ công tác chuyển gen Khóa luận tốt nghiệp ĐHLN Tài liệu Tiếng Anh 11 L R Thakur, PS Rao, VA Bapat (1998) in vitro plant regeneration in Melia azedarach Plant cell reports 41 12 Silvia Vila, Ana Gonzalez, Hebe Rey and Luis Mroginski (2005) Plant regeneration origin, and development of shoot buds from root segments of Melia azedarach (Meliaceae) 42 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nhân giống nuôi cấy mô - tế bào 1.1.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô- tế bào 1.1.2 Các giai đoạn q trình nhân giống In vitro 1.1.3 Các nhân tố ảnh hƣởng tới trình nhân giống in- vitro 1.1.4 Những vấn đề nhân giống in-vitro 11 1.2 Các nghiên cứu Xoan ta 13 1.2.1 Đặc điểm nhận biết 13 1.2.2 Đặc tính sinh học sinh thái học 14 1.2.3 Phân bố 15 1.2.4 Giá trị 15 1.2.5 Các nghiên cứu chọn giống nuôi cấy mô - tế bào 16 PHẦN 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu: 17 2.2 Nội dung 17 2.2.1 Ảnh hƣởng chế độ khử trùng đến kết tạo mẫu 17 2.2.2 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi Xoan ta 17 2.2.3 Ảnh hƣởng IBA NAA đến khả rễ Xoan ta in - vitro 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Vật liệu môi trƣờng nuôi cấy 17 2.3.2 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm: 17 2.3.3 Phƣơng pháp luận 18 2.3.4 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm: 18 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu: 19 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 43 3.1 Ảnh hƣởng chế độ khử trùng đến kết tạo mẫu 22 3.2 Ảnh hƣởng thời vụ lấy mẫu khử trùng đến khả bật chồi Xoan ta 25 3.3 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi Xoan 28 3.4 Ảnh hƣởng IBA NAA đến khả rễ Xoan ta in vitro 33 PHẦN 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Tồn 40 4.3 Khuyến nghị 40 44