Tách dòng gen mã hóa cho eyme cinanamyl alcolhol dehydrogenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin từ cây bạch đàn urô trồng tại việt nam

Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Cơng nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Cường – Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học Ths Bùi Văn Thắng – Trung tâm Giống Công nghệ sinh học – Khoa Lâm học – Trường Đại học Lâm nghiệp tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hồng Hà, Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện đóng góp ý kiến quý báu cho thời gian thực tập Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn CN Hồng Hà tập thể cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tận tình giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới tồn thể thầy giáo Bộ mơn Giống Cơng nghệ sinh học, gia đình, bạn bè, người giúp đỡ, động viện khích lệ tơi suốt trình học tập Hà Nội, tháng năm 2009 Sinh Viên Đồng Thị Liên Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung bạch đàn urophylla 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phấn bố 1.1.3 Giá trị sử dụng 1.2 Lignin chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.3 Giới thiệu enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase 10 1.4 Cấu trúc chức gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 11 1.4.1 Cấu trúc 11 1.4.2 Chức 12 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng nghiên cứu 13 1.5.1 Kỹ thuật PCR 13 1.5.2 Kỹ thuật reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) 15 1.5.3 Kỹ thuật biến nạp plasmid vào E coli 16 1.5.4 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony-PCR) 17 1.5.5 Kỹ thuật tách dòng 17 1.5.6 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit 19 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu sinh học 20 2.1.2 Hóa chất thiết bị 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phƣơng pháp thiết kế mồi 21 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số 21 2.2.3 Phƣơng pháp khử DNA 22 2.2.4 Phƣơng pháp RT-PCR 23 2.2.5 Phƣơng pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen CAD 24 2.2.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli 25 2.2.7 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 26 2.2.8 Tách chiết plasmid 26 2.2.9 Phƣơng pháp cắt plasmid 27 2.2.10 Phƣơng pháp xử lý trình tự gen thu đƣợc 28 3.1 Kết thiết kế mồi 29 3.2 Kết tách ARN tổng số 29 3.3 Kết tối ƣu hóa phản ứng PCR 32 3.4 Kết gel 33 3.5 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α 33 3.6 Kết colony-PCR 36 3.7 Kết tách chiết plasmid 37 3.8 Kết cắt plasmid enzyme BamHI 38 3.9 Kết đọc trình tự gen CAD 39 3.10 Kết so sánh trình tự gen CADs 41 3.10.1 So sánh độ tƣơng đồng 41 3.10.2 Lập phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic Acid bp base pair cDNA Complementary DNA CTAB Cetyl-Trimethyl-Ammonium Bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid g/l gam/lít IPTG Isopropyl-thio-beta-D-galactoside Kb Kilobase KDa KiloDalton LB Luria Bertani mg/l miligam/lít OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease H RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris - Acetic acide - EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris – EDTA v/ph vịng/phút X-Gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Lignin hai loại polymer sinh học phổ biến cây, sau cellulose, ước tính lignin chiếm 30% lượng carbon hữu sinh Quá trình tổng hợp lignin cách thức thích nghi thực vật q trình tiến hóa thực vật thay đổi mơi trường sống từ nước lên cạn Lignin giữ vai trò quan trọng việc hình thành cấu trúc thành tế bào thân Thêm vào lignin tham gia vào q trình vận chuyển nước, chất dinh dưỡng thông qua hệ thống bao mạch giữ vai trò quan trọng việc đảm bảo chắn không gian, bảo vệ khỏi nhân tố gây bệnh Hàm lượng lignin cao gỗ giúp gỗ bền Bởi vậy, ngun liệu thơ tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất ) Nó cịn loại nhiên liệu hoàn hảo, đốt lượng tỏa từ lignin cao từ cellulose Tuy nhiên số lĩnh vực sản xuất sợi, sản xuất giấy hàm lượng lignin cao lại trở ngại Ví dụ cơng nghiệp xưa, ruột gỗ có hàm lượng lignin cao sử dụng để làm giấy lignin làm cho giấy chuyển mầu vàng theo thời gian Do lignin cần phải loại bỏ trước sử dụng để sản xuất giấy trắng chất lượng cao Vậy làm để điều chỉnh hàm lượng lignin theo hướng có lợi cho thân sinh vật người, như: tăng hàm lượng lignin trồng làm nhiên liệu, xây dựng, nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng lignin bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho trình sản xuất giấy Đã có nhiều nghiên cứu (chủ yếu nước ngồi) lignin, q trình sinh tổng hợp lignin, enzyme tham gia vào trình này, đa phần mơ hình (Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa) enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) Nhằm phục vụ cho nghiên cứu sâu Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học trình sinh tổng hợp lignin bạch đàn, bước đâu chúng tơi tiến hành đề tài: “Tách dịng gen mã hoá cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) tham gia vào trình sinh tổng hợp lignin từ bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) trồng Việt Nam” Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung bạch đàn urophylla 1.1.1 Nguồn gốc Bạch đàn nâu (Eucapyptus urophylla S.T Blake) chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), Sim (Myrtaces), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Hai mầm (Dicotyledones) Bạch đàn urơ có ngun sản Inđơnêsia (tập trung số đảo Flores, Adona, Pantar, Alor Wetar Timor) Lần bạch đàn urơ có mặt Việt Nam chương trình khảo nghiệm lồi xuất xứ bạch đàn năm 1979 vùng nguyện liệu giấy trung tâm Bắc Bộ 1.1.2 Phấn bố Bạch đàn nâu (Eucapyptus urophylla S.T Blake) phân bố từ 7o30 - 10o vĩ Nam 122o - 127o kinh Đông dốc núi thung lũng, loại đất bazan, diệp thạch phiến thạch, mọc vùng núi đá vôi Bạch đàn urô phân bố độ cao 300 – 2960 m so với mặt nước biển Nơi nguyên sản, bạch đàn urô cao 25 – 45 m, cá biệt cao 55 m, đường kính đạt từ – m Ở Việt Nam, bạch đàn người Pháp đưa vào trồng từ trước năm 1945 song việc trồng bạch đàn quy mô lớn năm 1960 Trong thời gian ngắn, bạch đàn phát triển mạnh mẽ trở thành số trồng rừng Việt Nam Theo số liệu Ban đạo kiểm kê rừng Trung ương (1999) diện tích rừng trồng lồi bạch đàn lớn so với loài khác, đạt 349.043 chiếm 24.03% so với tổng diện tích rừng trồng nước Trong rừng trồng bạch đàn loài 279.324 rừng trồng hỗn giao với loài khác 69.719 Vùng có diện tích trồng bạch đàn lớn Đông Bắc (88.341 ha), duyên hải Nam Trung Bộ (77.538 ha), Bắc Trung Bộ (67.910 ha), Đồng sông Cửu Long (58.643 ha), nhỏ vùng Tây Nguyên (10.556 ha) Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học 1.1.3 Giá trị sử dụng Bạch đàn urô đánh giá lồi có dáng đẹp, chất lượng gỗ tốt Tại nơi nguyên sản, gỗ bạch đàn sử dụng với nhiều mục đích.Tuy nhiên, bạch đàn urơ xem ngun liệu cho công nghiệp sản xuất giấy giới Việt Nam Hàng năm giới có khoảng triệu bột giấy sản xuất từ gỗ bạch đàn Bên cạnh đó, bạch đàn cung cấp loại sản phẩm hữu ích cho xã hội cột chống lị, loại gỗ thương phẩm có chất lượng cao làm nguyên liệu cho đồ mộc, sản xuất ván sợi, dăm xuất khẩu, gỗ xây dựng,… Ngồi ra, bạch đàn cịn dùng làm cảnh, trang trí, ni ong lấy mật, lấy tinh dầu, tananh chế biến dược phẩm 1.2 Lignin chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.2.1 Giới thiệu hợp chất lignin 1.2.1.1 Cấu tạo Lignin phức hợp dị polymer thơm tổng hợp từ ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol Ba loại đơn phân phân biệt với tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl M1H, coniferyl M1G sinapyl M1S alcohol Từ ba loại đơn phân này, chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) syringyl (S) phenylpropanoid tạo Các chất sau kết hợp lại để tạo phân tử lingin (hình 1) Khóa luận tốt nghiệp P- Coumaryl alcohol (H) Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Sinapyl alcohol (S) Coniferyl alcohol (G) Hình 1: Sự kết hợp ba đơn phân tạo thành phân tử lignin 1.2.1.2 Quá trình sinh tổng hợp Thành phần hàm lượng lignin khác loài, loại tế bào phân lớp vách tế bào thực vật, chúng thay đổi tác động môi trường giai đoạn phát triển Thơng thường, lignin từ lồi thực vật hạt kín hai mầm (cây gỗ cứng) bao gồm ba thành phần G, S H, lồi thực vật hạt trần (gỗ mềm) bao gồm G H Lignin từ loài mầm thường bao gồm hai thành phần G S với tỉ lệ thích hợp Thành phần H thường tồn nhiều loài hai mầm, thành phần hình thành kết hợp monolignol pcoumaryl alcohol M1H vào phân tử lignin thường hay bị nhầm với pcoumarate Y3 loại lignin bị acyl hóa tách chiết từ cỏ Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Mặc dầu nghiên cứu lignin thực từ lâu, q trình sinh tổng hợp lignin cịn tồn nhiều vấn đề cần giải Quá trình sinh tổng hợp monolignol (đơn phân tạo lignin) xây dựng nhiều lần đến vấn đề tranh cãi nhà khoa học Tương tự vậy, trình khử polymer hóa monolignol thành tế bào chủ đề nghiên cứu thảo luận Hình 2: Sơ đồ tổng hợp lignin 1.3 Giới thiệu enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase 10 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Hình 13: Sơ đồ vector pBT Trong trình nhân gen CAD, enzyme sử dụng cho phản ứng PCR Taq polymerase có tính tự gắn thêm nucleotide A vào đầu 5’ sản phẩm PCR q trình PCR Do sản phẩm PCR gắn đầu A bắt cặp bổ sung với đầu T vector pBT Điều tạo điều kiện cho việc nối sản phẩm PCR gen CAD vào vector pBT trở nên đơn giản hiệu cao Phản ứng nối xúc tác T4 DNA ligase Bước tiến hành biến nạp sản phẩm vector tái tổ hợp mang đoạn gen CAD tế bào vi khuẩn khả biến E coli DH5 phương pháp sốc nhiệt Sau đó, sản phẩm biến nạp cấy trải mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin, X-gal IPTG Sự có mặt X-Gal giúp cho việc chọn lọc dòng tế bào E coli mang vector tái tổ hợp cách dễ dàng Kết biến nạp trình bày hình 14: 34 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Cơng nghệ sinh học Hình 14: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp mơi trƣờng LB có bổ sung Ampicillin, X-gal IPTG Trên mơi trường có chứa kháng sinh ampicillin, X-gal IPTG, phát triển loại khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh khuẩn lạc màu trắng Tất khuẩn lạc khuẩn lạc biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh ampicillin Nhưng có khuẩn lạc màu trắng mang plasmid tái tổ hợp Vì vi khuẩn E coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn có gen lacZ hồn chỉnh sản xuất enzyme -galactosidase Enzyme phân huỷ chất X-gal có môi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất ngồi mơi trường bị oxy hố tạo thành màu xanh Nếu đoạn DNA ngoại lai xen vào gen lacZ gen bị phá hỏng, enzyme -galactosidase khơng tạo ra, có X-gal môi trường chất không bị thuỷ phân, không tạo nên dẫn xuất indol khuẩn lạc có màu trắng Để điểm tra xác khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CAD quan tâm, tiến hành sàng lọc kỹ thuật colonyPCR 35 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học 3.6 Kết colony-PCR Vì số lượng khuẩn lạc sau biến nạp nhiều (Hình 14), nên chúng tơi chọn ngẫu nhiên 19 khuẩn lạc trắng để thực phản ứng colonyPCR sử dụng cặp mồi CAD – R CAD – F Nếu khuẩn lạc có plasmid mang gen CAD sản phẩm PCR xuất băng có kích thước mong muốn khoảng 1114 bp Sản phẩm colony-PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% Đồng thời, nuôi khuẩn lạc vào 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin, để tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự Kết phản ứng colony-PCR thể hình 13 Từ kết điện di hình 13 cho thấy sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc đường chạy số 2, 3, 6, 7, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 19 cho kết âm tính, khơng xuất đoạn gen mong muốn dịng khuẩn lạc có màu trắng Ở đường chạy cịn lại kết dương tính Tuy nhiên, có đường chạy số 1, 12, 18 cho lên băng thấp 1114 bp, điều vectơ tự đóng vịng bị đứt gãy vài nucleotid làm dịch chuyển khung đọc, operon lac bị ức chế hoạt động, tế bào không tổng hợp enzym β – galactosidase Những đường chạy lại lên băng có kích thước khoảng 1114bp, phù hợp với kích thước mà chúng tơi dự tính Phương pháp loại nhiều khuẩn lạc mang plasmid không mong muốn Để khẳng định cách chắn kết cuối cùng, tiến hành tách plasmid khuẩn lạc có kết colony-PCR mong muốn cắt ezyme BamHI, sau xác định trình tự đoạn DNA gắn vào vector 36 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Cơng nghệ sinh học Hình 15: Kết điện di sản phẩm colony-PCR M: Thang DNA 1kb; – 20: 20 dòng BĐ 3.7 Kết tách chiết plasmid Tiến hành chọn số dịng có khuẩn lạc trắng đặc biệt dịng có kết colony-PCR dương tính tách plasmid theo kit QIAprep Spin Miniprep Khuẩn lạc thu cách ly tâm, hòa tan đệm P1 Do bổ sung Rnase vào dung dịch P1 nên sản phẩm tách plasmid khơng cịn ARN Các dung dịch P1, P2 có tác dụng phá vỡ thành tế bào, màng tế bào…và giải phóng thành phần tế bào Dung dịch N3 có tác dụng kết tủa protein, polysaccarit… tạo lớp trình ly tâm Hình 16: Kết điện di sản phẩm tách plasmit M: Thang DNA 1Kb 37 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Đây phương pháp tách plasmid ly tâm nên thu lượng plasmid cần thiết thời gian ngắn ( khoảng 30 phút) Sản phẩm plasmid có nồng độ khoảng 100 – 500 ng/µl đạt yêu cầu cho thí nghiệm Kết điện di hình 14 cho thấy sản phẩm tách plasmid tương đối sạch, đảm bảo chất lượng số lượng để tiến hành cắt đọc trình tự 3.8 Kết cắt plasmid enzyme BamHI Khi thực phản ứng gắn gen CAD vào vector pBT, điều kiện phản ứng chưa tối ưu hóa nên lượng nhỏ gen CAD chưa gắn vào vector tách dịng Những đoạn gen có mơi trường ni cấy với khuẩn lạc Chính vậy, thực phản ứng colonyPCR đoạn gen nhân lên trình tự mồi thiết kế nằm gen Nguyên nhân làm cho kết colony-PCR chưa thuyết phục Để khẳng định xác rằng: khuẩn lạc chọn mang đoạn gen CAD mong muốn ta tiến hành phản ứng cắt gen khỏi vector enzyme BamHI Kết thể hình 17 Hình 17: Kết điện di sản phẩm cắt enzyme BamHI M: Thang DNA 1kb; ĐC: SP colony – PCR 38 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Kết cho thấy: đoạn gen cắt khỏi vector có kích thước với kích thước đoạn gen có phản ứng colony-PCR (ĐC) kích thước gen mong muốn tách dịng 3.9 Kết đọc trình tự gen CAD Trình tự đọan gen CAD tách dòng phân tích hệ thống đọc trình tự tự động ABI PRIMS ®3100 Avant Genetic Analyzer phân tích, xử lý phần mềm DNAstar, Chromas BioEdit Khi phân tích kết đọc trình tự chúng tơi tìm vị trí đoạn mồi sử dụng để khuếch đại gen CAD mô tả mục 3.1 Trình tự thu sử dụng để so sánh với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI để kiểm tra liệu có phải đoạn gen mà chúng tơi quan tâm hay khơng Kết phân tích BLAST cho thấy trình tự có độ tương đồng cao với trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase phân lập từ bạch đàn Eucalyptus gunnii Như chúng tơi kết luận tách dịng thành cơng đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) bạch đàn Eucalyptus urophylla Vì trình tự CAD tách dịng từ bạch đàn uro, nên tiến hành việc đăng kí trình tự lên Ngân hàng gen quốc tế NCBI Kết đăng kí thành cơng trình tự đoạn gen Mã số đăng kí đoạn gen FN393570 Hình 18 định dạng điển hình cho trình DNA Ngân hàng gen NCBI với thông tin chi tiết người đăng kí thuộc tính gen bao gồm chiều dài gen 1159 bp, mã hóa cho protein có chiều dài 360 axit amin Trình tự gen mà chúng tơi tách dịng từ bạch đàn uro Eucalyptus urophylla S.T Blake dùng cho phân tích độ tương đồng với đoạn gen mã hóa cho enzyme CAD cơng bố lồi thực vật khác 39 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Cơng nghệ sinh học Hình 18: Thơng tin gen CAD đăng kí Ngân hàng gen quốc tế 40 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học 3.10 Kết so sánh trình tự gen CADs Chúng tơi sử dụng chương trình MegAlign phần mềm DNAstar để so sánh trình tự gen CAD phân lập với 26 trình tự gen CAD lồi khác cơng bố ngân hàng giữ liệu gen (NCBI) Bảng 7: Hệ số tƣơng đồng mức độ nucleotit gen CAD với 26 trình tự gen khác NCBI 3.10.1 So sánh độ tƣơng đồng 41 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Bảng kết thống kê độ tương đồng đoạn gen CAD tách dòng từ nghiên cứu (E_urophylla) với trình tự gen CAD lồi khác Trong trình tự bắt đầu bằng: At trình tự gen CAD phân lập từ Arabidopsis thaliana; Os trình gen CAD lúa; Nt trình gen CAD từ thuốc lá; Ptr trình gen CAD từ dương Hai trình tự phân lập từ bạch đàn gunnii globulus có kí hiệu E_gunnii E_globulus Hai trình tự Medicago sativa ngơ kí hiệu M_sativa Zea_may Kết trình tự E_urophylla có độ tương đồng lớn với hai trình tự gen bạch đàn Eucalyptus globulus (98,4%) Eucalyptus gunnii (97,6%) So sánh với loài khác trình tự E_urophylla có độ tương đồng thấp với trình tự NtCAD1_1 (35,1%) cao 73,8% với trình tự NtCAD14 3.10.2 Lập phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Maximum Parsimony kết hợp với phương pháp kiểm tra độ tin cậy Bootstrap Kết thể hình 19 Hình 19: Cây phát sinh chủng loại 42 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Cơng nghệ sinh học Hình 19 cho thấy phát sinh chủng loại chia thành ba nhánh lớn Ở nhánh bao gồm trình tự gen CAD loài bạch đàn xếp vào phân nhánh Ngồi nhánh cịn có trình tự gen NtCAD14 thuốc lá, AtCAD4 Arabidopsis thaliana, Os2g0187800 lúa ngô Hai nhánh cịn lại bao gồm trình tự dương, Arabidopsis thaliana, Medicago sativa trình tự gen CAD phân lập từ thuốc 43 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - So sánh phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mô thực vật cho thấy phương pháp Trizol thích hợp cho việc tách chiết RNA tổng số từ mẫu cây, sử dụng CATB tách chiết RNA tổng số từ mẫu gỗ bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) - Gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase khuếch đại thành công phản ứng PCR sử dụng mẫu cDNA tổng hợp từ mRNA tách chiết từ gỗ bạch đàn urô Nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR 580C Và đoạn gen CAD có chiều dài 1159 bp - Gen CAD bạch đàn urô tách dịng thành cơng vào vector tách dịng pBT Trình tự gen CAD phân tích đăng kí Ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số FN393570 - Phân tích độ tương đồng gen CAD phân lập từ bạch đàn urơ cho thấy gen có độ tương đồng cao với hai trình tự gen CAD phân lập từ hai loài bạch đàn khác Eucalyptus gunnii (97,6%) Eucalyptus globulus (98,4%) KIẾN NGHỊ Gen CAD tách dòng từ bạch đàn Eucalyptus urophylla S.T Blake nghiên cứu sử dụng nguyên liệu để thiết kế vector chuyển gen vào xoan ta (Melia azedarach Linn.) 44 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Đình Khả cộng tác viên (2003) Chọn tạo giống nhân giống cho số loài trồng rừng chủ yếu Việt Nam NXB Nông nghiệp Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000) Chọn gống bạch đàn Eucalyptus theo sinh trưởng kháng bệnh Việt Nam NXB Nông nghiệp Phạm Đình Sơn, Phạm Chiển (1990) Bạch đàn trồng rừng (bản dịch) NXB Nông Nghiệp Nguyễn Dương Tài (1994) Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn Eucalyptus urophylla S.T Blake vùng nguyện liệu giấy trung tâm Bắc Bộ, Việt Nam Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiêp Việt Nam TÀI LIỆU TIẾNG ANH Catherine Feuillet,Virginie Lauvergeat, Christine Deswarte, Gilles Pilate, Alain Boudet and Jacqueline Grima-Pettenati Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants (1995) Plant Molecular Biology 27: 615 – 667 Christian Pillonel, Marcel M Mulder, Jaap J Boon, Birgit Forster and Andres Binder (1991) Involvement of cinnamyl-alcohol dehydrogenase in the control of lignin formation in Sorghum bicolor L Moench Planta 185: 538 544 Etienne Paux, Victoria Carocha, Cristina Marques, Antonio Mendes de Sousa, Nuno Borralho, Pierre Sivadon and Jacqueline Grima-Pettenati (2005) Transcript profiling of Eucalyptus xylem genes during tension wood formation New Phytologist 167: 89-100 45 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học Goffner D Doorsselaere, J van, Yahiaoui, N., Samaj, J., Grima-Pettenati, J., Boudet, A M (1998) A novel aromatic alcohol dehydrogenase in higher plants molecular cloning and expression Plant Molecular Biology 36: 755-765 Isabelle Damiani, Nabila Yahiaoui, Kris Morree, Christiane Marque, Saïda Danoun, Joachim Kopka, Geert Goeminne, Eric Messens, Deborah Goffner, Wout Boerjan, Alain-Michel Boudet and Soizic Rochange (2005) Metabolite Profiling Reveals a Role for Atypical Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase CAD1 in the Synthesis of Coniferyl Alcohol in Tobacco Xylem Plant Molecular Biology 59: 753-769 10 Jozef Samaj, Simon Hawkins, Virginie Lauvergeat, Jacqueline GrimaPettenati and Alain Boudet (1998) Immunolocalization of cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD2) indicates a good correlation with cell-specific activity of CAD2 promoter in transgenic poplar shoots Planta 204: 437 – 443 11 Keichi Baba and Kazuya Ito (1997) Improvement on preparation of RNA from differentiating xylem tissue of Eucalyptus camaldulensis L Wood Research 84: 7-11 12 Lauvergeat V, Rech P, Jauneau A, Guez C, Coutos-Thevenot P, GrimaPettenati J, (2002) The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species Plant Molecular Biology 50: 497 – 509 13 Michael H Walter, Alain M Boudet and Jacqueline Grima-Pettenati, Christopher J Lamb (1990) Claude Grand, Extensive sequence similarity of the bean CAD4 (cinnamyl-alcohol dehydrogenase) to a maize malic enzyme Plant Molecular Biology 525-526 14 Mitchell, H J.; Hall, S A.; Stratford, R.; Hall, J L.; Barber, M S (1999) Differential induction of cinnamyl alcohol dehydrogenase during defensive 46 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học lignification in wheat Triticum aestivum L characterisation of the major inducible form Planta 208: 31-37 15 Nabila Yahiaoui, Christiane Marque, Kathryn E Myton, Jonathan Negre and Alain Michel Boudet (1998) Impact of different levels of cinnamyl alcohol dehydrogenase down-regulation on lignins of transgenic tobacco plants Planta 204: 8-15 16 Sambrook J and Russell D.W (1997) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Coldd Spring Habbor Laboratory Press TÀI LIỆU WEB 17 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 18 http://www.springerlink.com 19 http://www.kim-son.com/manbo/index 47 Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học 48