Đồ án môn công nghệ thực vật

Nghiên cứu này được thực hiện để nghiên cứu ảnh hưởng các nồng độ khác nhau của môi trường BAP (benylamino purine) đối với kích thích chồi in vitro của Hybanthus enneaspermus. Các giải thích thu được từ đầu chồi và các đoạn nút của các nghiên cứu về giống được cấy trên môi trường MS được bổ sung với các nồng độ BAP khác nhau (0,5, 1,0, 2,0 và 3,0mgl) và các môi trường nuôi cấy được ủ ở 25±2 C với chu kỳ quang 16 giờ (2000lux) được cung cấp bởi các ống huỳnh quang trắng mát mẻ. Độ pH của môi trường được điều chỉnh đến 5,8 trước khi hấp. Các môi trường nuôi cấy được nuôi cấy phụ trong khoảng thời gian 35 ngày trong cùng một môi trường để tạo ra nhiều chồi. Các cây được tái sinh của tất cả các giống được chuyển sang các hỗn hợp phân compost khác nhau để thích nghi. Phản ứng làm cứng tốt nhất thu được trong cát + đất + Vermicompost (1:1:1) sau ba tuần cấy ghép trong nhà kính. Những cây cứng này sau đó đã được chuyển vào cánh đồng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT NGHIÊN CỨU IN VITRO HYBANTHUS ENNEASPERMUS Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC VẬT GVHD: TS PHẠM MINH NHỰT LỚP: 20DSHA1 NHÓM: 07 THÀNH VIÊN NHÓM: LÊ LÂM HOÀNG ANH TRẦN VÕ TƯ TỶ 2081000010 20DSHA1 2011100711 20DSHA1 TP.HỒ CHÍ MINH, Ngày 12 Tháng 05 Năm 2023 MỤC LỤC I TÓM TẮT II GIỚI THIỆU Hybanthus enneaspermus III KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguồn mẫu Khử trùng mẫu 3 Cấy tạo mô sẹo Điều kiện nuôi cấy Thích nghi Chuyển vườn ươm Phân tích thống kê V KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VI KẾT LUẬN VII TÀI LIỆU THAM KHẢO MỤC LỤC BẢNG Bảng 1: Nồng độ BAP khác với môi trường MS Bảng Kết … BAP với môi trường MS tăng sinh chồi MỤC LỤC HÌNH Hình 1: Hybanthus enneaspermus Hình Các giai đoạn nhân giống in vitro H enneaspermus TÓM TẮT I Nghiên cứu thực để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khác mơi trường BAP (benylamino purine) kích thích chồi in vitro Hybanthus enneaspermus Các giải thích thu từ đầu chồi đoạn nút nghiên cứu giống cấy môi trường MS bổ sung với nồng độ BAP khác (0,5, 1,0, 2,0 3,0mg/l) môi trường nuôi cấy ủ 25±2 C với chu kỳ quang 16 (2000lux) cung cấp ống huỳnh quang trắng mát mẻ Độ pH môi trường điều chỉnh đến 5,8 trước hấp Các môi trường nuôi cấy nuôi cấy phụ khoảng thời gian 35 ngày môi trường để tạo nhiều chồi Các tái sinh tất giống chuyển sang hỗn hợp phân compost khác để thích nghi Phản ứng làm cứng tốt thu cát + đất + Vermicompost (1:1:1) sau ba tuần cấy ghép nhà kính Những cứng sau chuyển vào cánh đồng II GIỚI THIỆU Hybanthus enneaspermus Hybanthus enneaspermus (L.) F Muell, thuộc họ Violaceae, (ở Việt Nam có tên cỏ tím phòng) loại thảo mộc quý hiếm, lâu năm tìm thấy số vùng ấm bán đảo Deccan Ấn Độ Thường gọi Ratanpurus tiếng Tamil Orithaztamarai Bởi dân làng địa phương nhà thảo dược, loại thảo dược biết có đặc Hình 1: Hybanthus enneaspermus tính dược liệu độc đáo Nó phát triển lên đến 15-30cm tự nhiên Theo truyền thống, sử dụng chất kích thích tình dục, làm dịu viêm, thuốc bổ, thuốc lợi tiểu, nhiễm trùng tiết niệu, tiêu chảy, bệnh khí hư, khó tiểu vơ sinh Các chế phẩm làm từ thân mềm sử dụng thuốc thảo dược cho đặc tính kích thích tình dục, kháng viêm thuốc bổ Rễ thuốc lợi tiểu dùng quản lý bệnh lậu nhiễm trùng tiết niệu Trái sử dụng làm thuốc giải độc cho vết cắn bọ cạp rắn hổ mang cắn lạc yanadi Nó làm tăng ham muốn tình dục Đó thuốc kích thích tình dục thuốc bổ dinh dưỡng Một lượng nhỏ thảo dược dùng với sữa, hai lần ngày giúp thể đạt sức mạnh Nếu dùng 48 ngày, quan nội tạng thể phát triển khỏe mạnh mạnh mẽ Cụ thể, quan sinh sản trẻ hóa, trở nên mạnh mẽ sản xuất tinh trùng tăng lên Cuốn nhai có vị dẻo dính mịn giống ngón tay Dùng hàng ngày giúp chữa loét, xảy bệnh lây truyền qua đường tình dục chí AIDS Loại thảo mộc tốt cho kinh nguyệt hàng tháng phụ nữ vấn đề liên quan đến kinh nguyệt Loại thảo mộc bổ dưỡng làm mát thể III KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Một phương pháp tái sinh thực vật cho 2.0mg/l benzylamino purine (BAP) vòng tuần sau ủ Sự khác biệt chồi đạt từ mô sẹo nhỏ màu lục nhạt Việc bổ sung casein hydrolysate (500 mg/l) kali phosphat nhiều (1,86mmol/l) vào môi trường nuôi cấy làm tăng biệt hóa chồi Các tái sinh có hình thái đồng thể hạt giống bình thường Số lượng chồi/mô cao thu với giá trị pH ban đầu từ 5,5 đến 6,0 Tương tự vậy, khác biệt chồi xảy mô sẹo nhỏ gọn màu xanh nhạt H enneaspermus chuyển sang môi trường MS bổ sung 2,0mg/l BAP 0,5mg/l NAA; tỷ lệ phần trăm cao chồi hình thành mơ sẹo số lượng chồi cao đạt môi trường Các chồi H enneaspermus dài đến 4-5 cm vịng tuần Phản ứng cải thiện glucose sử dụng làm nguồn carbon cho trồng có hoa sử dụng nồng độ cao casein hydrolysate (500mg/l) kali photphat (1,86mmol/l) cho H enneaspermus Người ta quan sát thấy gia tăng nồng độ NAA làm tăng chiều dài chồi lên tới 8cm H enneaspermus nuôi cấy mô Rễ đạt môi trường 1/2 MS có chứa 1,0mg/l acid indole3-butyric (IBA) Trong ni cấy mơ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) thành phần môi trường quan trọng việc xác định đường phát triển tế bào thực vật Cytokinin benzylamino purine (BAP) Kinetin thường biết đến để làm giảm ưu mô phân sinh đỉnh gây hình thành chồi phụ chồi thích nghi từ mơ phân sinh Hybanthus enneapermus Phương pháp nuôi cấy Hybanthus enneapermus tối ưu đạt cách sử dụng BAP chất bổ sung cho môi trường Hiệu BAP so với Cytokinin khác việc tạo nhân lên môi trường nuôi cấy chồi báo cáo Hybanthus enneapermus BAP có tác dụng rõ rệt việc kích thích phát triển, hổ trợ tăng trưởng đầu chồi Theo quan điểm điều nói trên, thí nghiệm chủ yếu nhằm mục đích nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP khác với môi trường sở MS tối ưu hóa lượng BAP trình kích thích chồi tăng sinh chồi Hybanthus enneapermus nghiên cứu IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguồn mẫu Đối với nghiên cứu này, lĩnh vực phát triển H enneaspermus thu thập từ Bộ Nông nghiệp, Đại học Annamalai, Annamalainagar, Chidambaram Nam Ấn Độ Các mẫu thu thập từ chồi đoạn đốt để bắt đầu chồi Khử trùng mẫu Sau cắt bỏ, khử trùng bề mặt, phận cấy ghép chủ yếu rửa nước máy 30 phút sau rửa nhẹ ethanol 70% 60 giây với dung dịch natri hypoclorua 5% 10 phút Sau bước khử trùng, dụng cụ cấy rửa nước cất vô trùng ba lần Các quy trình khử trùng thực buồng cấy, tiệt trùng khơng khí laminar cách sử dụng 0,1% HgCl2 phút.Các dụng cụ cấy sau rửa năm lần nước cất vô trùng Cuối cùng, đặc buồng cấy lưu lượng khơng khí laminar, mẫu cắt thành mảnh nhỏ Cấy tạo mô sẹo Môi trường MS, bổ sung cytokinin auxin sử dụng đơn lẻ kết hợp Độ pH môi trường điều chỉnh đến 5,8 trước hấp, 0,6% agar (Himedia, Mumbai) thêm vào mơi trường Sau đó, trình hấp thực 121ºC 15psi 20 phút Tiếp theo, khử trùng cắt lát hồn tồn, mẫu cấy cấy vào mơi trường sau hấp để tạo mô sẹo Điều kiện nuôi cấy Sau cấy, môi trường nuôi cấy trì nhiệt độ 25±2ºC với chu kỳ quang 16 ngày Ánh sáng 80µEm-2s-1 cung cấp cách sử dụng ống huỳnh quang trắng nguội (Philips India Ltd.) Các loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP khác bổ sung với mơi trường MS để kích thích chồi tốt (Bảng 1) Môi trường MS mà không cần thêm chất điều hòa sinh trưởng thực vật dùng làm đối chứng Sau 35-45 ngày nuôi cấy, nhiều chồi tách thành mảnh nhỏ chuyển vào chai nuôi cấy 500ml chứa 50ml loại trung bình để tăng số lượng chồi Để bắt đầu tạo rễ, chồi chuyển sang môi trường MS 1/2 bổ sung IAA, IBA NAA Thích nghi Cây khỏe mạnh với rễ dài đến 7cm loại bỏ riêng lẻ khỏi bình ni cấy Sau rửa rễ cẩn thận nước máy, trổng vào chậu nhựa có đường kính 10cm chứa hỗn hợp cát, đất phân hữu (1:1:1) chúng đặt nhà kính để làm cứng Các tưới dung dịch muối MS ½ tuần phủ túi polythene tuần Sau đó, cứng dần chuyển đến chậu 20cm chứa đất vườn nguyên chất giữ cánh đồng để phát triển thành trưởng thành Chuyển vườn ươm Sau rễ, chuyển vào chậu nhỏ chứa tổ hợp cát, đất phân hữu khác điều kiện nhà kính 1-2 tháng Các thích nghi trở nên cứng cấy vào khu vực thử nghiệm để tăng trưởng phát triển Phân tích thống kê Tất thí nghiệm lặp lại lần Ảnh hưởng phương pháp nghiên cứu khác định lượng liệu phân tích thống kê cách sử dụng lỗi tiêu chuẩn giá trị trung bình cách sử dụng phần mềm SPSS V KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Bảng 1: Nồng độ BAP khác với môi trường MS Phương pháp điều trị Nồng độ (mg/l) MS+BAP 0,5mg/l MS+BAP 1,0mg/l MS+BAP 2,0mg/l MS+BAP 3,0mg/l MS+BAP 4,0mg/l Bảng Kết phương pháp điều trị khác BAP với môi trường MS tăng sinh chồi Phương pháp điều trị Số chồi (Trung bình ± SE) Chiều dài chồi (cm) (Trung bình ± SE) Đối chứng 0,83±0,19 1.33±0.18 MS+0.5mg/l BAP 3.17±0.22 1.98±0.19 MS+1.0mg/l BAP 8,50±0,24 3.83±0.22 MS+2.0mg/l BAP 11.28±0.37 6.68±0.37 MS+3.0mg/l BAP 10,34±0,32 6,12±31 MS+4.0mg/l BAP 4.52±0.31 5,36±0,24 Hình Các giai đoạn nhân giống in vitro H enneaspermus (a) Tái sinh chồi từ mơ sẹo (b) Bắt đầu hình thành nhiều chồi (c) Tăng số lượng nhiều (d) Hình thành rễ từ chồi tái sinh (e) Thích nghi phục hồi tái sinh KẾT LUẬN VI Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nồng độ BAP khác phát triển nhân chồi nghiên cứu Những kết kích thích chồi hình thành chồi nhiều với việc thực nồng độ khác BAP với môi trường MS trình bày (Bảng 2) Ngồi ảnh hưởng kiểu gen, tốc độ tăng sinh chồi kéo dài bị ảnh hưởng loại cytokinin nồng độ chúng Các cytokinin dựa adenine sử dụng số H enneaspermus Đối với nhân giống in vitro N6- benzylamino purine (BAP) cytokinin ưa thích Nồng độ cytokinin ngoại sinh dường yếu tố ảnh hưởng đến nhân lên Ví dụ, Wong (1986) tuyên bố 2,0mg/l BAP bổ sung môi trường, người số mơ tạo trung bình 2,4 chồi, tăng nồng độ BAP lên 2,0mg/l 3,0mg/l dẫn đến 2,6, 4,3 chồi bình tương ứng Tuy nhiên, nồng độ BAP khuyến nghị tối ưu 2,0mg/l vi sinh vật H enneaspermus Trong nghiên cứu phù hợp 2.0mg/l BAP cho thấy kết tốt so sánh với nồng độ thấp cao việc tạo chồi nhân chồi Do đó, nồng độ BAP khuyến nghị mức tối ưu để cảm ứng tăng sinh ống nghiệm H enneaspermus VII TÀI LIỆU THAM KHẢO K R Kirtikar B D Basu, Indian Medicinal Plants, Vol IV, B/S Bishen Singh Mahendra Pal Singh, Dehra-dun, 1981 SN Yoganarasimhan, Cây thuốc Ấn Độ, Tamil Nadu, Vol 2, Cyber Media, 2000 G Sudarsanam G Sivaprasad, 1995 Medical Ethnobotany of Plants used as Antidotes by Yanadi Tribes in South India, Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plants, Tập 3, số 1, 1995, pp 57-65 doi:10.1300/ J044v0 3n0 1_07 E Prakash, et al., 1999 Regeneration of Plants from Seed Derived Callus of Hybanthus enneaspermus L Muell., a Rare Ethnobotanical Herb, Plant Cell Report, Vol.18, pp 873-878 Prakash E, Sha PS, Vallikhan P, cộng 1999.  Tái sinh thực vật từ callus có nguồn gốc từ hạt Hybanthus enneaspermus (L.) Muell., thứ có thảo mộc ethnbotanical [J] J Plant Cell Reps, 18(10): 873-878 Priya DA, Ranganayaki S, Devi PS Tuyển tập báo cáo nghiên cứu khoa học quốc tế ngành y học dành cho bạn tham khảo đề tài: Phytochemical screening 7 and antioxidant potential of Hybanthus enneaspermus: A rare ethanobotanical herb J Pharm Res, 2011, 4(5): 1497-1502 Patel DK, Kumar R, Prasad SK, va ̀ cô ̣ ng sư ̣ Khả chống oxy hóa chống đái tháo đường in vitro Hybanthus enneaspermus (Linn) F Muell chuột tiểu đường streptozotocin gây [J] Asian Pac J Trop Bio Med, 2011, 1(4): 316-322 The Wealth of India: A Dictionary of Indian Raw Materials and Industrial Products-Raw Materials Series (ấn 2) New Delhi: Tổng cục Xuất Thông tin, CSIR, 1959 Murashige, T F Skoog 1962 Tuyển tập báo cáo nghiên cứu khoa học quốc tế ngành y học dành cho bạn tham khảo đề tài: A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures Physiol Nhà máy 15: 473-497 SPSS, 1999 Gói thống kê cho Khoa học Xã hội (SPSS) V.11.5 cho Windows Illinos, Hoa Kỳ: SPSS Inc