Thiết lập phản ứng multiplex pcr chẩn đoán một số mầm bệnh ký sinh trùng đường máu trên chó, mèo

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG MULTIPLEX – PCR CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ MẦM BỆNH KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU TRÊN CHÓ, MÈO HÀ NỘI – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG MULTIPLEX – PCR CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ MẦM BỆNH KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU TRÊN CHÓ, MÈO Ngƣời thực : TRỊNH THỊ LINH CHI Khóa : 62 Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn : PGS TS Đồng Huy Giới PGS TS Bùi Khánh Linh HÀ NỘI – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn cơng trình nghiên cứu thực tôi, đƣợc thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyên ngành dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Đồng Huy Giới, PGS TS Bùi Khánh Linh TS Dƣơng Đức Hiếu Các số liệu đƣợc sử dụng, hình ảnh, kết nghiên cứu khóa luận hoàn toàn trung thực, chƣa đƣợc sử dụng cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học trƣớc Khóa luận tốt nghiệp có tham khảo tài liệu, thơng tin trích dẫn đƣợc rõ phần tài liệu tham khảo Mọi giúp đỡ đƣợc cảm ơn Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023 Sinh viên Trịnh Thị Linh Chi i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đồng Huy Giới, Trƣởng môn Sinh học – khoa Công nghệ Sinh học PGS TS Bùi Khánh Linh, Trƣởng môn Ký sinh trùng, Khoa Thú y TS Dƣơng Đức Hiếu – Giảng viên môn Ký sinh trùng - Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam hƣớng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn cán phịng nghiên cứu - Nghiên Cứu Bảo Tồn Đa Dạng Sinh Học Và Bệnh Nhiệt Đới (BIOD) ln tận tình hƣớng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt thời gian thực khóa luận Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Ban lãnh đạo tập thể Viện BIOD Bệnh viện Thú y Gaia, đơn vị hỗ trợ cho tơi thực khóa luận Tiếp theo, muốn gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tơi suốt bốn năm đại học Cuối cùng, tơi xin đƣợc bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, ngƣời thân gia đình tồn thể bạn bè tơi giúp đỡ, động viên đồng hành năm tháng giảng đƣờng đại học Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023 Sinh viên Trịnh Thị Linh Chi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix CHƢƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN 2.1 Bệnh đơn bào lê dạng trùng lớn (Babesia vogeli) 2.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại 2.1.2 Vòng đời 2.1.3 Con đƣờng truyền lây 2.1.4 Dịch tễ học 2.2 Bệnh vi khuẩn Anaplasma (Anaplasma phagocytophylum) 2.2.1 Đặc điểm hình thái phân loại 2.2.2 Vòng đời 10 2.2.3 Con đƣờng truyền lây 11 2.3.4 Dịch tễ học 11 2.3 Bệnh vi khuẩn Mycoplasma haemofelis 13 2.3.1 Đặc điểm hình thái phân loại 13 2.3.2 Vòng đời 15 2.3.3 Con đƣờng truyền lây 16 2.3.4 Dịch tễ học 16 2.4 Bệnh vi khuẩn Erhlichia canis 17 iii 2.4.1 Đặc điểm hình thái phân loại 17 2.4.2 Vòng đời 18 2.4.3 Con đƣờng truyền lây 18 2.4.4 Dịch tễ học 18 2.5 Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction (PCR) 19 2.5.1 Kỹ thuật chiết tách DNA 19 2.5.2 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR – Polymerase chain reation 19 2.5.3 Các tiêu ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 20 2.5.4 Một số kỹ thuật PCR cải tiến khác 22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 24 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 24 3.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 24 3.2.1 Hóa chất 24 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 24 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 25 3.4.1 Tách chiết DNA 25 3.4.2 Xây dựng tối ƣu phản ứng Multiplex PCR 25 3.4.3 Phƣơng pháp điện di DNA 28 3.4.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Xây dựng tối ƣu phản ứng multiplex PCR phát đồng thời 04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 29 4.1.1.Kết xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu cho mầm bệnh đơn lẻ 29 4.1.2 Kết xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu cho phản ứng m-PCR 31 4.1.3.Kết xác định nồng độ mồi tối ƣu cho phản ứng m-PCR 32 iv 4.1.4.Kết xác định độ nhạy phản ứng m-PCR 33 4.1.5.Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng m-PCR 35 4.2 Đánh giá khả nhiễm 04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu mẫu thực địa phƣơng pháp multiplex PCR 37 4.2.1 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR 37 4.2.2 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp m-PCR 38 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 v DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 2.1 phân loại chi Ehrlichia Anaplasma trƣớc sau năm 2001 Các chữ A, B, B2, B3, B4, B5, B6, B7, C thay đổi vị trí hệ thống Bảng 3.1 Thành phần phản ứng m-PCR 26 Bảng 3.2 Danh sách cặp mồi cho phản ứng PCR nghiên cứu 26 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng s-PCR 27 Bảng 3.4 Nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi phản ứng s-PCR so với quy trình tham khảo 27 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng s-PCR 27 Bảng 4.1 Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi phản ứng s-PCR 30 Bảng 4.2 Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi phản ứng m-PCR 32 Bảng 4.3 Pha loãng hàm lƣợng DNA 34 Bảng 4.4 Kết s-PCR mẫu máu chó, mèo cho mầm bệnh ký sinh trùng 38 Bảng 4.4 Sự đồng kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp mPCR với s-PCR 39 Bảng 4.5 Kết sàng lọc mầm bệnh 65 mẫu thực địa địa bàn Hà Nội tp.HCM 40 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Babesia dạng lớn Hình 1.2 Babesia dạng nhỏ Hình 1.3 Vịng đời Lê dạng trùng Hình 2.1 Các mũi tên bạch cầu trung tính bị nhiễm Anaplasma phagocytophilum Mẫu máu chó đƣợc kiểm tra phƣơng pháp nhuộm Giemsa 10 Hình 2.2 Vịng đời Anaplasma phagocytophilum 10 Hình 2.3 Bọ ve truyền bệnh vật chủ 11 Hình 2.4 Các tế bào hồng cầu bị nhiễm Mycoplasma haemofelis (nhuộm Wright) Các mũi tên haemoplasma riêng lẻ 14 Hình 3.1 Ảnh chụp vi khuẩn Ehrlichia (E.) canis đƣợc phân lập từ bạch cầu chó Uberlândia, Brazil 18 Hình 4.1 Hình ảnh điện di cho phản ứng s-PCR 29 Hình 4.2 Kết thí nghiệm điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi 31 Hình 4.3 Kết thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi 33 Hình 4.4 Kết độ nhạy phản ứng m-PCR 35 Hình 4.5 Hình ảnh kết điện di m-PCR với mầm bệnh 35 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa Chữ viết tắt DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction s-PCR Singleplex PCR m-PCR Multiplex PCR µl Microlit µm Micromet ng Nanogram pM Picomole MeSH The US National library of Medicine Medical Subject Headings A centrale Anaplasma centrale A phago Anaplasma phago A platys Anaplasma platys A.marginale Anaplasma marginale CCT Canine Cyclic Thrombocytopenia HGA Human Granulotic Anaplasmosis Hflg Haemoplasma felis large Hfsm Haemoplasma felis small IFA Indirect Fluorescent Antibody (IFA) Assay Tm Time melting viii Chú thích: M- Ladder NC - Đối chứng âm Đối chứng dương Mẫu dương tính với Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, Mycoplasma haemofelis Mẫu dương tính với Anaplasma phagocytophilum, Mycoplasma haemofelis, Babaesia vogeli Mẫu dương tính với Babaesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum Mẫu dương tính với Mycoplasma haemofelis, Ehrlichia canis Mẫu dương tính với Mycoplasma haemofelis, Anaplasma phagocytophilum Mẫu dương tính với Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis Mẫu dương tính với Babaesia vogeli, Mycoplasma haemofelis Mẫu dương tính với Babaesia vogeli, Ehrlichia canis 10 Mẫu dương tính với Anaplasma phagocytophilum, Babaesia vogeli 11 Mẫu dương tính với Anaplasma phagocytophilum 12 Mẫu dương tính với Ehrlichia canis 13 Mẫu dương tính với Mycoplasma haemofelis 14 Mẫu dương tính với Babaesia vogeli 15 Mẫu dương tính với Trypanosoma spp Kết điện di cho thấy, phản ứng m-PCR phát lúc band đặc hiệu cho mầm bệnh Mycoplasma haemofelis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis Babaesia vogeli tƣơng ứng với band khoảng vị trí 190; 247; 380 602 bp – khoảng vị trí band chạy phản ứng s-PCR với mầm bệnh tƣơng ứng Ngồi ra, khơng có nhiễm chéo đƣợc phát phản ứng mPCR xây dựng nhƣ kết cho thấy, phản ứng phát đƣợc mẫu nhiễm mầm bệnh nhiễm đồng thời hay mầm bệnh mà nghiên cứu quan tâm Sử dụng mẫu DNA số mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu khác nhƣ Tiên mao trùng Trypanosoma spp – mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu đƣợc tìm thấy chó, mèo truyền lây qua đƣờng bọ ve (Sivajothi & cs., 2017; Panigrahi 36 & cs., 2016) để kiểm tra khả nhiễm chéo phản ứng m-PCR Kết hiển thị hình 4.5 Cho thấy khơng có bắt cặp nhầm diễn phản ứng mPCR đƣợc nghiên cứu xây dựng tối ƣu hóa (lane 17) 4.2 Đánh giá khả nhiễm 04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu mẫu thực địa phƣơng pháp multiplex PCR 4.2.1 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR Để nắm đƣợc tình hình nhiễm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu chó, tiến hành khảo sát 38 mẫu máu chó 27 mẫu máu mèo thu thập ngẫu nhiên từ phòng khám thú y Mẫu máu thu từ thực địa đƣợc tách chiết tiến hành sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR (kết hiển thị hình 4.6), kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp s-PCR đƣợc thể bảng 4.4 37 Bảng 4.4 Kết s-PCR mẫu máu chó, mèo cho mầm bệnh ký sinh trùng Mầm bệnh Số mẫu nhiễm Số mẫu Tỷ lệ % kiểm tra Chó Babaesia vogeli 65 - 3,08% - Ehrlichia canis 65 - 6,15% - 65 - 9,23% - 65 65 - 3,08% - 65 - 1,54% - 65 - 1,54% - Anaplasma phagocytophilum Mycoplasma haemofelis Mèo Chó 9,23% Mèo 12,3% Đồng nhiễm Anaplasma phagocytophilum Mycoplasma haemofelis Đồng nhiễm Anaplasma phagocytophilum Ehrlichia canis Đồng nhiễm Anaplasma phagocytophilum Babaesia vogeli Tổng mẫu dƣơng tính 26 40% Theo Bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ chó, mèo nhiễm mầm bệnh Mycoplasma haemofelis chiếm tỷ lệ cao mầm bệnh theo sau Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis Babaesia vogeli với tỉ lệ nhiễm tƣơng ứng 9,23%; 6,15% 3,07% Có thể thấy mèo mắc mầm bệnh Mycoplasma haemofelis, nhiên mầm bệnh phát chó Các mầm bệnh lại Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis Babaesia vogeli đƣợc phát hầu hết chó Trong đó, phát cá thể chó đồng nhiễm với Anaplasma Phagocytophilum Mycoplasma haemofelis chiếm tỷ lệ 3,08%; cá thể chó đồng nhiễm với Anaplasma phagocytophilum (1,54%); cá thể đồng nhiễm Anaplasma Phagocytophilum Babaesia vogeli (1,54%) tổng số mẫu kiểm tra 4.2.2 Kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp m-PCR 38 mẫu máu chó 27 mẫu máu mèo đƣợc chuyển từ phòng khám thú y địa bàn Hà Nội TP HCM đƣợc sử dụng để sàng lọc mầm bệnh Anaplasma 38 phagocytophilum, Ehrlichia canis Babaesia vogeli phƣơng pháp s-PCR phía trên, đƣợc tiếp tục sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng m-PCR để đánh giá đồng kết hai phƣơng pháp Sự đồng kết s-PCR m-PCR đƣợc thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Sự đồng kết sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp m-PCR với s-PCR Mầm bệnh Số mẫu kiểm tra PCR đơn lẻ Multiplex PCR Babaesia vogeli 65 (3,08%) (3,08%) Ehrlichia canis 65 (6,15%) (6,15%) 65 (9,23%) (9,23%) 65 14 (21,54%) 14 (21,54%) (3,08%) (3,08%) (1,54%) (1,54%) (1,54%) (1,54%) 26 (40%) 26 (40%) Anaplasma phagocytophilum Mycoplasma haemofelis Đồng nhiễm Anaplasma phagocytophilum Mycoplasma haemofelis Đồng nhiễm Anaplasma phagocytophilum Ehrlichia canis Đồng nhiễm Anaplasma phagocytophilum Babaesia vogeli Tổng mẫu dƣơng tính Kết sàng lọc mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu chó, mèo thực hai phƣơng pháp PCR có đồng tỷ lệ âm tính, tỷ lệ dƣơng tính với mầm bệnh có đồng kết sàng lọc cho cá thể đơn lẻ Từ kết này, thấy sàng lọc 04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu phƣơng pháp multiplex – PCR không thực đƣợc môi trƣờng in vitro mà cịn áp dụng đƣợc thực tiễn để phát Căn theo kết sàng lọc bốn mầm bệnh Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, Mycoplasma haemofelis Babaesia vogeli hai phƣơng pháp 39 s-PCR m-PCR cho thấy, thực trạng nhiễm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 65 mẫu thực địa thu phòng khám thú y thu địa bàn Hà Nội TP HCM đƣợc đánh giá qua biểu đồ 4.4 Tỷ lệ ca bệnh dƣơng tính với bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 26/65 mẫu (40%) Trong đó, tỷ lệ nhiễm mầm bệnh Mycoplasma haemofelis chiếm tỷ lệ cao (21.54%) có 9,23% chó 12,3% mèo, theo sau Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis Babaesia vogeli tƣơng ứng 9,23%, 6,15% 3,08% Đặc biệt, nghiên cứu phƣơng pháp PCR đơn mồi PCR đa mồi phát trƣờng hợp mẫu chó đồng nhiễm với hai mầm bệnh Anaplasma phatocytophilum Mycoplasma haemofelis chiếm tỷ lệ 3,08% tổng số mẫu kiểm tra; trƣờng hợp mẫu chó (1,54%) đồng nhiễm với Anaplasma phagocytophilum Ehrlichia canis; trƣờng hợp (1,54%) đồng nhiễm Anaplasma phagocytophilum Babaesia vogeli Với 65 mẫu thực địa trên, có 08 mẫu đƣợc thu địa bàn HCM 57 mẫu thu địa bàn Hà Nội Kết sàng lọc mầm bệnh đƣợc thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết sàng lọc mầm bệnh 65 mẫu thực địa địa bàn Hà Nội tp.HCM Mầm bệnh Tổng Hà Nội (57 mẫu) Tp HCM (08 mẫu) Babaesia vogeli 65 (3.5%) - Ehrlichia canis 65 (7.02%) - Anaplasma 65 (10.53%) - 65 14 (24.56%) - 26 (45,61%) - phagocytophilum Haemoplasma felis Tổng mẫu dương tính Theo khảo sát cho thấy 26/57 mẫu chiếm 45,61% tỉ lệ mẫu sàng lọc Hà Nội đƣợc sàng lọc cho thấy dƣơng tính với bốn mầm bệnh đƣợc sàng lọc, kết sàng lọc 08 mẫu HCM 0/08 Điều nghĩa khơng tồn mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu chó mèo khu vực HCM Những mẫu bệnh phẩm đƣợc chọn sàng lọc m-PCR nghiên cứu dựa sàng lọc triệu chứng lâm sàng bác sỹ thú y, nghi ngờ vật mắc bệnh ký sinh 40 trùng đƣờng máu sử dụng kit test nhanh kháng thể cho kết dƣơng tính (mẫu HCM) Tại Việt Nam có số báo cáo tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu chó đƣợc ghi nhận Theo Lê Tuyết Đang & cs (2021) khảo sát tổng số 151 mẫu máu đƣợc thu thập từ chó nghi nhiễm E Canis Rạch Giá, Kiên Giang Mẫu máu từ chó nghi bệnh đƣợc chẩn đoán kit E canis-Ab, đồng thời đƣợc kiểm tra diện phôi dâu E canis tế bào bạch cầu phƣơng pháp nhuộm tiêu máu đếm số lƣợng tiểu cầu Kết kiểm tra cho thấy có 103/151 (68,21%) mẫu dƣơng tính với E canis kit E canis-Ab Tình trạng giảm tiểu cầu đƣợc ghi nhận 69/80 (86,25%) chó dƣơng tính với E canis Tuy nhiên, kết cần đƣợc theo dõi thêm tác giả sử dụng phƣơng pháp soi kính kit test nhanh, có độ nhạy độ đặc hiệu thấp (Nomar Ndao & cs., 2004) Những ƣu điểm vƣợt trội phản ứng m-PCR so với s-PCR nghiên cứu là: Để tiến hành sàng lọc cho 65 mẫu bệnh phẩm phƣơng pháp PCR đơn lẻ để phát bốn mầm bệnh Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, Mycoplasma haemofelis Babaesia vogeli cần thực 320 phản ứng PCR Thực phản ứng PCR đơn lẻ để sàng lọc mầm bệnh tốn hóa chất, vật tƣ, nhân cơng thời gian tiến hành Vì vậy, phản ứng m-PCR tối ƣu đƣợc nhƣợc điểm phản ứng PCR đơn lẻ Khi ứng dụng phản ứng m-PCR cho thấy hiệu tiết kiệm đƣợc 40% lƣợng hóa chất PCR cần sử dụng thời gian sàng lọc mầm bệnh rút ngắn 1/4 so với thời gian cần để thực xét nghiệm phản ứng PCR đơn lẻ Với ƣu điểm mặt thời gian tiết kiệm hóa chất đồng thời phản ứng m-PCR có độ nhạy độ đặc hiệu tƣơng đƣơng với phản ứng PCR đơn lẻ Vì vậy, áp dụng phản ứng m-PCR để thay cho việc sàng lọc mầm bệnh phƣơng pháp PCR đơn lẻ Trong số phƣơng pháp đƣợc phát triển để chẩn đốn nhanh xác hơn, PCR đƣợc coi phƣơng pháp hàng đầu, có độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, kỹ thuật PCR phức tạp tốn thời gian (Tanyuksel Petri, 2003; Fotedar, 2007,) Zulhainan Hamzah & cs., năm 2006 phát triển kỹ thuật m-PCR để chẩn đoán bệnh amip gây loài khác (E histolytica, E dispar E moshkovskii) một phản ứng (Zulhainan & cs., 2006; 2011) 41 Nutchanart Sea-liang & cs (2019) phát triển kỹ thuật multiplex PCR để kết hợp cặp mồi nhắm mục tiêu gen cụ thể mã hóa gen 56-kDa TSA vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò (Scrub typhus), kháng nguyên 17-kDa vi khuẩn Rickettsia typhi gây bệnh sốt phát ban chuột (Murine typhus) gen LipL32 Leptospira interrogans gây bệnh xoắn khuẩn vàng da (Leptospirosis) đánh giá hiệu suất phƣơng pháp so với huyết học tiêu chuẩn Nghiên cứu sử dụng 83 mẫu máu EDTA để chạy phản ứng mutiplex PCR Ba mƣơi chín mẫu (47%) đƣợc phát dƣơng tính kỹ thuật multiplex PCR, 20 mẫu (24,09%) dƣơng tính xét nghiệm huyết học tiêu chuẩn Mƣời chín số 39 mẫu, đƣợc thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR cho kết dƣơng tính, lại cho kết huyết âm tính Những kết đƣợc giải thích mẫu âm tính với phƣơng pháp huyết học mẫu máu đƣợc lấy vào giai đoạn đầu nhiễm bệnh Trong giai đoạn đầu nhiễm bệnh khơng tạo đủ mức kháng thể để phát huyết học Nghiên cứu cho thấy 19 mẫu máu chắn nhiễm bệnh đƣợc thu thập giai đoạn đầu trình lây nhiễm Do đó, kỹ thuật multiplex PCR phát DNA vi khuẩn mẫu máu, xét nghiệm huyết cho kết âm tính Một mẫu cho thấy dƣơng tính kép O tsutsugamushi L interrogans xét nghiệm PCR đa mồi, xét nghiệm âm tính phân tích huyết học Nghiên cứu cho thấy PCR đa hợp đƣợc áp dụng xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng để xác định tác nhân gây bệnh gây bệnh sốt mò, bệnh leptospirosis, sốt phát ban chuột mẫu đồng nhim Nghiờn cu ti u phn ng m-PCR ca Bilgiỗ HB & cs., 2013 phát mầm bệnh T annulata, B bovis A marginale từ mẫu DNA đơn nhiễm hay hỗn hợp DNA mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu bò Khơng có khác biệt giới hạn phát kỹ thuật m-PCR sử dụng DNA mầm bệnh ký sinh trùng hay hỗn hợp DNA ba lồi Hơn nữa, s-PCR m-PCR phát DNA loài với độ nhạy tƣơng đƣơng hỗn hợp DNA đƣợc pha loãng DNA T annulata, B bovis A marginale Kaur & cs., 2013 nghiên cứu phát triển phản ứng m-PCR để phát đồng thời ba mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu chó (B vogeli, E canis H 42 canis) dƣờng nhƣ khơng có báo cáo đƣợc công bố việc phát đồng thời mầm bệnh ký sinh trùng Hơn nữa, trƣớc xác nhận xét nghiệm m-PCR điều kiện thực địa, kết xét nghiệm đƣợc so sánh với xét nghiệm sPCR mối liên quan yếu tố nguy khác nhƣ tuổi, giống, giới tính vật chủ, mùa huyện đƣợc làm sáng tỏ Nghiên cứu xét nghiệm m-PCR phù hợp để xử lý số lƣợng lớn mẫu máu thời gian ngắn với mức độ đặc hiệu cao ba mầm bệnh nhân ký sinh trùng đƣờng máu với độ nhạy tốt Ngoài ra, xét nghiệm m-PCR, đƣợc sử dụng để phát lây nhiễm đồng thời sinh vật gây bệnh phổ biến khu vực địa lý cụ thể, cơng cụ nhanh chóng xác để đánh giá tình trạng dịch tễ học bệnh khu vực (Jain & cs., 2018) Về nghiên cứu giới, Kledmanee cộng (2009) thiết kế phản ứng m-PCR để phát đồng thời ba loại ký sinh trùng máu (Babesia spp., E canis H canis) chó Hơn nữa, để khắc phục nhƣợc điểm liên quan đến chi phí thời gian tiến hành xét nghiệm, cần cải thiện nhƣợc điểm phản ứng s-PCR cách thực xét nghiệm m-PCR Nghiên cứu đánh giá xét nghiệm m-PCR để phát ba ký sinh trùng ve quan trọng lây nhiễm cho chó Xét nghiệm s-PCR để phát mầm bệnh Ehrlichia spp., Hepatozoon spp., Trypanosoma evansi Babesia spp đƣợc tiến hành nhiều nhà nghiên cứu toàn giới (Omanwar & cs., 1999; Chansiri & cs., 2002; Sacchini & cs., 2007; Adaszek Winiarczyk, 2008; Tamarit & cs., 2010; Shahid & cs., 2013) Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu có xét nghiệm m-PCR nhằm phát ký sinh trùng máu truyền lây qua ve đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng cách sử dụng mẫu máu thu đƣợc từ thực địa (Azhahianambi & cs., 2018; Jain & cs., 2018) Ý nghĩa nhân y thú y bọ ve mầm bệnh ve vùng nhiệt đới cận nhiệt đới đƣợc công nhận rõ ràng Mặc dù ve mầm bệnh đƣợc biết xảy Đông Nam Á, nhƣng số liệu hạn chế tài liệu quốc tế cho số quốc gia, chẳng hạn nhƣ Việt Nam Theo Nguyễn Việt Linh & cs (2018), số 359 chó đƣợc khảo sát, 26,2% (n = 94) bị nhiễm ve số ve tổng cộng 466 bọ ve Tất lồi ve đƣợc xác định mặt hình thái Rhipicephalus sanguineus sensu lato Tổng số 302 bọ ve đƣợc sàng lọc phân tử để phát mầm bệnh ve đƣợc 43 chọn Ba ve dƣơng tính với Hepatozoon canis, với Ehrlichia canis với Babesia vogeli, đại diện cho công bố thông tin mầm bệnh Việt Nam Trong nghiên cứu Đỗ Thanh Thơm & cs (2021), số 200 chó đƣợc khảo sát, 20% bị nhiễm bọ chét Ctenocephalides felis felis, loài đƣợc thấy mèo Tổng cộng, 62 bọ chét đƣợc thu thập từ chó nhà đƣợc sàng lọc phân tử để phát mầm bệnh Trong số bọ chét đƣợc sàng lọc, 39 dƣơng tính với Rickettsia felis (62,9%), với Candidatus Mycoplasma hemobos (14,52%), Mycoplasma wenyonii (9,68%) Nghiên cứu cho thấy phát phân tử mầm bệnh nói bọ chét thu thập từ khu vực nghiên cứu nguy tiềm ẩn lây nhiễm mầm bệnh ve đƣợc kiểm tra miền Bắc Việt Nam Có thể thấy mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu lây lan qua vector trung gian ve, bọ chét ký sinh chó mèo đƣợc cơng bố tìm thấy chó mèo Từ thấy nguy chó mèo nhà bị mắc mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu cao Đối với mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu cần có phác đồ điều trị khác Chính vậy, hiểu biết bác sĩ thú y mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu thú cƣng cịn thiếu sót dẫn đến chẩn đốn điều trị sai thuốc Vậy nên cần tiến hành thêm nghiên cứu điều tra tình hình nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu phƣơng pháp phát mầm bệnh cách nhanh chóng xác, tránh ảnh hƣởng đến sức khỏe vật nuôi gây thiệt hại kinh tế tinh thần cho chủ nuôi 44 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Thiết lập thành cơng quy trình multiplex PCR để phát bốn mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu chó, mèo Babaesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum Mycoplasma haemofelis Sử dụng phản ứng multiplex PCR đƣợc thiết lập để phát sớm 04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 65 mẫu máu chó, mèo thu thập từ phòng khám thú cƣng cho thấy đồng với kết khảo sát mầm bệnh Babaesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum Mycoplasma haemofelis phƣơng pháp s-PCR 5.2 Kiến nghị Thử nghiệm quy trình multiplex PCR mẫu bệnh lồi khác Khuyến cáo sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để chẩn đoán cho 04 mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu phổ biến chó, mèo Babaesia vogeli, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum Mycoplasma haemofelisthay thay cho s – PCR để tiết kiệm hóa chất, thời gian mà phát sớm điều trị kịp thời Thiết lập phản ứng multiplex PCR phát đồng thời nhiều mầm bệnh ký sinh trùng đƣờng máu 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hồ Quỳnh Thùy Dƣơng (2003) Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục Nguyễn Đình Chuẩn, Đặng Anh Thƣ Nguyễn Thuận (2021) Đặc điểm phƣơng pháp chẩn đoán bệnh Ehrlichia canis gây chó thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, 57(5), 120-128 Tài liệu tiếng Anh Azhahianambi, P., Jyothimol, G., Baranidharan, G R., Aravind, M., Latha, B R., and Raman, M (2018) Evaluation of multiplex PCR assay for detection of Babesia spp, Ehrlichia canis and Trypanosoma evansi in dogs Acta tropica, 188, 58-67 Baneth, G., Nachum-Biala, Y., Birkenheuer, A J., Schreeg, M E., Prince, H., Florin-Christensen, M and Aroch, I (2020) A new piroplasmid species infecting dogs: morphological and molecular characterization and pathogeny of Babesia negevi n sp Parasites & vectors, 13(1), 1-13 Bilgiỗ, H B., Karagenỗ, T., Simuunza, M., Shiels, B., Tait, A., Eren, H., & Weir, W (2013) Development of a multiplex PCR assay for simultaneous detection of Theileria annulata, Babesia bovis and Anaplasma marginale in cattle Experimental parasitology, 133(2), 222-229 Birkenheuer, A J., Buch, J., Beall, M J., Braff, J and Chandrashekar, R (2020) Global distribution of canine Babesia species identified by a commercial diagnostic laboratory Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports, 22, 100471 Birkenheuer, A J., Neel, J., Ruslander, D., Levy, M G., and Breitschwerdt, E B (2004) Detection and molecular characterization of a novel large Babesia species in a dog Veterinary parasitology, 124(3-4), 151-160 Boozer, A L., and Macintire, D K (2003) Canine babesiosis Veterinary Clinics: Small Animal Practice, 33(4), 885-904 Calchi, A C., Vultão, J G., Alves, M H., Yogui, D R., Desbiez, A L J., De Santi, M., & André, M R (2020) Ehrlichia spp and Anaplasma spp in Xenarthra mammals from Brazil, with evidence of novel ‗Candidatus Anaplasma spp.‘ Scientific Reports, 10(1), 12615 Carret, C., Walas, F., Carcy, B., Grande, N., Précigout, É., Moubri, K., and Gorenflot, A (1999) Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis 46 rossi: differentiation of the three subspecies by a restriction fragment length polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes Journal of Eukaryotic Microbiology, 46(3), 298-301 De la Fuente, J., Torina, A., Naranjo, V., Nicosia, S., Alongi, A., La Mantia, F., and Kocan, K M (2006) Molecular characterization of Anaplasma platys strains from dogs in Sicily, Italy BMC veterinary research, 2, 1-5 10 Devi, A., Shanker, D., Sudan, V., and Chaudhary, M K (2017) PCR-based diagnosis of surra in equines targeting RoTat 1.2 VSG gene Journal of Veterinary Parasitology, 31(2), 74-78 11 Dumler, J S., and Bakken, J S (1998) Human ehrlichioses: newly recognized infections transmitted by ticks Annual review of medicine, 49(1), 201-213 12 Dumler, J S., Barbet, A F., Bekker, C P., Dasch, G A., Palmer, G H., Ray, S C., and Rurangirwa, F R (2001) Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and'HGE agent'as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila International journal of systematic and evolutionary microbiology, 51(6), 2145-2165 13 Fishbein, D B., Dawson, J E., and Robinson, L E (1994) Human ehrlichiosis in the United States, 1985 to 1990 Annals of Internal Medicine, 120(9), 736743 14 Galay, R L., Manalo, A A L., Dolores, S L D., Aguilar, I P M., Sandalo, K A C., Cruz, K B and Tanaka, T (2018) Molecular detection of tick-borne pathogens in canine population and Rhipicephalus sanguineus (sensu lato) ticks from southern Metro Manila and Laguna, Philippines Parasites & vectors, 11(1), 1-8 15 Gülanber, A., Gorenflot, A., Schetters, T P., and Carcy, B (2006) First molecular diagnosis of Babesia vogeli in domestic dogs from Turkey Veterinary parasitology, 139(1-3), 224-230 16 Haemoplasmosis, CVBD, truy cập ngày 07/02/2023, 17 https://campaign.elanco.com/en-us/flea-borne-diseases/haemoplasmosis/ 18 Inpankaew, T., Hii, S F., Chimnoi, W., and Traub, R J (2016) Canine vectorborne pathogens in semi-domesticated dogs residing in northern Cambodia Parasites & Vectors, 9(1), 1-6 19 Jain, J., Lakshmanan, B., Nagaraj, H V., Praveena, J E., Syamala, K., and Aravindakshan, T (2018) Detection of Babesia canis vogeli, Babesia gibsoni and Ehrlichia canis by multiplex PCR in naturally infected dogs in South India Veterinarski arhiv, 88(2), 215-224 47 20 Jalovecka, M., Sojka, D., Ascencio, M., and Schnittger, L (2019) Babesia life cycle–when phylogeny meets biology Trends in parasitology, 35(5), 356-368 21 Janet, E F (2022) Ehrlichiosis, Anaplasmosis, and Related Infections in Animals, MSD Veterinary Manual, truy cập ngày 08/02/2023, https://www.msdvetmanual.com/generalizedconditions/rickettsial-diseases/ehrlichiosis,-anaplasmosis,-and-related-infections-in-animals 22 Kaur, N., Singh, H., Sharma, P., Singh, N K., Kashyap, N., & Singh, N K (2020) Development and application of multiplex PCR assay for the simultaneous detection of Babesia vogeli, Ehrlichia canis and Hepatozoon canis in dogs Acta Tropica, 212, 105713 23 Kewish, K E., Appleyard, G D., Myers, S L., Kidney, B A., and Jackson, M L (2004) Mycoplasma haemofelis and Mycoplasma haemominutum detection by polymerase chain reaction in cats from Saskatchewan and Alberta The Canadian Veterinary Journal, 45(9), 749 24 Linh, V N., Colella, V., Iatta, R., Bui, K L., Dantas-Torres, F., Otranto, D (2019) Ticks and associated pathogens from dogs in northern Vietnam Parasitology research, 118, 139-142 25 Martinez-Díaz, V L., Cardoso, L., Vieira, L., Altet, L., Francino, O., and Silvestre-Ferreira, A C (2013) Feline vector-borne pathogens in the north and centre of Portugal Parasites & Vectors, 6(1), 1-6 26 Matjila, P T., Leisewitz, A L., Oosthuizen, M C., Jongejan, F., and Penzhorn, B L (2008) Detection of a Theileria species in dogs in South Africa Veterinary Parasitology, 157(1-2), 34-40 27 Matjila, P T., Penzhorn, B L., Bekker, C P J., Nijhof, A M., and Jongejan, F (2004) Confirmation of occurrence of Babesia canis vogeli in domestic dogs in South Africa Veterinary parasitology, 122(2), 119-125 28 Milanjeet, H S., Singh, N K., Singh, N D., Singh, C., and Rath, S S (2014) Molecular prevalence and risk factors for the occurrence of canine monocytic ehrlichiosis Vet Med, 59(3), 129-136 29 Obara, H., Fujihara, M., Watanabe, Y., Ono, H K., and Harasawa, R (2011) A feline hemoplasma,Candidatus Mycoplasma haemominutum, detected in dog in Japan Journal of Veterinary Medical Science, 73(6), 841-843 30 Obeta, S S., Ibrahim, B., Lawal, I A., Natala, J A., Ogo, N I., and Balogun, E O (2020) Prevalence of canine babesiosis and their risk factors among asymptomatic dogs in the federal capital territory, Abuja, Nigeria Parasite Epidemiology and Control, 11, e00186 31 Panigrahi, P N., Mahendran, K., Jena, S C., Behera, P., Mahajan, S., Arjun, K., and Dey, S (2015) Trypanosoma evansi infection in a German shepherd dog—Apparent successful treatment using serial low dose of diminazene aceturate Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports, 1, 70-74 48 32 Paula, W V D F., Taques, Í I G G., Miranda, V C., Barreto, A L G., Paula, L G F D., Martins, D B., and Krawczak, F D S (2021) Seroprevalence and hematological abnormalities associated with Ehrlichia canis in dogs referred to a veterinary teaching hospital in central-western Brazil Ciência Rural, 52 33 Piratae, S., Pimpjong, K., Vaisusuk, K., and Chatan, W (2015) Molecular detection of Ehrlichia canis, Hepatozoon canis and Babesia canis vogeli in stray dogs in Mahasarakham province, Thailand Annals of Parasitology, 61(3) 34 Poonam, V., and Nandini, M K (2019) Overview of canine babesiosis Veterinary medicine and pharmaceuticals, 1-17 35 Rojero-Vazquez, E., Gordillo-Perez, G., & Weber, M (2017) Infection of Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia spp in opossums and dogs in Campeche, Mexico: The role of tick infestation Frontiers in Ecology and Evolution, 5, 161 36 Rosas, I O., Richards, T J., Konishi, K., Zhang, Y., Gibson, K., Lokshin, A E., and Kaminski, N (2008) MMP1 and MMP7 as potential peripheral blood biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis PLoS medicine, 5(4), e93 37 Sainz, A., Amusategui, I and Tesouro, M A (1999) Ehrlichia platys infection and disease in dogs in Spain Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11(4), 382-384 38 Schnittger, L., Rodriguez, A E., Florin-Christensen, M and Morrison, D A (2012) Babesia: a world emerging Infection, Genetics and Evolution, 12(8), 1788-1809 39 Sea-Liang, N., Sereemaspun, A., Patarakul, K., Gaywee, J., Rodkvamtook, W., Srisawat, N., and Hemachudha, T (2019) Development of multiplex PCR for neglected infectious diseases PLoS Neglected Tropical Diseases, 13(7), e0007440 40 Séverine, T (2006) Feline Haemoplasma Infections, World Small Animal Veterinary Association World Congress Proceedings, truy cập ngày 07/02/2023, https://www.vin.com/apputil/content/defaultadv1.aspx?meta=Generic&pId=112 23&id=3859016 41 Shahid, M., Janjua, S., and Burbach, J S (2013) PCR-Based Detection of Trypanosoma evansi Infection in Semi-Captive Asiatic Black Bears (Ursus thibetanus) Pakistan Veterinary Journal, 33(4) 42 Sivajothi, S., and Sudhakara Reddy, B (2018) Trypanosoma evansi infection in a cat—a rare case Comparative Clinical Pathology, 27, 115-116 49 43 Solano-Gallego, L., Sainz, Á., Roura, X., Estrada-Pa, A., and Miró, G (2016) A review of canine babesiosis: the European perspective Parasites & vectors, 9, 1-18 44 Soto, F., Walker, R., Sepulveda, M., Bittencourt, P., Acosta-Jamett, G., and Müller, A (2017) Occurrence of canine hemotropic mycoplasmas in domestic dogs from urban and rural areas of the Valdivia Province, southern Chile Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 50, 70-77 45 Sparagano, O A., De Vos, A P., Paoletti, B., Cammà, C., De Santis, P., Otranto, D., and Giangaspero, A (2003) Molecular detection of Anaplasma platys in dogs using polymerase chain reaction and reverse line blot hybridization Journal of veterinary diagnostic investigation, 15(6), 527-534 46 Suksawat, J., Pitulle, C., Arraga-Alvarado, C., Madrigal, K., Hancock, S I., and Breitschwerdt, E B (2001) Coinfection with three Ehrlichia species in dogs from Thailand and Venezuela with emphasis on consideration of 16S ribosomal DNA secondary structure Journal of Clinical Microbiology, 39(1), 90-93 47 Taylor, M A., Coop, R L., and Wall, R L (2015) Veterinary parasitology, John Wiley & Sons 48 Thom T D and Inpankaew, T (2020) Molecular Characterization and Risk Factors Associated with Feline Hemoplasma Infection in Semi-domesticated Cats in Bangkok, Thailand (Doctoral dissertation, Kasetsart University) 49 Vergara, R W., Galleguillos, F M., Jaramillo, M G., Almosny, N R P., Martínez, P A., Behne, P G., and Müller, A (2016) Prevalence, risk factor analysis, and hematological findings of hemoplasma infection in domestic cats from Valdivia, Southern Chile Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 46, 20-26 50 Zahler, M., Rinder, H., Schein, E., and Gothe, R (2000) Detection of a new pathogenic Babesia microti-like species in dogs Veterinary parasitology, 89(3), 241-248 51 Zahler, M., Schein, E., Rinder, H., and Gothe, R (1998) Characteristic genotypes discriminate between Babesia canis isolates of differing vector specificity and pathogenicity to dogs Parasitology Research, 84, 544-548 50