Phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp l axit lactic định hướng tạo nhựa sinh học chất lượng cao

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC NẤM SINH TỔNG HỢP L- AXIT LACTIC ĐỊNH HƯỚNG TẠO NHỰA SINH HỌC CHẤT LƯỢNG CAO HÀ NỘI – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC NẤM SINH TỔNG HỢP L- AXIT LACTIC ĐỊNH HƯỚNG TẠO NHỰA SINH HỌC CHẤT LƯỢNG CAO Người thực : NGUYỄN THỊ TRANG Mã sinh viên : 646428 Khóa : 64 Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn : TS NGUYỄN THANH HẢO TS CHU NHẬT HUY HÀ NỘI – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng cơng bố Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Trang i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp Viện công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, giúp đỡ dìu dắt tận tình thầy, anh chị cán phịng Cơng nghệ Sinh học Tái tạo Mơi trường, cố gắng nỗ lực học tập thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học, thầy TS Nguyễn Thanh Hảo tồn thể thầy giáo truyền đạt cho kiến thức vô bổ ích quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện trường Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS Chu Nhật Huy – trưởng phịng cơng nghệ Sinh học Tái tạo Mơi trường chị T.S Đào Thị Ngọc Ánh anh chị phòng định hướng đề tài tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình làm khóa luận Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ tất người thân gia đình ln đứng sau cổ vũ tinh thần ủng hộ việc làm chỗ dựa vững cho tơi để tơi có ngày hôm Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Trang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan Axit lactic Giới thiệu Axit lactic Công thức cấu tạo Axit lactic Tính chất Axit lactic Ứng dụng vai trò axit lactic Tổng quan L- axit lactic Khái niệm L- axit lactic Tính chất L- axit lactic Tổng hợp L- axit lactic từ vi sinh vật Ứng dụng L- axit lactic (LA) Tổng quan nấm mốc sinh L- axit lactic Nấm Rhizopus oryzae Vai trò ứng dụng nấm mốc 10 Nhựa phân hủy sinh học polylactic acid (PLA) 11 Tình hình nghiên cứu nấm mốc sinh tổng hợp L- axit lactic nước 12 iii VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 Địa điểm thời gian nghiên cứu 14 Vật liệu nghiên cứu 14 Đối tượng nghiên cứu 14 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 14 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 Phương pháp nghiên cứu 15 Thu thập mẫu nấm mốc từ loại hoa 15 Phân lập tuyển chọn chủng nấm có khả sinh axit lactic 15 Xác định khả sinh axit lactic chủng nấm chọn 16 3.3.3.1 Lên men sinh axit lactic từ chủng nấm chọn 16 3.3.3.2 Xác định hàm lượng axit lactic phương pháp đo quang phổ 16 Xác định đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học chủng nấm chọn 18 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hàm lượng L- axit lactic sinh 18 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến hàm lượng L- axit lactic sinh 19 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng L- axit lactic sinh 19 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 Kết thu thập mẫu nấm mốc xung quanh Gia Lâm- Hà nội 20 Kết phân lập tuyển chọn chủng có khả sinh L- Axit lactic 21 Kết phân lập nấm mốc từ mẫu hoa 21 Kết tuyển chọn chủng nấm sinh L- Axit lactic 21 Kết đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học chủng nấm mốc chọn 23 Đặc điểm hình thái chủng TL 23 Đặc điểm hình thái chủng CR 25 Đặc điểm hình thái chủng HĐB 26 Đặc điểm hình thái chủng HĐB1 27 Đặc điểm hình thái chủng SS1 28 iv Đặc điểm hình thái chủng SS2 30 Đặc điểm hình thái chủng SS3 31 Khả sinh axit lactic chủng nấm mốc tuyển chọn 32 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hàm lượng L- axit lactic sinh 34 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến hàm lượng L- axit lactic sinh 35 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng L- axit lactic sinh 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 44 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tính chất nhiệt động học axit lactic Bảng 4.1 Kết chủng nấm mốc phân lập 21 Bảng 4.2 Kết tuyển chọn chủng nấm mốc có khả hịa tan CaCO3 đổi màu môi trường 22 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc khơng gian dạng đồng phân axit lactic (Anh, 2018) Hình 2.2 Cơng thức cấu tạo PLA 11 Hình 3.1 Xây dựng đường chuẩn 17 Hình 4.1 Một số mẫu nấm mốc thu thập 20 Hình 4.2 Hình thái chủng nấm TL 24 Hình 4.3 Hình thái chủng nấm CR 25 Hình 4.4 Hình thái chủng nấm HĐB 27 Hình 4.5 Hình thái chủng nấm HĐB1 28 Hình 4.6 Hình thái chủng nấm SS1 29 Hình 4.7 Hình thái chủng nấm SS2 30 Hình 4.8 Hình thái chủng nấm SS3 31 Hình 4.9.Khả sinh tổng hợp L- axit lactic chủng nấm tuyển chọn 33 Hình 4.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh L- axit lactic 34 Hình 4.11 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả sinh L- axit lactic 35 Hình 4.12 Ảnh hưởng pH đến khả sinh L- axit lactic 36 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ HCN Axit hydrocyanic LA L- axit lactic LAB vi khuẩn lactic PCL polycaprolactone PLA Poly lactid acid R oryzae Rhizopus oryzae viii Nồng độ axit lactic (mg/l) 45 40 35 30 25 20 15 10 SS1 SS2 SS3 Ngày TL Ngày CR ĐB ĐB1 Ngày Hình 4.9.Khả sinh tổng hợp L- axit lactic chủng nấm tuyển chọn Dựa vào hình 4.9 cho thấy, chủng nấm mốc có khả sinh LA nồng độ LA sinh chủng có khác biệt lớn Lượng LA sinh chủng SS1 nhiều vào ngày thứ 2, giảm mạnh vào ngày thứ Tương tự chủng CR ĐB1 Lượng axit lactic sinh chủng ĐB tương đối ổn định qua ngày có xu hướng giảm chủng TL ( nồng độ LA thu nhận ngày thứ 7mg/l giảm 5mg/l so với ngày thứ nhất) Tương tự chủng SS2, lượng LA giảm dần nhiên ngày thứ ngày thứ thu nhận lượng LA tương đối cao với nồng độ 15mg/l 13mg/l Chủng SS3 có khả hịa tan CaCO3 tốt lượng axit lactic sinh môi trường lên men nhiều Cụ thể, lượng LA thu nhận ngày 14mg/l, 25mg/l, 42mg/l Như vậy, chủng nấm khảo sát, chủng SS2 SS3 có khả sinh tổng hợp LA tốt chọn để thực thí nghiệm 33 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hàm lượng L- axit lactic sinh Nhằm xác định ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh LA, chủng nấm mốc SS2 SS3 nuôi môi trường sinh tổng hợp LA khảo sát ngày liên tiếp Kết thể qua hình 4.10 SS2 Ngày ngày Ngày SS3 Ngày Tinh bột Lactose D- Maltose D- Xylose Saccarose Glucose Tinh bột Lactose D- Maltose D- Xylose Saccarose 20 18 16 14 12 10 Glucose Nồng độ axit lactic (mg/l) Nguồn cacbon Ngày Hình 4.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh L- axit lactic Với môi trường chứa saccharose, lactose tinh bột, chủng SS2 có khả sinh tổng hợp LA tốt Lượng LA sinh nhiều ghi nhận môi trường nuôi cấy chứa saccharose với 18,42 mg/l ngày thứ Lượng LA có xu hướng giảm từ ngày thứ ổn định ngày thứ ngày thứ Với môi trường chứa D – xylose, lượng LA sinh nhiều ngày thứ đạt nồng độ thấp ngày thứ 1, 3, không ghi nhận lượng LA sinh ngày thứ Đối với môi trường chứa glucose, lượng LA sinh tăng dần theo ngày nhiên nồng độ không cao, điều ngược lại quan sát thấy môi trường chứa D – maltose Với môi trường chứa lactose, ghi nhận nồng độ LA sinh cao ngày sau giảm dần ổn định ngày ngày Với môi trường chứa tinh bột, nồng độ LA chênh lệch không đáng kể ngày thứ ngày thứ giảm mạnh từ ngày thứ đạt 2,19 mg/l vào ngày thứ 34 Tương tự SS3, môi trường bổ sung saccharose mơi trường thích hợp để chủng SS3 sinh tổng hợp LA cao với nồng độ LA 14,16 mg/l ngày thứ Với môi trường chứa glucose, nồng độ LA có xu hướng giảm dần Nồng độ LA tăng lên đến ngày vàvngày giảm xuống ổn định ngày 4,5 môi trường chứa D- xylose tinh bột Nồng độ LA có xu hướng tăng dần đạt nồng độ cao ngày 13,13 mg/l môi trường chứa D – Maltose Từ kết cho thấy nguồn cacbon khảo sát, saccharose nguồn cacbon thích hợp để chủng SS2 SS3 sinh tổng hợp LA tốt Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến hàm lượng L- axit lactic sinh Bên cạnh ảnh hưởng nguồn cacbon, lượng LA sinh nấm mốc chịu ảnh hưởng nguồn nitrogen Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến hàm Nồng độ axit lactic (mg/l) lượng LA sỉnh chủng SS2 SS3 thể qua hình 4.11 Nitrogen 30 25 20 15 10 (NH4)2SO4 NH4NO3 NH4Cl Yeast extract (NH4)2SO4 NH4NO3 SS2 Ngày NH4Cl Yeast extract SS3 Ngày Ngày Ngày Ngày Hình 4.11 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả sinh L- axit lactic Kết cho thấy nguồn nitrogen khác có sản sinh LA khác Với chủng SS2, môi trường chứa (NH4)2SO4 NH4NO3 xu hướng lượng LA sinh giảm xuống theo ngày Với môi trường chứa NH4Cl, lượng LA sinh thấp đạt nồng độ 1,39 mg/l vào ngày thứ Tuy nhiên, nồng độ LA 35 có xu hướng tăng dần qua ngày quan sát thấy môi trường chứa yeast extract, đạt cực nồng độ cực đại ngày thứ (26,59 mg/l) Với chủng SS3, môi trường chứa nguồn nitrogen yeast extract có nồng độ LA sinh cao ngày (14,05 mg/l) sau giảm dầm từ ngày Với nguồn nitrogen (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3 nồng độ LA sinh cao ghi nhận nồng độ thấp ngày lại Theo Hurok Oh & cs., (2003) liều lượng chiết xuất nấm men phát triển tế bào tỷ lệ thuận với loại nấm men nồng độ chiết xuất 30 g/L, suất axit lactic tương quan tuyến tính với liều lượng chiết xuất men 25 g/L Tuy nhiên, tăng hàm lượng chiết xuất làm tăng tổng chi phí sản xuất LA Ảnh hưởng pH đến hàm lượng L- axit lactic sinh Điều kiện pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả trưởng, phát triển sinh tổng hợp LA chủng nấm Chủng SS2 SS3 nuôi môi trường với giá trị pH thay đổi từ đến để đánh giá hàm lượng LA sinh Kết trình bày hình 4.12 Nồng độ axit lactic (mg/l) pH 35 30 25 20 15 10 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 SS2 Ngày ngày SS3 Ngày Ngày Ngày Hình 4.12 Ảnh hưởng pH đến khả sinh L- axit lactic 36 Theo kết hình 4.12 cho thấy, chủng SS2 pH8 vào ngày thứ lượng LA sinh tương đối (3,87 mg/l) nhiên kể từ ngày thứ lượng LA tăng đáng kể đạt cực đại vào ngày thứ (29,54 mg/l) Ở giá trị pH9 lượng LA sinh tất ngày thấp có xu hướng giảm dần đạt 0,76 mg/l vào ngày thứ Do đó, giá trị pH9 khơng thích hợp để chủng SS2 sinh tổng hợp LA Đối với chủng SS3 giá trị pH4 lượng LA tương đối ổn định tất ngày, tương tự pH8 pH9 Tại giá trị pH5 lượng LA tăng dần qua ngày khảo sát vào ngày thứ lượng LA sinh nhiều (22mg/l) Ở giá trị pH từ đến chủng SS3 có khả sinh tổng hợp LA tốt ngày thứ Kết Miura & cs., (2003) cho thấy suất axit lactic cao (93 g / L) đạt pH 6,0–6,5 Tương tự chủng SS2 có pH8 thích hợp sinh LA cao ngày thứ Chủng SS3 có pH5 thích hợp sinh LA cao ngày thứ 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Phân lập 20 chủng nấm mốc từ hoa hỏng quanh khu vực Gia LâmHà Nội Tuyển chọn chủng có khả sinh LA SS1; SS2; SS3; TL; CR; HĐB; HĐB1 Trong chủng SS2 biểu khả sinh tổng hợp LA tốt Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng nấm mốc tuyển chọn Môi trường PDA loại môi trường phổ biến thích hợp cho phát triển nấm mốc Qua đặc điểm hình thái quan sát cho thấy chủng nấm mốc tuyển chọn thuộc hai lồi khác Khảo sát khả sinh LA mơi trường sinh tổng hợp LA lựa chọn hai chủng SS2 SS3 để tối ưu điều kiện nuôi cấy Yeast extract- nguồn nitrogen , saccharose- nguồn cacbon, pH= chủng SS3, pH=8 chủng SS2 Đây điều kiện thích hợp để chủng SS2 SS3 sinh tổng hợp LA với nồng độ cao Từ đó, lựa chọn mơi trường sinh tổng hợp LA(g/l): Saccharose 60; Yeast extract 1,35; MgSO4.7H2O 0,25; ZnSO4.7H2O 0,04; KH2PO4 0,3 Kiến nghị - Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp LA với thời gian dài - Chạy HPLC để chứng minh chủng nấm mốc có khả sinh đồng phân Laxit lactic - Định danh chủng SS2 SS3 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng việt Bùi Hoàng Đăng Long, Phạm Quang Sin, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh Ngô Thị Phương Dung (2019) Khảo sát điều kiện lên men acid lactic từ rỉ đường sử dụng vi khuẩn lactic chịu nhiệt Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019) (2): 103-109 Châu Văn Mạnh Nấm mốc, loại nấm mốc sinh độc tố tác động loại độc tố nấm, sản phẩm biến dưỡng nấm mốc đời sống Trường Đại học Nông lâm TP.HCM GS.TS Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2009) Giáo trình vi sinh vật học, NXB Giáo Dục Nguyễn Quốc Việt, Nghiêm Quốc Đạt, Trần Đình Mấn (2015) Sử dụng gen Lactate Dehydrogenease (LDH) làm thị phân tử cho sàng lọc chủng Rhizopus Oryzae sinh Lactic acid cao Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(2): 335343 Nguyễn Thị Minh Hằng, Nguyễn Minh Thư (2013) Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Lactic có khả sinh tổng hợp Amylase Bacteriocin Tạp chí khoa học cơng nghệ lâm nghiệp số (kỳ i) PGs Ts Nguyễn Văn Bá, PGs Ts Cao Ngọc Diệp, Ts Nguyễn Văn Thành (2005) “Đại cương nấm mốc”, Chương 1, giáo trình môn nấm mốc Trường Đại học Cần Thơ – Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học  Tiếng anh Abe A., Sone T., Sujaya I N., Saito K., Oda Y., Asano K., Tomita F J B., biotechnology, & Biochemistry (2003) rDNA ITS sequence of Rhizopus oryzae: its application to classification and identification of lactic acid producers 67(8): 1725-1731 Andrea Komesu a., * Johnatt Allan Rocha de Oliveira,b Luiza Helena da Silva Martins,a, Maria Regina Wolf Maciel a & A a R M F 2017 Lactic Acid Production to Purification: A Review 39 Borshchevskaya L., Gordeeva T., Kalinina A & Sineokii S J J o a c (2016) Spectrophotometric determination of lactic acid 71: 755-758 10.Chahal S P & Starr J N J U s e o i c (2000) Lactic acid 11.Chholten (1971) axit lactic 12.Davachi S M., Kaffashi B J P.-P T & Engineering (2015) Polylactic acid in medicine 54(9): 944-967 13.Domínguez J & Vázquez M J C.-J o F (1999) Effect of the Operational Conditions on the l-lactic Acid Production by Rhizopus oryzae Efecto De Las Condiciones De Operación En La Producción De Acido l-láctico Por Rhizopus Oryzae Efecto Das Condicións De Operación Na Producción De Acido lláctico Por Rhizopus oryzae 2(3): 113-118 14.Henton D E., Gruber P., Lunt J & Randall J (2005) Polylactic acid technology Trong: Natural fibers, biopolymers, and biocomposites CRC Press: 559-607 trang 15.Jin B., Yin P., Ma Y., Zhao L J J o I M & Biotechnology (2005) Production of lactic acid and fungal biomass by Rhizopus fungi from food processing waste streams 32(11-12): 678-686 16.Kurniawati T., Indrati R & Sardjono (2014) ISOLATION OF Rhizopus oryzae from rotten fruit and its potency for lactic acid production in glucose medium with and without addition of calcium carbonate Agritect 34 17.Narayanan N., Roychoudhury P K & Srivastava A J E j o B (2004) L (+) lactic acid fermentation and its product polymerization 7(2): 167-178 18.Siparsky G L., Voorhees K J & Miao F (1998) Hydrolysis of Polylactic Acid (PLA) and Polycaprolactone (PCL) in Aqueous Acetonitrile Solutions: Autocatalysis Journal of environmental polymer degradation 6(1): 31-41 19.Wang X., Sun L., Wei D., Wang R J J o i m & Biotechnology (2005) Reducing by-product formation in L-lactic acid fermentation by Rhizopus oryzae 32(1): 38-40 40 20.Wee Y.-J., Kim J.-N., Ryu H.-W J F T & Biotechnology (2006) Biotechnological production of lactic acid and its recent applications 44(2): 163-172 21.Wiyantoko B & Astuti A (2020) Butterfly Pea (Clitoria Ternatea L.) Extract as Indicator of Acid-Base Titration Indonesian Journal of Chemical Analysis (IJCA) 3(1): 22-32 22.Wu X., Jiang S., Liu M., Pan L., Zheng Z & Luo S (2011a) Production of llactic acid by Rhizopus oryzae using semicontinuous fermentation in bioreactor Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 38(4): 565571 23.Wu X., Jiang S., Liu M., Pan L., Zheng Z., Luo S J J o I M & Biotechnology (2011b) Production of L-lactic acid by Rhizopus oryzae using semicontinuous fermentation in bioreactor 38(4): 565-571 24.Zain N A M., Aziman S N., Suhaimi M S., Idris A J J o P & Environment t (2021) Optimization of L (+) lactic acid production from solid pineapple waste (SPW) by Rhizopus oryzae NRRL 395 29: 230-249 25 Gwynne-Vaughan, H C I & Barnes, B (1937) The Structure & Development of the Fungi 2nd edn Cambridge University Press, Cambridge, UK 516-518 26.Webster, J (1970) Introduction to Fungi Cambridge University Press, Cambridge, UK 27.Zhang J., Bu Y., Zhang C., Yi H., Liu D & Jiao J (2020) Development of a Low-Cost and High-Efficiency Culture Medium for Bacteriocin Lac-B23 Production by Lactobacillus plantarum J23 Biology (Basel) 9(7) 28.M Hujanen, YY Linko, Effect of temperature and different nitrogen sources on L(+) - lactic acid production by Lactobacillus casei,Appl Microbiology Biotechnol 45(1996) 307–313 41 29.W Fu, AP Mathews, Production of lactic acid from lactose by Lactobacillus plantarum: Kinetic modeling and effects of pH, substrate and oxygen, Biochemistry English J 3(1999) 163–170 30.SKORY, CD; FREER, SN and BOTHAST, V Production of L-Lactic acid by Rhizopus oryzae under oxygen-limited conditions Biotechnology Letters, 1998, vol 20, no 2, p In 191-194 31.Hyon, sh; Jamshidi, k And Ikada, y Synthesis of polylactides of different molecular weights Biomaterials, 1997, vol 18, no 22, p 1503-1508 32.Shikinami, y ; Kwarada, h.; Hiroyuki, n And Chika, n Bio-absorbable polymeric clay and binder US Patent 6387391, USA, 2002 33.Das RK, Brar SK (2014) Enhanced fumaric acid production from brewery wastewater and insight into the morphology of Rhizopus oryzae1526 Appl Biochem Biotechnol 172(6): 2974-88 16:58 34.ZY Zhang, B Jin, JM Kelly, Production of lactic acid and by-products from waste potato starch by Rhizopus arrhizus: the role of nitrogen sources, World J Microbiol Biotechnol 23 (2007) 229–236 35.S Miura, T Arimura, M Hoshino, M Kojima, L Dwiarti, M Okabe, Optimizaiton and scaling-up of l-lactic acid fermentation by mutant strain Rhizopussp MK-96-1196 in airlift bioreactor, J Biosci Bioeng 96 (2003) 65–69 36.Hurok Oh, Young-Jung Wee, Jong-Sun Yun, Hwa Won Ryu (2003) Lactic Acid Production Through Cell-Recycle Repeated-Batch Bioreactor Biotechnology for Fuels and Chemicals, ISBN : 978-1-4612-6592-4 37.Ajala E O., Ajala M A., Onoriemu O O., Akinpelu S G., Bamidele S H J B., Bioproducts & Biorefining (2021) Lactic acid production: Utilization of yam peel hydrolysate as a substrate using Rhizopus orysae in kinetic studies 15(4): 1031-1045 38.Bai D.-M., Jia M.-Z., Zhao X.-M., Ban R., Shen F., Li X.-G & Xu S.-M J C E S (2003) L (+)-lactic acid production by pellet-form Rhizopus oryzae R1021 in a stirred tank fermentor 58(3-6): 785-791 42 39.Bulut S., Elibol M & Ozer D (2004) Effect of different carbon sources on l(+) -lactic acid production by Rhizopus oryzae Biochemical Engineering Journal 21(1): 33-37 40.Datta R., Henry M J J o C T., Biotechnology: International Research in Process E & Technology C (2006) Lactic acid: recent advances in products, processes and technologies—a review 81(7): 1119-1129 41.Inui T., Takeda Y., Iizuka H J T J o G & Microbiology A (1965) Taxonomical studies on genus Rhizopus 11(Supplement): 1-121 42.Juturu V & Wu J C J C R i B (2016) Microbial production of lactic acid: the latest development 36: 967 - 977 43.Meussen B J., De Graaff L H., Sanders J P., Weusthuis R A J A m & Biotechnology (2012) Metabolic engineering of Rhizopus oryzae for the production of platform chemicals 94(4): 875-886 44.Sajewicz M., Gontarska M., Kronenbach D & Kowalska T J A C (2008) Investigation of the spontaneous oscillatory in-vitro chiral conversion of L(+)-lactic acid 20(2): 209-225 45.Singh S K., Ahmed S U & Pandey A J P B (2006) Metabolic engineering approaches for lactic acid production 41(5): 991-1000 46.Soccol C., Stonoga V., Raimbault M J w J o M & Biotechnology (1994) Production of L-lactic acid by Rhizopus species 10(4): 433-435  Trang web 47.Ngô Lâm Tuấn Anh Sản xuất axit lactic [Online] Truy cập từ https://tailieumienphi.vn/doc/cong-nghe-san-xuat-acid-lactic-59a2tq.html ngày 8/30/2018 48.Nhựa sinh học phân hủy Truy cập từ https://thienkiman.com//nhua-sinh-hocpla-la-gi/ 2021/05/26 49 Rhizopus oryzae [Online] Truy cập từ https://en.wikipedia.org/wiki/Rhizopus_oryzae ngày 27/11/2022 43 PHỤ LỤC Phụ lục Chủng SS2 lên men điều kiện nuôi cấy khác  Môi trường bổ sung nguồn cacbon khác  Môi trường bổ sung nguồn nitrogen khác  pH 44 Phụ lục Chủng SS3 lên men điều kiện nuôi cấy khác  Môi trường bổ sung nguồn cacbon khác  Môi trường bổ sung nguồn nitrogen khác  pH 45 Phụ lục Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả sinh axit lactic chủng SS2 SS3  Nguồn cacbon khác SS2 SS3 Ngày ngày Ngày Ngày Ngày Glucose 1.85 3.46 4.15 4.84 5.3 Saccarose 18.42 11.86 9.33 8.06 8.06 D- Xylose 4.03 10.36 2.19 1.39 D- Maltose 4.72 5.3 4.15 2.77 Lactose 11.98 6.11 4.03 3.11 2.88 Tinh bột 11.4 11.52 7.37 5.53 2.19 Glucose 6.91 6.57 5.07 3.11 2.54 Saccarose 4.49 9.9 14.16 8.18 5.53 D- Xylose 1.85 2.31 4.38 2.88 2.77 D- Maltose 2.08 4.61 6.34 8.98 13.13 Lactose 3.34 3.8 3.11 3.23 1.96 Tinh bột 1.85 5.65 3.46 3.46 3.11  Nguồn nitrogen khác SS3 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày (NH4)2SO4 3.46 5.88 9.21 5.53 3.69 NH4NO3 5.42 9.1 7.03 4.84 2.65 NH4Cl 3.11 6.57 4.84 2.31 1.27 14.05 11.29 8.75 7.83 7.14 (NH4)2SO4 15.08 12.21 8.75 5.3 5.42 NH4NO3 9.21 7.37 6.45 6.11 5.53 NH4Cl 3.57 6.22 5.76 4.61 1.39 12.21 18.54 21.18 23.26 26.59 Yeast extract SS2 Yeast extract 46  pH Ngày SS2 SS3 ngày Ngày Ngày Ngày pH4 10.54 7.32 7.78 10.31 18.37 pH5 4.9 4.44 6.52 3.29 15.38 pH6 3.98 2.72 6.63 3.87 14.8 pH7 6.98 6.05 9.39 15.84 23.55 pH8 3.87 18.72 18.26 15.72 29.54 pH9 5.71 6.05 2.49 1.34 0.76 pH4 4.67 6.52 5.82 6.63 8.13 pH5 1.91 3.29 4.1 7.21 17.1 pH6 2.14 4.79 5.71 6.86 14.34 pH7 11.23 8.82 12.73 13.31 16.3 pH8 13.65 14 10.89 11.92 12.96 pH9 0.07 4.44 5.71 5.94 6.17 Phụ lục Khả sinh tổng hợp axit lactic chủng nấm tuyển chọn SS1 SS2 SS3 TL CR ĐB ĐB1 Ngày 12 15 14 12 Ngày 15 13 25 13 10 12 Ngày 42 7 10 47