Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm vi khuẩn azotobacter spp từ đất trồng lúa ở thái bình

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN AZOTOBACTER SPP TỪ ĐẤT TRỒNG LÚA Ở THÁI BÌNH HÀ NỘI – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN AZOTOBACTER SPP TỪ ĐẤT TRỒNG LÚA Ở THÁI BÌNH Sinh viên thực : TRẦN THỊ PHƯƠNG THÚY Lớp : K64CNSHA Mã sinh viên : 643012 Giảng viên hướng dẫn : ThS PHAN THỊ HIỀN TS PHẠM THỊ DUNG Bộ môn : SHPT & CNSH Ứng dụng Khoa : Công nghệ Sinh học HÀ NỘI – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết trình bày khố luận hoàn toàn trung thực Kết thu thập dựa vào trình nghiên cứu khoa học trực tiếp hướng dẫn ThS Phan Thị Hiền TS Phạm Thị Dung, giảng viên môn SHPT& CNSH Ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin cam đoan thơng tin tham khảo khố luận ghi rõ nguồn gốc mục tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Trần Thị Phương Thúy i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới Ban Giám đốc Học viện, thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Bộ môn SHPT & CNSH Ứng dụng thầy, tồn Học viện tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập, rèn luyện, nghiên cứu Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới ThS Phan Thị Hiền TS Phạm Thị Dung, giảng viên môn SHPT& CNSH Ứng dụng, khoa Cơng nghệ Sinh học tận tình hướng dẫn suốt q trình nghiên cứu, thực hồn thành khoá luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, anh chị, bạn bè dạy, góp ý, động viên suốt q trình thực tập khố luận Trong q trình thực tập khố luận, nhận thấy vốn hiểu biết kinh nghiệm nhiều hạn chế nên nghiên cứu chưa thể hoàn thiện cách tốt Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy để báo cáo hoàn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Trần Thị Phương Thúy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu 3 Yêu cầu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan vi sinh vật cố định Nitơ 1.1 Chu trình Nitơ tự nhiên 1.1.1 Giai đoạn cố định Nitơ 1.1.2 Khống hóa 1.1.3 Giai đoạn Nitrat hóa 1.1.4 Giai đoạn khử khống hóa 1.1.5 Giai đoạn phản nitrat hóa 1.2 Các vi sinh vật cố định Nitơ phân tử 1.3 Quá trình cố định Nitơ phân tử 11 1.3.1 Con đường hóa học 11 1.3.2 Con đường sinh học 11 1.4 Vi khuẩn Azotobacter 12 1.4.1 Phân loại 12 1.4.2 Đặc điểm hình thái 13 iii 1.4.3 Sự hình thành nang vi khuẩn Azotobacter 15 1.4.4 Sự nảy mầm nang 16 1.4.5 Đặc tính sinh lý 17 1.4.6 Sự phân bố Azotobacter spp tự nhiên 18 1.5 Các nghiên cứu nước phân lập, tuyển chọn, nhân giống nhân sinh khối vi khuẩn Azotobacter 19 1.5.1 Tình hình nghiên cứu nước 19 1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 20 1.6 Hiệu sử dụng chế phẩm phân bón chứa Azotobacter 21 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.1.1 Vật liệu 23 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 24 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất thí nghiệm 25 2.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp thu mẫu 26 2.3.2 Phân lập vi khuẩn Azotobacter spp 27 2.3.3 Phương pháp làm khuẩn lạc 27 2.3.4 Phương pháp nhuộm gram 28 2.3.5 Tách chiết DNA genome vi khuẩn Azotobacter spp 29 2.3.6 Điện di DNA tổng số 30 2.3.7 Phương pháp PCR (Polymerasae Chain Reaction) 30 2.3.8 Xác định khả cố định đạm Azotobacter spp 31 2.3.9 Xác định khả sinh IAA Azotobacter spp 32 2.3.10 Xác định ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng vi khuẩn 33 iv CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Mẫu đất thu thập Thái Bình 34 3.2 Kết phân lập chủng vi khuẩn 35 3.2.1 Kết quan sát khuẩn lạc 35 3.2.2 Kết nhuộm gram quan sát nang vi khuẩn 37 3.3 Ảnh hưởng nguồn Carbon đến sinh trưởng vi khuẩn 38 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tới trình sinh trưởng vi khuẩn 39 3.5 Xác định vi khuẩn Azotobacter spp thị phân tử 40 3.5.1 Kết điện di tổng số 40 3.5.2 Kết điện di sản phẩm PCR 41 3.6 Kết định tính với thuốc thử Nessler 42 3.7 Kết định tính với thuốc thử Salkowski 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nguồn gốc mẫu đất 23 Bảng 2.2 Thành phần môi trường thạch Asbhy manitol 24 Bảng 2.3 Thành phần môi trường thạch Asbhy glucose 24 Bảng 2.4 Thành phần môi trường thạch Asbhy sucrose 24 Bảng 2.5 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 25 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.7 Thành phần thuốc thử Salkowkski 32 Bảng 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Azotobacter spp Sau ngày nuôi cấy môi trường Asbhy 36 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng vi khuẩn 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn 40 Bảng 3.4 Kết quan sát đặc điểm đặc trưng chủng vi khuẩn 44 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vịng tuần hoàn Nitơ sở (.Nguyễn Lân Dũng et al., 2007) Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn chu trình Nitơ tự nhiên Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu đồ vệ tinh tỉnh Thái Bình 23 Hình 2.2 Các bước pha loãng mẫu 27 Hình 3.1 Mẫu đất lấy từ đất trồng lúa Thái Bình 34 Hình 3.2 Kết phân lập mẫu đất môi trường Asbhy, sau ngày nuôi cấy 36 Hình 3.3 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn OS01, OS02, OS03 37 Hình 3.4 Vi khuẩn chủng OS02 hình thành nang sau 13 ngày ni cấy 38 Hình 3.5 Vi khuẩn chủng OS02 hình thành nang sau 20 ngày ni cấy 38 Hình 3.6 Kết điện di tổng số gel agarose 2%, 120 V 20 phút 41 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1%, 120 V 30 phút 42 Hình 3.8 Kết khả cố định đạm mẫu sử dụng thuốc thử Nessler 43 Hình 3.9 Kết khả sinh IAA mẫu sử dụng thuốc thử Salkowski 44 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A _ beijerinckii: Azotobacter beijerinckii CTAB: Cetyl Trimetyl Amoni Bromua DNA: Axit Deoxyribonucleic IAA: 3-Indole acetic acid PCR: Phản ứng chuỗi polymerase SR: Mẫu đất TE: Tris EDTA TAE: Tris Acetate EDTA viii Biểu đồ giá trị pH mẫu đất 7.6 Giá trị pH 7.4 7.2 6.8 6.6 6.4 SR01 SR02 SR03 SR04 SR05 Các mẫu đất thu thập 3.2 Kết phân lập chủng vi khuẩn 3.2.1 Kết quan sát khuẩn lạc Từ mẫu đất thu thập từ ruộng lúa thơng qua q trình phân lập làm thuần, tiến hành phân lập dạng khuẩn lạc môi trường Asbhy Các chủng vi khuẩn sau làm đặt tên theo phần mẫu đánh số thứ tự Kết phân lập từ mẫu đất nhận thấy mẫu có khuẩn lạc Azotobacter Mỗi mẫu có 2-3 dạng khuẩn lạc 35 OS01 OS02 OS03 Hình 3.2 Kết phân lập mẫu đất môi trường Asbhy, sau ngày nuôi cấy Bảng 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Azotobacter spp Sau ngày nuôi cấy môi trường Asbhy STT Ký hiệu Hình dạng Hình dạng chủng OS01 khuẩn lạc Trịn tế bào Hình que Màu Trạng Bề Viền sắc thái mặt khuẩn khuẩn khuẩn khuẩn lạc lạc lạc lạc Trong Nhày Lồi suốt OS02 Trịn Hình que phẳng Trắng Hơi đục nhày 36 Viền Phẳng Viền nhăn OS03 Trịn Hình que Trắng Nhày Lồi sữa Viền phẳng Theo quan sát, chủng Azotobacter phân lập có đặc điểm sau: Các chủng vi khuẩn phân lập có màu sắc, kích thước hình dáng khuẩn lạc đa dạng Khuẩn lạc giai đoạn đầu chủng nhày, có màu trắng đục, trắng sữa trắng trong, kết phù hợp với nghiên cứu Đỗ Thu Hà (2008) Nguyễn Thị Luyến (2011) Sau khuẩn lạc trưởng thành có đặc điểm sau: - OS01: Khuẩn lạc trịn, nhày, suốt, lồi, có viền nhẵn, d= 0.8-3 mm - OS02: Khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, phẳng, nhày, viền nhăn, d= 0.5-1.2 mm - OS03: Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, nhầy, lồi, viền nhẵn, d= 0.2-1 mm 3.2.2 Kết nhuộm gram quan sát nang vi khuẩn Hình 3.3 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn OS01, OS02, OS03 Quan sát kết nhuộm gram kính hiển vi với độ phóng đại 100x cho thấy loại vi khuẩn thu có hình que, vi khuẩn gram âm Có thể thấy chủng phân lập có đặc điểm phù hợp với nghiên cứu trước vi khuẩn Azotobacter 37 Hình 3.4 Vi khuẩn chủng OS02 hình thành Hình 3.5 Vi khuẩn chủng OS02 hình nang sau 13 ngày ni cấy thành nang sau 20 ngày nuôi cấy Kết quan sát kính hiển vi sau 13 ngày ni cấy thấy xuất số nang hình cầu nhỏ, sau 20 ngày nuôi cấy môi trường thiếu hụt chất dinh dưỡng, xuất nhiều nang khuẩn Đây đặc điểm đặc trưng vi khuẩn Azotobacter 3.3 Ảnh hưởng nguồn Carbon đến sinh trưởng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn thu có khả sử dụng nhiều nguồn carbon hữu cho sinh trưởng, số nguồn carbon sử dụng mang tính chất đặc trưng cho lồi yếu tố để phân loại vi khuẩn Để xác định khả sử dụng số nguồn carbon cho sinh trưởng chủng OS01, OS02, OS03, tiến hành nuôi cấy chủng mơi trường Asbhy Trong đó, nguồn carbon mơi trường gốc loại bỏ hoàn toàn thay nguồn carbon khác như: Mannitol, Glucose, Succrose Bảng thể mức độ phát triển vi khuẩn sử dụng nguồn carbon khác 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng vi khuẩn STT Nguồn Carbon OS01 OS02 OS03 Manitol ++ +++ ++ Glucose +++ ++ ++ Sucrose + ++ + Chú thích: + sinh trưởng ++ Sinh trưởng ổn định +++ Sinh trưởng tốt Từ kết quan sát khuẩn lạc phát triển mơi trương thạch Ashby có nguồn Carbon khác nhận thấy, chủng vi khuẩn có khả phát triển mơi trường có nguồn Carbon manitol, glucose, sucrose Tuy nhiên chủng OS01 phát triển tốt mơi trường có nguồn carbon glucose, chủng OS02 phát triển tốt mơi trường có nguồn carbon manitol, chủng OS03 phát triển tốt mơi trường có nguồn carbon manitol glucose 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tới trình sinh trưởng vi khuẩn Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn Mỗi chủng vi sinh vật khác có mức nhiệt độ tối ưu khác để sinh trưởng, phát triển tốt Vì việc đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ nuôi đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn phan lập thực cần thiết để chọn điều kiện tốt để chúng sinh trưởng tốt nhất, từ tạo tảng cho việc nghiên cứu ứng dụng chủng vào sản xuất phân bón, chế phẩm vi sinh sau Các chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường thạch asbhy, tủ ni điều chỉnh đến nhiệt độ thí nghiệm 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn STT Nhiệt độ OS01 OS02 OS03 – 8oC - - - 15-17oC + ++ + 30oC +++ +++ +++ 50oC - - - Chú thích: - Khơng sinh trưởng + sinh trưởng ++ Sinh trưởng ổn định +++ Sinh trưởng tốt Sau ngày quan sát khả phát triển chủng nhiệt độ khác nhau, kết cho thấy chủng phát triển nhiệt độ từ 15 – 30oC Các chủng phát triển tốt điều kiện nhiệt độ 28-30oC Ở điều kiện nhiệt độ thấp (4 – 8oC) nhiệt độ cao (50oC) chủng vi khuẩn không phát triển, không phát có khuẩn lạc 3.5 Xác định vi khuẩn Azotobacter spp thị phân tử 3.5.1 Kết điện di tổng số Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp tách chiết CTAB Doyle cs, 1991 để trích xuất DNA từ Azotobacter spp Dung dịch đệm Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) không sử dụng cho tách chiết DNA từ thực vật nhiều đệm chiết xuất khác mà nhiều mẫu khác nấm, tảo, vi khuẩn máu người Nguyên tắc phương pháp sử dụng cetyl-trimethylamonium bromide (CTAB), có khả phá vỡ màng tế bào, sau màng chúng bị 40 phá vỡ, DNA dễ hòa tan nhiều với chất khác Do đó, CTAB đóng vai trò quan trọng tách chiết DNA Từ chủng Azotobacter OS01, OS02, OS03, tiến hành điện di tổng số, thu kết sau: Hình 3.6 Kết điện di tổng số gel agarose 2%, 120 V 20 phút Sau thu DNA, kiểm tra chất lượng DNA điện di Gel agarose 2% 120V Kết điện di (Hình 3.3) cho thấy vạch băng gọn gàng sắc nét, DNA không bị đứt độ tinh khiết cao, đảm bảo cho việc thực phản ứng PCR thí nghiệm 3.5.2 Kết điện di sản phẩm PCR Để nhận diện chủng vi khuẩn tuyển chọn, chủng vi khuẩn tách DNA theo phương pháp Wakarera cs., 2022 cặp mồi 27F 1492R để khuếch đại vùng 16S rDNA chủng OS01, OS02, OS03 41 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1%, 120 V 30 phút Chú thích: Giếng M: Marker 1kb, giếng ĐC: Mẫu đối chứng âm; giếng 1: Mẫu OS01; giếng 2: Mẫu OS02, giếng 3: Mẫu OS03 Kết điện di kiểm tra sản phẩm gel điện di cho thấy băng có kích thước khoảng ~1500 bp So sánh đối chiếu báo công bố (Wakarera et al., 2022) đặc điểm đặc trưng hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn cho thấy vi khuẩn Azotobacter spp 3.6 Kết định tính với thuốc thử Nessler Kết so màu với thuốc thử Nessler cho thấy chủng phân lập phản ứng với thuốc thử có màu vàng nâu NH3 phản ứng với thuốc thử Nessler’s dung dịch có mơi trường kiềm mạnh K2HgI4 tạo thành hệ chất keo có màu vàng nâu 42 Do màu vàng có độ đậm nhạt khác tùy thuộc vào hàm lượng NH4 + mà chủng Azotobacter sinh dung dịch nuôi cấy lỏng, lắc Trong chủng vi khuẩn phân lập được, chủng OS02 có màu vàng đậm chủng OS03 có màu vàng nhạt Chủng OS01 có mức độ bắt màu đậm chủng OS03 Từ kết quan sát màu sắc phản ứng thấy mức độ cố định đạm chủng OS02 mạnh chủng OS01 mạnh chủng OS03 Hình 3.8 Kết khả cố định đạm mẫu sử dụng thuốc thử Nessler 3.7 Kết định tính với thuốc thử Salkowski Kết so màu với thuốc thử Salkowski cho thấy chủng phân lập phản ứng với thuốc thử có màu hồng, màu đặc trưng phản ứng với thuốc thử Salkowski IAA Màu hồng có độ đậm nhạt khác tùy thuộc vào hàm lượng IAA mà chủng Azotobacter sinh dung dịch nuôi cấy lỏng, lắc Quan sát phản ứng thấy chủng vi khuẩn phân lập được, chủng OS02 có màu hồng đậm chủng OS03 có màu hồng nhạt Chủng 43 OS01 có mức độ bắt màu đậm chủng OS03 Từ thấy mức độ sinh IAA chủng OS02 tốt chủng OS01 tốt chủng OS03 Hình 3.9 Kết khả sinh IAA mẫu sử dụng thuốc thử Salkowski Bảng 3.4 Kết quan sát đặc điểm đặc trưng chủng vi khuẩn STT Đặc điểm Đặc OS01 OS02 điểm Khuẩn khuẩn lạc OS03 lạc Khuẩn lạc tròn, bề Khuẩn lạc trịn, hình trịn, bề mặt phẳng, lồi bề mặt lồi, rìa mặt lồi, rìa giữa, rìa nhăn, màu phẳng, màu phẳng, trắng đục, nhày trắng đục, nhày, suốt, nhày, giữa, d= 0.5-1.2 mm d=0.2-1 mm d=0.8-3 mm Nhuộm gram Gram âm Gram âm Gram âm Hình thái vi Hình que ngắn Hình que Hình que khuẩn Khả có hình thành có nang 44 có Màu khuẩn Hơi ngả màu Hơi vàng nhạt lạc già Vàng nhạt nâu Có khả có có có Có có 28-30oC 28-30oC cố định Nitơ Có khả Có sinh IAA Nhiệt độ tối 28-30oC ưu Các chủng xác định đặc trưng mặt sinh hóa mơi trường Ashby khác biệt dựa đặc tính hình thái sinh lý Để phân tích phân tử, gen 16S rDNA khuếch đại cách sử dụng cặp mồi (bao gồm mồi 27F 1492R), sau sản phẩm PCR điện di để phân tích kết Kết quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào đánh giá số đặc điểm vi khuẩn thấy, vi khuẩn thu có đặc điểm đặc trưng vi khuẩn Azotobacter là: vi khuẩn có hình que, bắt màu gram âm, có khuẩn lạc nhày, già khuẩn lạc chuyển màu vàng nhạt nâu nhạt Vi khuẩn có khả hình thành nang gặp mơi trường có số điều kiện bất lợi Đặc biệt vi khuẩn có khả cố định đạm sinh IAA Kết thu tương tự với mô tả vi khuẩn Azotobacter Lương Đức Phẩm, 1998 kết nghiên cứu vi khuẩn Azotobacter Nguyễn Thu Hằng cộng sự, 2015 45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận ❖ Trong nghiên cứu mẫu đất khác tỉnh Thái Bình phân lập thạch Ashby thu dòng vi khuẩn Các vi khuẩn phân lập đa dạng màu sắc, hình thái kích thước Các chủng sau hóa đặt tên theo mục tiêu nghiên cứu, đánh số từ OS01, OS02, OS03, chủng gram âm ❖ Kết quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào đánh giá số đặc điểm vi khuẩn thấy, vi khuẩn thu có đặc điểm đặc trưng vi khuẩn Azotobacter là: vi khuẩn có hình que, bắt màu gram âm, có khuẩn lạc nhày, già khuẩn lạc chuyển màu vàng nhạt nâu nhạt Vi khuẩn có khả hình thành nang gặp mơi trường có số điều kiện bất lợi Đặc biệt vi khuẩn có khả cố định đạm sinh IAA kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 27f 1492r so sánh với nghiên cứu cơng bố, cho chủng OS01, OS02, OS03 thuộc chủng Azotobacter spp ❖ Chủng OS02 có khả cố định đạm khả sinh IAA tốt chủng OS03 tốt chủng OS01 ❖ Các chủng sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có nguồn Carbon mannitol nhiệt độ 28-300C Kiến nghị ❖ Tiếp tục đánh giá sâu khả cố định đạm khả sinh IAA phân tích định lượng ❖ Đánh giá ảnh hưởng điều kiện môi trường khác đến khả sinh trưởng, cố định đạm sinh IAA chủng ❖ Giải trình tự để xác định chủng có khả cố định đạm sinh IAA tốt 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Châu Ngọc Anh (2012) Đồ án Thiết lập mẫu Azotobacter vùng sinh thái ứng dụng sản xuất phân vô sinh, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM Đỗ Thu Hà (2008), Phân lập tuyển chọn số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza sinh tổng hợp IAA từ đất thơn Bình Kỳ- Hỏa Quỷ - Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng Tuyển tập bảo cáo khoa học, Đại học Đà Nẵng Lê Hồng Thía, Nguyễn Văn Đốn, Châu Thị Thảo Nhi, L T P (2018) Phân lập vi sinh vật từ dày bị định hướng ứng dụng xử lý rác thải nơng nghiệp giàu Cellulose Tạp Chí Khoa Học Cơng Nghệ, 36A Lương Đức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật In Công nghệ vi sinh vật (pp 212–213) Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành, & Lê Thị Hòa (2007) Vi sinh vật Vi Sinh Vật Học, Phần II NXB Giáo Dục, 718, 5–16 Nguyễn Thị Thu Hằng, N T T (2015) Tuyển Chọn Vi Khuẩn Azotobacter Có Khả Năng Cố Định Nitơ Và Sinh Tổng Hợp Iaa 1989, 3–9 Trần Thị Linh (2012) Tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter cho sản xuất phân bón hữu vi sinh vật Trần Thị Xuân Phương, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Thị Thuận, L X D N (2017) Tạp Chí Khoa Học & Cơng Nghệ Nơng Nghiệp Tuyển Chọn Vi Khuẩn Azotobacter Có Khả Năng Cố Định Nitơ Và Sinh Tổng Hợp Iaa Trong Đất Trồng Lúa Ở Tỉnh Thừa Thiên Huế 1(1), 111–118 47 Tài liệu tiếng Anh Aasfar, A., Bargaz, A., Yaakoubi, K., & Hilali, A (2021) Nitrogen Fixing Azotobacter Species as Potential Soil Biological Enhancers for Nitrogen Fixing Azotobacter Species as Potential Soil Biological Enhancers for Crop Nutrition and Yield Stability February https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.628379 Chen, S L., Tsai, M K., Huang, Y M., & Huang, C H (2018) Diversity and characterization of Azotobacter isolates obtained from rice rhizosphere soils in Taiwan Annals of Microbiology, 68(1), 17–26 https://doi.org/10.1007/s13213-017-1312-0 Choudhury, A T M A., & Kennedy, I R (2004) Prospects and potentials for systems of biological nitrogen fixation in sustainable rice production Biology and Fertility of Soils, 39(4), 219–227 https://doi.org/10.1007/s00374-003-0706-2 FAO, Application of Nitrogen-Fixing Systems in Soil Improvement and Management, Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO Soils Bulletin 49, Rome (1982) Glickmann, E., & Dessaux, Y (1995) A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria Applied and Environmental Microbiology, 61(2), 793–796 https://doi.org/10.1128/aem.61.2.793-796.1995 Jewell, W J (1998) Cycles of Life: Civilization and the Biosphere Vaclav Smil In The Quarterly Review of Biology (Vol 73, Issue 4, pp 484–485) https://doi.org/10.1086/420425 Khan, H R., & Rahman, M (2008) Enumeration , Isolation and Identification of Nitrogen-Fixing Bacterial Strains at Seedling Stage in Rhizosphere of Rice Grown in Non-Calcareous Grey Flood Plain Soil of Bangladesh 97– 48 101 Kizilkaya, R (2009) Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiological properties of soils Journal of Environmental Biology, 30(1), 73–82 Mahato, S., & Kafle, A (2018) Annals of Agrarian Science Comparative study of Azotobacter with or without other fertilizers on growth and yield of wheat in Western hills of Nepal Annals of Agrarian Science, 16(3), 250– 256 https://doi.org/10.1016/j.aasci.2018.04.004 Nongthombam, J., Kumar, A., & Sharma, S (2021) Azotobacter : A Complete Review Azotobacter : A Complete Review August Sumbul, A., Ansari, R A., Rizvi, R., & Mahmood, I (2020) Saudi Journal of Biological Sciences Azotobacter : A potential bio-fertilizer for soil and plant health management Saudi Journal of Biological Sciences, 27(12), 3634–3640 https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.08.004 Trautmann, N., & Porter, K (1989) Nitrogen: The Essential Element Wakarera, P W., Ojola, P., & Njeru, E M (2022) Characterization and diversity of agroecosystems native of Azotobacter Eastern spp Kenya https://doi.org/10.1098/rsbl.2021.0612 49 isolated from semi-arid Biology Letters, 18(3)