Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm chủng vi khuẩn bacillus coagulans từ men tiêu hóa yobitic sachet

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM S Ọ -  - U T T ĐỀ TÀ : Â VÀ Ê ỨU MỘT S ĐẶ Đ ỂM CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ ME T ÊU “Y B T ội, 2023 S ET” HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM S Ọ -  - U T T ĐỀ TÀ : Â VÀ Ê ỨU MỘT S ĐẶ Đ ỂM CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ ME T ÊU “Y B T S ET” Sinh viên thực : TRẦN THỊ QUỲNH NGA Lớp : K62 CNSHC Mã sinh viên : 620604 Khoa : SINH HỌC iản viên hƣớn d n : ThS NGUYỄN THANH HUYỀN ội, 2023 LỜ MĐ Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thực thời gian từ 08/2022 – 02/2023 hướng dẫn ThS Nguyễn Thanh Huyền – giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Tất số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu ngồi nước Các tài liệu trích dẫn nêu mục tài liệu tham khảo Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên thực Trần Thị Quỳnh Nga i LỜI CẢM Ơ Trong thời gian tháng làm khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ Sinh học Vi sinh – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, quan tâm dìu dắt tận tình Thầy Cô giáo, cán bộ, anh chị phịng thí nghiệm khoa với cố gắng nỗ lực thân, tơi có hội củng cố rèn luyện kiến thức kỹ học tập để hồn thành tốt khóa luận Tơi xin bày tỏ kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thanh Huyền định hướng nghiên cứu, tận tình dạy, giúp đỡ, hỗ trợ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin cảm ơn đến thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, PGS.TS Nguyễn Văn Giang, cô Th.S Trần Thị Đào, cô Th.S Trần Thị Hồng Hạnh, nghiên cứu viên Dương Văn Hồn, Nguyễn Thị Thu giúp đỡ tơi thời gian thực khố luận Cuối tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, gia đình bạn bè thực khoá luận mơn Cơng nghệ vi sinh khuyến khích, động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Trần Thị Quỳnh Nga ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC ẢNH viii TÓM TẮT ix PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II: TỔ QU TÀ U 2.1 Lịch sử phát nghiên cứu 2.2 Đặc điểm hình thái, hóa sinh B.coagulans 2.3 Ứng dụng chế phẩm sinh học Bacillus coagulans 2.3.1 Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản 2.3.2 Trong lĩnh vực chăn nuôi 2.3.3 Trong lĩnh vực y học 2.3.4 Trong lĩnh vực thực phẩm 11 2.4 Giới thiệu số chế phẩm sinh học chứa B coagulans 12 PHẦN III V T LI U VÀ ƢƠ Á Ê ỨU 14 3.1 Vật liệu 14 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.3 Đối tượng nghiên cứu 14 3.4 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 14 iii 3.5 Mơi trường hóa chất 14 3.6 Phương pháp nghiên cứu 15 3.6.1 Phân lập vi khuẩn B.coagulans từ chế phẩm men tiêu hóa “ Yobitic sachet” 15 3.6.2 Phương pháp nhuộm Gram 17 3.6.3 Đặc điểm sinh hóa 17 3.6.4 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn phương pháp xác định định trình tự nucleotide 16S rRNA 21 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ T ẢO LU N 23 4.1 Kết phân lập Bacillus coagulans từ chế phẩm “ Yobitic sachet” 23 4.2 Xác định vi khuẩn B coagulans phân lập dựa vào đặc điểm hình thái 23 4.2.1 Hình thái tế bào 24 4.3 Xác định vi khuẩn B coagulans phân lập dựa vào đặc điểm sinh hóa 25 4.3.1 Phản ứng MR (Methyl Red) 25 4.3.2.Phản ứng VP (Voges-Proskauer) 26 4.3.3 Phản ứng catalase 26 4.3.4.Thử khả di động 27 4.3.5 Khả biến dưỡng citrate 28 4.3.6.Khả khử nitrate 29 4.3.7 Thử nghiệm lên men sucrose 30 4.3.8 Thử khả sinh gelatinase 31 4.3.9 Khả sản sinh lecithinase 31 4.3.10 Khảo sát khả chịu acid dày 32 4.3.11 Khảo sát khả chịu muối mật (Gilliand Walker, 1990) 33 4.3.12 Khảo sát khả bám dính ruột ( Trần Quốc Việt & cs 2009) 35 4.4 Phương pháp đếm khuẩn lạc tính tốn kết mật độ tế bào B coagulans 36 4.5 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 4.5.1 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 39 iv PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ ẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀ U THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 47 v DANH MỤC VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải n hĩa µg Microgam µl Microliter ml Milliter nm Nanometer MR Methyl red VP Voges proskauer MRS De Man, Rogosa and Sharpe ĐC Đối chứng FAO Food and Agricultrure Organization of the United Nation WHO World Health Organization Cs Cộng PCR Polymerase chain reaction DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid SCFAs Short-chan fatty acids B coagulans Bacillus coagulans vi DANH MỤC BẢNG Bảng Kết đo OD620nm vi khuẩn B coagulans nồng độ muối mật 0,3% mốc thời gian khác 34 Bảng Mật độ khuẩn lạc B coagulans sau phân lập 37 Bảng Kết thử nghiệm sinh hóa chủng phân lập 40 vii DANH MỤC ẢNH Hình Tế bào vi khuẩn B coagulans kinh hiển vi điện tử Hình Chế phẩm sinh học “ Yobitic sachet” 14 Hình Pha lỗng mẫu rắn 16 Hình Chủng Bc phân lập 23 Hình Kết nhuộm gram tế bào vi khuẩn quan sát kính hiển vi độ phóng đại 1000X 24 Hình Thử nghiệm phản ứng MR với chủng vi khuẩn 25 Hình Thử nghiệm phản ứng MR với chủng vi khuẩn 26 Hình Khả sinh catalase vi khuẩn 27 Hình Khả di động chủng vi khuẩn 28 Hình 10 Khả biến dưỡng citrate chủng 29 Hình 11 Khả khử nitrate 30 Hình 12 Khả lên men đường sucrose 31 Hình 13 Khả sinh gelatinase 31 Hình 14 Kết khả sinh lecithinase 32 Hình 15 Khả chịu acid chủng vi khuẩn Bc 33 Hình 16 Kết trang pH nồng độ 33 Hình 17 Kết trang muối mật vi khuẩn sau nuôi cấy nồng độ 35 Hình 18 Kết cấy trang dịch thu sau rửa ruột gà 36 Hình 19 Đặc tính sinh hóa chủng Bacillus coagulans báo nghiên cứu 41 viii Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2 ình 17 Kết trang muối mật vi khuẩn sau nuôi cấy nồn độ Từ kết cho thấy sau bổ sung thêm muối mật vào dịch nuôi cấy, sau vi khuẩn phát triển , điều chứng tỏ B coagulans có khả chịu muối mật 4.3.12 Khảo sát khả năn bám dính ruột ( Trần Quốc Việt & cs 2009) Vi khuẩn B coagulans nuôi môi trường MRS lỏng 30°C, tốc độ lắc 170 – 180 vòng/phút 24h Chuẩn bị mẫu ruột gà tươi: Rửa đoạn ruột non lần với đệm PBS cho tất vi sinh vật khơng cịn bề mặt niêm mạc ruột Rửa lần với mơi trường MRS lỏng Tiến hành thử bám dính: Phủ dịch tế bào chuẩn bị lên bề mặt niêm mặc ruột Ủ 90 phút tủ ấm 37°C Rửa ruột lần nước muối sinh lý 1% Rửa mẫu ruột lần đêm PBS để loại tế bào khơng bám dính Thu lấy dịch rửa lần trộn Đếm số lượng vi sinh vật dịch rửa để xác định khả bám dính B coagulans Kết thử nghiệm độ bám dính B coagulans thể hình 18 35 RG 10-5 RG 10-5 RG 10-6 RG 10-6 ình 18 Kết cấy trang dịch thu đƣợc sau rửa ruột Nhìn vào hình 18 ta đếm số lượng B coagulans bám dính ruột nổng độ 10-5 là: 87, 38 số lượng B coagulans bám dính ruột nồng độ 10-6 là: 14,17 4.4 hƣơn pháp đếm khuẩn lạc tính toán kết mật độ tế bào B coagulans Đếm khuẩn lạc tính tốn kết - Đếm khuẩn lạc tính tốn kết thực theo hướng dẫn TCVN 8736:2011 - Sau thời gian nuôi cấy, đếm khuẩn lạc đĩa hai độ pha loãng liên tiếp, bao gồm khuẩn lạc vi khuẩn B coagulans điển hình giả định nghi ngờ, gọi chung khuẩn lạc giả định - Số lượng N vi khuẩn B coagulans giả định có mẫu thử tính theo cơng thức: - Trong đó: + C tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại từ hai độ pha loãng liên tiếp + V thể tích mẫu thử ni cấy đĩa, đơn vị tính ml 36 + n1 số đĩa có độ pha loãng thứ giữ lại + n2 số đĩa có độ pha lỗng thứ hai giữ lại + d độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha lỗng Chú thích: - Khuẩn lạc B coagulans điển hình mơi trường MRS khuẩn lạc có dạng hình trịn dẹt, màu trắng sữa, kích thước khuẩn lạc mm – mm - Làm trịn kết tính đến số nguyên gần - Kết số lượng N vi khuẩn B coagulans giả định ml (mẫu thử dạng lỏng) gam (mẫu thử dạng rắn) Bảng Mật độ khuẩn lạc B coa ulans sau phân lập ơn thức thí nghiệm Đĩa Đĩa Thể tích m u ni cấy vào đĩa (ml) 10-5 137 25 0,01 10-6 146 31 0,01 N(CFU/g) 1,5x 109 Kết bảng cho thấy mật độ khuẩn lạc trung bình chế phẩm sinh học “Yobitic sachet” khoảng 1,5x 109 Mật độ khuẩn lạc chế phẩm 1x109 Kết nghiên cứu cho thấy, tổng số vi khuẩn B.coagulans sau phân lập phù hợp với thông tin nhà sản xuất Dưới số hình ảnh mà tiến hành cấy trang nồng độ để xác định mật độ B coagulans sau phân lập 37 Độ pha Số lƣờng khuẩn lạc ình ảnh loãn 10-4 >400 10-5 137 10-6 31 38 4.5 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 4.5.1 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR DNA hai chủng vi khuẩn sau tách chiết xong sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự gen 16S rRNA cặp mồi 27F 1492R ĐC- Market Bc 1500 bp Nhìn chung mẫu PCR với cặp mồi tổng 27F 1492R cho kết tốt, mẫu có band vạch với kích thước khoảng 1500 bp Điều cho thấy sản phẩm PCR đạt tiêu chuẩn sử dụng để giải trình tự 16S rRNA Trình tự so sánh với so sánh với trình tự nucleotide đoạn 16S rRNA chủng vi khuẩn khác đăng ký ngân hàng gen công cụ BLAST (Basic Local Alighment Search Tool) GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) … Và kết cho thấy rằng, chủng vi khuẩn B coagulans thuộc chi Bacillus Như vậy, dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc B coagulans ta khẳng định chủng vi khuẩn B coagulans Bacillus Coagulans 39 Bảng Kết thử nghiệm sinh hóa đƣợc phân lập Chủng B coagulans Phản ứng Kết nhuộm Gram + Khả di động - Phản ứng MR ( Metyl red) + Phản ứng VP( Voges – Proskauer) + Khả biến dưỡng citrate - Khả khử nitrate - Thử nghiệm catalase + Thử khả tan chảy gelatin + Sản xuất lecithinase - Chú thích: (+)Dương tính, (-) Âm tính Dưới bảng kết thử nghiệm sinh hóa tác giả Emad Abd El‐moniem Abada (2008) báo “Phân lập xác định đặc tính hợp chất kháng vi sinh vật từ bacillus coagulans” 40 ình 19 Đặc tính sinh hóa chủng Bacillus coagulans tron báo n hiên cứu 41 - Kết luận: Đặc tính hóa sinh B coagulans mà chúng tơi phân lập có kết tương đồng cao với đặc tính hóa sinh Bacillus coagulans báo nghiên cứu tác giả Emad Abd El‐moniem Abada (2008) Nên khẳng định chủng vi khuẩn mà chúng tơi phân lập Bacillus coagulans 42 PHẦN V: KẾT LU N VÀ ẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Chúng đề xuất sử dụng phương pháp xác định vi khuẩn B coagulans từ men tiêu hóa “ Yobitic sachet” sau: Hòa tan mẫu theo tỷ lệ 1: (w/v), lắc máy lắc 30 phút, để lắng ta nồng độ pha loãng 100 , sau ni cấy 100µl độ pha lỗng 10-4 mơi trường MRS Sau đó, lựa chọn khuẩn lạc giống B coagulans để đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa chúng - Khuẩn lạc B coagulans phân lập thể đặc điểm đặc trưng vi khuẩn B coagulans khuẩn lạc trắng đục, trịn lồi, Gram dương, catalase dương tính, có khả di động, làm tan chảy gelatinase, thí nghiệm sinh hóa - Kết giải trình tự cho thấy chủng B coagulans có quan hệ họ hàng gần gũi với chủng Bacillus coagulans Vì chủng B coagulans đặt tên Bacillus coagulans 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu thêm điều kiện môi trường để chủng vi khuẩn đạt tỉ lệ sống sót cao chế phẩm Ứng dụng khả hình thành bào tử khả sản sinh acid lactic B coagulans có tác dụng làm giảm độ pH, đưa mơi trường trạng thái acid nhẹ Đây điều kiện môi trường tốt cho lợi khuẩn đường ruột phát triển ngăn ngừa phát triển vi khuẩn có hại Từ ứng dụng nên nghiên cứu sản xuất thêm chế phẩm men tiêu hóa, men vi sinh chứa Bacillus cagulans Việt Nam 43 TÀ U THAM KHẢO Yobitic sachet – Men tiêu hóa bổ sung lợi khuẩn hiệu Võ Thị Thứ (1996) Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn Bacillus Cathy Wong (July 21, 2022) What Is Bacillus Coagulans? Gözde Konuray and Zerrin Erginkaya (2018) Potential Use of Bacillus coagulans in the Food Industry Anil Kumar Gupta and Chiranjit Maity (2021 Jan 22) Efficacy and safety of Bacillus coagulans LBSC in irritable bowel syndrome Bing Zhang, Haoran Zhang, Yang Yu, Ruiqiang Zhang, Yanping Wu, Min Yue, Caimei Yang Effects of Bacillus Coagulans on growth performance, antioxidant capacity, immunity function, and gut health in broilers Elisa Salvetti, Luigi Orrù, Vittorio Capozzi, Alessia Martina, Antonella Lamontanara, David Keller, Howard Cash, Giovanna E.Felis, Luigi Cattivelli, Sandra Torriani & Giuseppe Spano Integrate genome-based assessment of safety for probiotic strains: Bacillus coagulans GBI-30, 6086 as a case study Muhammed Majeed, Shaheen Majeed, Kalyanam Nagabhushanam, Sivakumar Arumugam , Kirankumar Beede, Furqan Ali a Evaluation of probiotic Bacillus coagulans MTCC 5856 viability after tea and coffee brewing and its growth in GIT hostile environment Author links open overlay pane Carine N Almada-Érix, Caroline N Almada ,Geany T Souza Pedrosa, Pablo C Lollo, Marciane Magnani, Anderson S Sant'Ana Development of a semidynamic in vitro model and its testing using probiotic Bacillus coagulans GBI30, 6086 in orange juice and yogurt 10 M Ratna, N Jayanthi, M.Aasin, RD Dhanashri Efficacy of Bacillus coagulans Unique IS2 in treatment of irritable bowel syndrome in children: a double blind, randomised placebo controlled study 44 11 Jiang Caoa, Zhiming Yu, Wenyin Liua, Jianxin Zhao, Hao Zhang, QixiaoZhaia,Wei Chena Probiotic characteristics of Bacillus coagulans and associated implications for human health and diseases 12 E De Vecchi, and L Drago Lactobacillus Sporogenes or Bacillus Coagulans: Misidentification or mislabelling Sporogenes 13 Keller, D., Farmer, S., McCartney, A Gibson, G.(2010) Bacillus coagulans as a probiotic 14 Sanzyme Biologics (Oct 29, 2021) Bacillus Coagulans 15 Mun Su Rhee, Brélan E Moritz, Gary Xie, T Glavina del Rio, E Dalin, H Tic, D Bruce, L Goodwin, O Chertkov, T Brettin, C Han, C Detter, S Pitluck, Miriam L., Milivà Patel, Mark Ou, Roberta Harbrucker Complete Genome Sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium, Bacillus coagulans strain 36D1 16 Emad Abd El‐moniem Abada (2008) Isolation and Characterization of a Antimicrobial Compound from Bacillus coagulans 17 S Riazi, R.E Wirawan, V Badmaev, M.L Chikindas Characterization of lactosporin, a novel antimicrobial protein produced by Bacillus coagulans ATCC 7050 18 A Maathuis , D Keller, S Farmer Survival and metabolic activity of the GanedenBC30 strain of Bacillus coagulans in a dynamic in vitro model of the stomach and small intestine Pages: 31 – 36 19 Chiranjit Maity, PhDORCID Icon, Anil Kumar Gupta, PhD, Dina B Saroj , PhD, Atul Biyani, MSc, Pratik Bagkar, MSc, Jayshree Kulkarni, PhD &Yogini Dixit Impact of a Gastrointestinal Stable Probiotic Supplement Bacillus coagulans LBSC on Human Gut Microbiome Modulation Pages 577-596 20 Chen-Wang Chang, Ming-Jen Chen, Shou-Chuan Shih, Ching-Wei Chang, PhD, Jen-Shiu Chiang Chiau, PhD, Hung-Chang Lee, MD,Yang-Sheng Lin, MD, Wei-Chen Lin, MD, and Horng-Yuan Wang, MD Bacillus coagulans (PROBACI) in treating constipation-dominant functional bowel disorders 45 21 X Zhou, Y Wang, Q Gu, W Li Effect of dietary probiotic, Bacillus coagulans, on growth performance, chemical composition, and meat quality of Guangxi Yellow chicken 22 Alfredo Palop, Javier Raso, Rafael Pagán, Santiago Condon, Francisco J Sala Influence of pH on heat resistance of spores of Bacillus coagulans in buffer and homogenized foods 23 Yanbo Wang, Linglin Fu, Junda Lin (1 August 2012) Probiotic (Bacillus coagulans) Cells in the Diet Benefit the White Shrimp Litopenaeus vannamei 24 Runqi Fu, Daiwen Chen, Gang Tian, Ping Zheng, Xiangbing Mao, Jie Yu, Jun He, Zhiqing Huang, Yuheng Luo, Bing Yu (December 2019, Pages 366-372) Effect of dietary supplementation of Bacillus coagulans or yeast hydrolysates on growth performance, antioxidant activity, cytokines and intestinal microflora of growing-finishing pigs 25 Research, Society and Development Probiotic and paraprobiotic potential of Bacillus coagulans: Impact of processing and storage on viability and resistance in the gastrointestinal tract 26 W B Sarles and B W Hamer(1931) Observations on bacillus coagulans 27 Ralf Jäger, Kevin A Shields, Ryan P Lowery, Eduardo O De Souza, Jeremy M Partl, Chase Hollmer, Martin Purpura1, Jacob M Wilson Probiotic Bacillus coagulans GBI-30, 6086 reduces exercise-induced muscle damage and increases recovery 28 Fei Su & Ping Xu (Published: 29 January 2014) enomic analysis of thermophilic Bacillus coagulans strains: efficient producers for platform biochemicals 46 PHỤ LỤC Phụ lục Khảo sát khả năn chịu acid dày chủng vi khuẩn Bc Thời gian 0h 3h 6h 9h pH 2,5 0,229±0,042 0,252 ±0,017 0,315±0,026 0,367±0,016 pH 3,5 0,241 ±0,026 0,332±0,053 0,395±0,029 0,435±0,018 pH 4,5 0,304 ±0,022 0,411±0,024 0,445±0,034 0,803±0,019 pH 5,5 0,316 ±0,039 0,684±0,03 0,714±0,08 1,118±0,159 Phụ lục Tên chế phẩm làm tron trình phân lập Bacillus coagulans  Men tiêu hóa Lactoenzyme (-)  Men tiêu hóa Yobitic sachet (+)  Men tiêu hóa KOIKA – BAC M (-)  Chế phẩm sinh học làm nước BIOnAQUA-Mv (-)  Men sống Bạch Mai (-) Chú thích: Trong thành phần chế phẩm sinh học chứa B coagulans Tuy nhiên phân lập B coagulans từ chế phẩm Men tiêu hóa “Yobitic sachet” Phụ lục Kết search Blast trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Bc enBank 47 48 Phụ lục 4: Kết giải trình tự đoạn gen 16S rRNA GCTTTCTGTCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAGGGTACCCCACCGA CTTCCGGTGGTACCAACTCTCCTGGTGTGACCGGCGGGGTGTACCA GGGCCGGGAACCTATTCACCGCGGCATGCTGATCCCCCATTACTAA CCATTCCAGCTTCCTGTAAGGCAATTGCAACCTACAATCCGAACTG AAAACGGGTTTATGAAAATAACTCCCCCTCCCGGTCTTGCAGCTCT TTGTACCGTCCATTGGAACACGTGTGTAACCCAAGGCATAAGGGG CATGATGATTTGACCTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGGCACCGG CAGTCACCTTAAAATGCCCAACTGAATGATGGCAACTAAAAACAA GGGTTGCCCTCCTTGCGGGAATTAACCCAACATCTCACCACACCAA CTGAACAACACCATGCACCACCTGGCACTCTGCTCCCCAAAGAAA AACCCTATCTCTAAGGTTGTCAAAAGAAGTCCAGAACTGGTAAGG GTCTTCCCCTTGCTTCCAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGGGC CGGCCCCCCTCAATTCCTTTGAATTTCAACCTTGCCGCCGTACTCCC CAAGGGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCCTTAAGGGCGGAAA CCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACCGCGTGGACTACCAAGG TATCTAATCCTGGTTGCTTCCCACGCTTTCGCGCCTCAATGTCAGTT ACAGAACAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGGTCCTCCATATCTCT ACGCATTTCACCGCCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCCTTCTTGC ACTCAAGTCTCCCAGTTCCATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGC TTTCACCATCAGACTTAAGAAACACCTGCGCGCCGCTTACGCCATA TTCGGATACGCTTGCACCTACGTATTACGCGCTGCTGGCACGTAGT TAGCGTGCCTTCTGGTTAGGTACCGTCCAGTGCAGCTATCACTAGC ACTGTTCTCCTTACACGAGTTACGACGAAGGCTCATCACTCAGCGC CTGCTCGTCGACTTCTCATGCGAGATCTATCGCTGCCTCGTAGATT AGACGTTCAGTCCAGGTGCGATCCTCAGTCGTACGACTGTGCTTTG ACGTCGGCAATGCATGCACGTCATCGTAAGTACGCGAACGACT 49