Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh tiêu hóa bac+

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ CHẾ PHẨM “VI SINH TIÊU HÓA BAC+” Hà Nội – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS COAGULANS TỪ CHẾ PHẨM “VI SINH TIÊU HÓA BAC+” Người thực : NGUYỄN THỊ MAI Lớp : K64CNSHB Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn : ThS NGUYỄN THANH HUYỀN Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thực thời gian từ 07/2022 – 2/2023 hướng dẫn ThS Nguyễn Thanh Huyền – giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu ngồi nước Các tài liệu trích dẫn nêu mục tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Mai iii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khố luận tốt nghiệp mơn Cơng nghệ vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, quan tâm giúp đỡ, hỗ trợ dìu dắt tận tình Thầy Cơ giáo, anh chị phịng thí nghiệm khoa nhóm sinh viên nghiên cứu với cố gắng nỗ lực thân, tơi có hội củng cố rèn luyện kiến thức kỹ học tập để hồn thành tốt khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy, cô giáo ThS Nguyễn Thanh Huyền định hướng nghiên cứu, tận tình dạy, giúp đỡ, hỗ trợ tơi suốt q trình thực khóa luận kiên nhẫn kiến thức Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, đặc biệt Bộ môn Công nghệ vi sinh Thầy/cô cung cấp kiến thức khoa học kỹ thuật hữu ích cho tơi Đây điều quan trọng giúp thực thành cơng khóa luận Tơi muốn cảm ơn người bạn đồng hành phịng thí nghiệm tơi hỗ trợ đáng kể người Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình bạn bè ln động viên, cổ vũ tinh thần giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên thực hiện, Nguyễn Thị Mai iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x TÓM TẮT xi PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus 2.2 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus coagulans 2.2.2 Đặc điểm hình thái 2.2.3 Đặc điểm hóa sinh 2.2.4 Ứng dụng Bacillus coagulans PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 14 3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 14 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 14 3.1.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 14 3.1.4 Mơi trường hóa chất 15 v 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Phân lập Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+” 16 3.2.2 Phương pháp giữ giống 16 3.2.3 Phương pháp nhuộm Gram 17 3.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa vi khuẩn B coagulans 17 3.2.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào B coagulans có chế phẩm 22 3.2.6 Định danh chủng vi khuẩn 23 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+” 25 4.2 Đặc điểm sinh học 26 4.2.1 Khả di động 26 4.2.2 Phản ứng MR (Methyl Red) 26 4.2.3 Phản ứng VP (Voges-Proskauer) 27 4.2.4 Khả biến dưỡng citrate 27 4.2.5 Khả khử nitrate 28 4.2.6 Khả lên men sucrose 29 4.2.7 Phản ứng catalase 29 4.2.8 Khả chịu acid dày 30 4.2.9 Khả chịu muối mật 31 4.2.10 Khả sản sinh lecithinase 31 4.2.11 Khả sinh gelatinase 32 4.2.12 Khả bám dính 33 4.3 Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus coagulans có chế phẩm 35 4.4 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 4.4.1 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 35 vi PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 43 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần khuếch đại DNA 24 Bảng 3.2 Chu kì nhiệt thực phản ứng PCR 24 Bảng 4.1 Đặc điểm hóa sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn 34 Bảng 4.2 Mật độ khuẩn lạc B coagulans sau phân lập 35 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bacillus coagulans chủng 36D1 Hình 3.1 Chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+” 14 Hình 4.1 Hình ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 25 Hình 4.2 Hình thái tế bào vi khuẩn kính hiển vi 25 Hình 4.3 Khả di động B1 26 Hình 4.4 Phản ứng MR 26 Hình 4.5 Phản ứng VP 27 Hình 4.6 Khả thử citrate 28 Hình 4.7 Khả khử nitrate 28 Hình 4.8 Khả lên men sucrose 29 Hình 4.9 Khả sinh catalase 29 Hình 4.10 Khả chịu acid chủng vi khuẩn B1 30 Hình 4.11 Kết phân lập khả chịu muối mật 31 Hình 4.12 Kết phản ứng lecithinase 32 Hình 4.13 Khả sinh gelatinse chủng B1 32 Hình 4.14 Kết phân lập khả bám dính B1 nồng độ 10-4 33 Hình 4.15 Hình ảnh phân lập vi khuẩn B coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+” 35 Hình 4.16 Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn 36 Hình 4.17 Kết search Blast trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn B1 GenBank 36 ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải nghĩa µg Microgram µl Microliter ml Milliter nm Nanometer MR Methyl Red VP Voges proskauer MRS De Man, Rogosa and Sharpe ĐC Đối chứng FAO Food and Agricultrure Organization of the United Nation WHO World Health Organization Cs Cộng PCR Polymerase chain reaction DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid SCFAs Short-chan fatty acids x 4.2.8 Khả chịu acid dày Dịch vị dày coi thách thức mà chủng vi khuẩn probiotic phải đối mặt pH thấp tác dụng kháng khuẩn pepsin (Charteris & cs., 1998; Rupa & Mine, 2012) Do đó, khả chịu acid tiêu chí quan trọng dòng probiotic tiềm Chủng vi khuẩn probiotics tồn dày với pH 2,5 đến 3,5 – trước chuyển đến đường ruột Chủng vi khuẩn nuôi môi trường MRS lỏng 24 30˚C hút 1000 µl cho vào mơi trường MRS lỏng có pH từ - Và theo dõi kết sau giờ, giờ, sau giờ, Hình 4.10 Khả chịu acid chủng vi khuẩn B1 Kết thí nghiệm cho thấy giá trị vi khuẩn B1 tăng môi trường tăng lên pH tăng (2 – 5) – nghiên cứu Ở pH5 chủng B1 phát triển nhanh Bên cạnh mật độ vi khuẩn xác định nằm khoảng 3x107 – 3,8x108 Cfu/ml, điều chứng tỏ chủng vi khuẩn tồn môi trường MRS thể khả chịu tồn dày 30 Từ kết cho thấy chủng B1 có khả chịu acid dày cao cho thấy khả sống sót dạy tốt qua 4.2.9 Khả chịu muối mật Để phát huy tác dụng có lợi đường tiêu hóa, vi khuẩn probiotic phải có khă qua dày dung nạp nồng độ muối mật ruột non (Sanders, 2000) Muối mật đóng vai trị thiết yếu việc tạo nhũ tương lipid chứng minh có hoạt động kháng khuẩn Chủng vi khuẩn cấy vào mơi trường MRS lỏng có bổ sung 0,3% muối mật (bile salt) Kết thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn sau h ΔOD đo bước sóng 620 nm = 0,313, điều chứng tỏ vi khuẩn B1 có khả chịu mi mật Bên cạnh mật độ vi khuẩn xác định 4x105 Cfu/ml chứng tỏ chủng vi khuẩn tồn môi trường MRS thể khả chịu muối mật Hình 4.11 Kết phân lập khả chịu muối mật 4.2.10 Khả sản sinh lecithinase Thử nghiệm khả sinh sản lecithinase mơi trường ni cấy MYP có chưa lịng đỏ trứng gà hai chất thị gồm mammitol phenol red 31 Hình 4.12 Kết phản ứng lecithinase Vi khuẩn có khả sản xuất lecithinase phân cắt lecithin có lịng đỏ trứng, hình thành vùng khuếch tán có khuẩn lạc màu hồng đồng thời có vịng lecithinase bao quanh khuẩn lạc Trong đó, vi khuẩn lên men mannitol để tạo acid biến đổi môi trường thành màu vàng Như vậy, dựa kết ghi nhận hình 4.12 cho thấy, chủng vi khuẩn sử dụng mantiol nên mơi trường xung quanh khuẩn lạc có màu vàng 4.2.11 Khả sinh gelatinase Gelatinase enzyme thủy phân protein, thành đoạn peptid acid amin Việc đánh giá tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh gelatinase để ứng dụng ngành công nghệ thực phẩm có ý nghĩa quan trọng Hình 4.13 Khả sinh gelatinse chủng B1 32 Chủng vi khuẩn B1 cấy vào môi trường thử khả sinh gelatinase, sau ủ 37°C Sau 48 nuôi cấy, chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 4°C ống đối chứng đông lại Và quan sát, mơi trường ni cấy khơng có thay đổi so với mơi trường đối chứng (hình 4.13) Do đó, khẳng định chủng vi khuẩn B1 khơng có khả phân hủy gelatin 4.2.12 Khả bám dính Các chủng vi khuẩn có khả bám dính thường tồn lâu niêm mạc ruột, cạnh tranh dinh dưỡng, tiết số chất nhằm ức chế phát triển vi khuẩn khác, đặc biệt tác nhân gây bệnh Do vậy, khả bám dính nơi có tốc độ lưu hỗn hợp dịch thức ăn cao biểu mơ ruột non tiêu chí quan trọng việc tuyển chọn chủng vi khuẩn probiotic (Arthur & cs., 2003) Hình 4.14 Kết phân lập khả bám dính B1 nồng độ 10-4 Sau dùng đệm PBS rửa mẫu lần thu lấy dịch rửa lần trộn Kết thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn B1, mật độ vi khuẩn xác định 29,3 x 105 Cfu/ml chứng tỏ chủng vi khuẩn tồn mơi trường MRS thể khả bán dính 33 Bảng 4.1 Đặc điểm hóa sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn Đặc tính sinh học B1 Kết nhuộm gram + Khả di động + Phản ứng VP + Phản ứng MR + Khả biến dưỡng citrate - Khả khử nitrate - Khả sinh catalase + Khả sản sinh lecithinase - Khả sinh gelatinase - Khả lên men sucrose - Chú thích: (+) Dương tính, (-) Âm tính Như vậy, dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm hóa sinh chủng vi khuẩn B1 (Bảng 4.1), tạm khẳng định chủng vi khuẩn B1 chủng B coagulans Trong nghiên cứu trước đây, năm 2008, Abada cs., phân lập vi khuẩn Bacillus coagulans từ nguồn nước thải công nghiệp kết luận chủng B coagulans đặc điểm Gram dương, có khả di động, phản ứng âm tính với nitrate, citrate ; phản ứng dương tính với MR, VP, phản ứng catalase Tương tự vậy, năm 1992, Hilton & cs., tiến hành khảo sát khả chịu acid dày vi khuẩn B cogulans kết cho thấy chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng pH 2.5 Năm 2000, Hyronimus cs., khảo sát khả chịu muối mật vi khuẩn B coagulans phân lập từ phân gia súc Vi khuẩn nuôi môi trường MRS bổ sung 0,3% muối mật theo dõi hàng cách đo OD 34 bước sóng 600 nm Và kết cho thấy vi khuẩn B coagulans tồn mơi trường bổ sung muối mật khoảng với tỉ lệ sống sót 22,4 % 4.3 Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus coagulans có chế phẩm Chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+” pha nồng độ pha lỗng 10-5 10-6, sau cấy mơi trường MRS có bổ sung 0,5% CaCO3 nhằm xác định mật độ vi khuẩn có chế phẩm Sau 12 nuôi cấy, xác định mật độ vi khuẩn nghi ngờ B coagulans 1,6x108 CFU/ml Kết nghiên cứu cho thấy, mật độ vi khuẩn nghi ngờ vi khuẩn B.coagulans phân lập từ chế phẩm phù hợp với thông tin nhà sản xuất đưa Bảng 4.1 Mật độ khuẩn lạc B coagulans sau phân lập Cơng thức thí Thể tích mẫu ni Đĩa Đĩa 10-5 153 167 0,1 10-6 27 22 0,1 nghiệm Nồng độ pha loãng 10-5 cấy vào đĩa (ml) N(CFU/ml) 1,6x 108 Nồng độ pha loãng 10-6 Hình 4.15 Hình ảnh phân lập vi khuẩn B coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+” 4.4 Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 4.4.1 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR ADN chủng vi khuẩn tuyển chọn sau tách chiết thành công sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự gen 16S rRNA cặp mồi 27F 1492R 35 Hình 4.16 Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Hình ảnh điện di cho thấy mẫu PCR với cặp mồi 27F 1492R cho kết tốt Kết cho thấy độ dài trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn khoảng 1500bp với nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu DNA từ chủng 48°C (M Ratna Sudha & cs., 2010) 16S rRNA vùng mã hóa RNA ribosome xác định đoạn gen bảo tồn tất tế bào Đây vùng linh hoạt, thay đổi trình tự nucleotide vùng ứng dụng nhiều khảo sát di truyền dòng vi khuẩn Hình 4.17 Kết search Blast trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn B1 GenBank 36 Sau giải trình tự 16S rRNA chủng vi khuẩn B1 Trình tự so sánh với trình tự nucleotide đoạn 16S rRNA chủng vi khuẩn khác đăng ký ngân hàng gen công cụ BLAST (Basic Local Alighment Search Tool) GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information)… Và kết cho thấy, mức độ tương đồng 16S rRNA chủng vi khuẩn B1 với chủng vi khuẩn Weizmannia coagulans strain CAU7838 92.40% Do phương pháp sinh học phân tử, kết luận chủng vi khuẩn B1 Bacillus coagulans 37 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Chủng vi khuẩn B1 phân lập thể đặc điểm đặc trưng vi khuẩn B coagulans có khả phân giải CaCO3, khuẩn lạc màu trắng tròn, Gram dương - Vi khuẩn B1 có khả di động phản ứng dương tính MR, VP, catalase, ngồi chúng khơng có khả khử nitrate, phản ứng âm tính với biến dưỡng citrate - Chủng vi khuẩn B1 có khả chịu acid dày với pH 2,53,5 2- giờ, sống muối mật 0.3% có khả bám dính - Kết giải trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn B1cho thấy, B1 thuộc vi khuẩn Bacillus coagulans 5.2 Kiến nghị - Các phương pháp xác định vi khuẩn B coagulans thí nghiệm hóa sinh cần nghiên cứu thêm - Tìm mồi đặc hiệu để khẳng định chắn chủng vi khuẩn B1 mang gen đặc hiệu cho vi khuẩn B coagulans - Cần đóng góp phát triển phương pháp phát định lượng B coagulans men tiêu hóa, chế phẩm sinh học khác 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lương Đức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Lương Đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Trần Quốc Việt, Bùi Thu Huyền, Dương Văn Hợp Vũ Thành Lâm, 2009 Phân lập, tuyển chọn đánh giá đặc tính probiotic số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi Tạp chí Khoa học cơng nghệ chăn ni, 16 : 521- 537 Tài liệu tiếng anh Abada E A E M (2008) Isolation and characterization of a antimicrobial compound from Bacillus coagulans Animal cells and systems, 12(1), 41-46 Aldridge C., Jones P., Gibson S., Lanham J., Meyer M., Vannest R & Charles R (1977) Automated microbiological detection/identification system Journal of Clinical Microbiology 6(4): 406-413 Allen S J., Martinez E G., Gregorio G V., & Dans L F (2010) Probiotics for treating acute infectious diarrhoea Cochrane Database of Systematic Reviews, (11) Alibek K 1999 with Stephen Handelman Biohazard New York: Random House Arunachalam K., Gill H S., & Chandra R K (2000) Enhancement of natural immune function by dietary consumption of Bifidobacterium lactis (HN019) European Journal of Clinical Nutrition, 54(3), 263-267 Bengmark, S (2000) Colonic food: pre-and probiotics The American journal of gastroenterology, 95(1), S5-S7 39 Elshaghabee F M., Rokana N., Gulhane R D., Sharma C., & Panwar H (2017) Bacillus as potential probiotics: status, concerns, and future perspectives Frontiers in microbiology, 1490 Fu R., Chen D., Tian G., Zheng P., Mao X., Yu J., & Yu B (2019) Effect of dietary supplementation of Bacillus coagulans or yeast hydrolysates on growth performance, antioxidant activity, cytokines and intestinal microflora of growing-finishing pigs Animal Nutrition, 5(4), 366-372 Gilliland S.E., Walker D.K (1990) Factors to consider when selecting a culture of L acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypercholesterolemic effect in humans Journal of Dairy Science, 73: 905909 10 Joint FAO/WHO Working Group, 2002 Guidelines for the evaluation of probiotics in food London: World Health Organization, Canada: Food and Agriculture Organization 11 Hong H A., Duc L H., & Cutting S M (2005) The use of bacterial spore formers as probiotics FEMS microbiology reviews, 29(4), 813-835 12 Hilton E., Isenberg H.D., Alperstein P., France K., Borenstein M.T (1992): Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus as prophylaxis for candidal vaginitis Ann Intern Med, 116: 353-357 13 Hyronimus B., Le Marrec C., Sassi A H., & Deschamps A (2000) Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria International journal of food microbiology, 61(2-3), 193-197 14 Jurenka J S (2012) Bacillus coagulans Alternative medicine review, 17(1), 76-82 15 Kimmel, M., Keller, D., Farmer, S., & Warrino, D E (2010) A controlled clinical trial to evaluate the effect of GanedenBC (30) on immunological markers Methods and findings in experimental and clinical pharmacology, 32(2), 129-132 40 16 Lacey L A., Frutos R., Kaya H & Vail P (2001) Insect pathogens as biological control agents: they have a future Biological control 21(3): 230-248 17 Liu Z., Jiang Z., Zhang Z., Liu, T., Fan Y., Liu T., & Peng N (2022) Bacillus coagulans in combination with chitooligosaccharides regulates gut microbiota and ameliorates the Dss-induced colitis in mice Microbiology Spectrum, 10(4), e00641-22 18 Logan N A & Vos P D (2015) Bacillus Bergey's manual of systematics of archaea and bacteria 1-163 19 Masoomi-Aladizgeh F., Jabbari L., Nekouei R K., & Aalami A (2016) A simple and rapid system for DNA and RNA isolation from diverse plants using handmade kit 20 Meurman J H (2005) Probiotics: they have a role in oral medicine and dentistry? European journal of oral sciences, 113(3), 188-196 21 Molecular Typing and Probiotic Attributes of a New Strain of Bacillus coagulans – Unique IS-2: a Potential Biotherapeutic Agent Genetic Engineering and Biotechnology Journal: GEBJ-7 22 Mun S R., Brélan E M., Gary X., Glavina del R T., Dalin E., Tice H., Bruce D., Goodwin L., Chertkov O , Brettin T., Han C., Detter C., Pitluck S., Miriam L L., Milind P., Mark O., Roberta H., Lonnie O I and Shanmugam K T (2011) Complete Genome Sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium, B.acillus coagulans strain 36D1 5:331340 23 Nyangale E P., Farmer S., Keller D., Chernoff D., & Gibson G R (2014) Effect of prebiotics on the fecal microbiota of elderly volunteers after dietary supplementation of Bacillus coagulans GBI-30, 6086 Anaerobe, 30, 75-81 41 24 Perdigon G., Alvarez S., Rachid M., Agüero G., & Gobbato, N (1995) Immune system stimulation by probiotics Journal of dairy science, 78(7), 1597-1606 25 Sanders M E (2000) Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health The Journal of nutrition 130(2): 384S-390S 26 Sarles W.B and Hammer B.W., 1932 Observations on Bacillus coagulans Journal of Bacteriology 23: 301-314 27 Sui L., Zhu X., Wu D., Ma T., Tuo Y., Jiang S & Mu G (2020) In vitro assessment of probiotic and functional properties of Bacillus coagulans T242 Food Bioscience, 36, 100675 28 Sun T., Miao H., Zhang C., Wang Y., Liu S., Jiao P., & Huang Z (2022) Effect of dietary Bacillus coagulans on the performance and intestinal microbiota of weaned piglets animal, 16(7), 100561 29 Vanderhoof J.A., Whitney D.B., Antonson D.L., Hanner T.L., Lupo J.V., Young R.J (1999): Lactobacillus GG in the prevention of antibioticassociated diarrhoea in children J Pediatr, 135: 564-568 30 Wu Y., Shao Y., Song B., Zhen W., Wang Z., Guo Y., & Nie W (2018) Effects of Bacillus coagulans supplementation on the growth performance and gut health of broiler chickens with Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis Journal of Animal Science and Biotechnology, 9(1), 1-14 42 PHỤ LỤC Phụ lục Khảo sát khả chịu acid dày chủng vi khuẩn B1 Thời gian pH2 pH3 pH4 pH5 0h 3h 6h 9h 0.264 ± 0.019 0.285 ± 0.013 0.309 ± 0.017 0.318 ± 0.012 0.273 ±0.014 0.316 ± 0.024 0.332 ± 0.014 0.376 ±0.028 0.315 ± 0.033 0.356 ± 0.022 0.442 ± 0.05 0.624 ±0.027 0.357 ± 0.043 0.442 ± 0.039 0.84 ± 0.022 1.256 ± 0.146 43 Phụ lục Khảo sát khả chịu acid dày chủng vi khuẩn B1 phương pháp cấy trang môi trường MRS Thời gian 3h 6h 9h pH pH pH pH 44