Phân lập và định danh vi khuẩn bacillus mycoides từ đất trồng cây lạc, đậu tương của một số tỉnh miền bắc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BACILLUS MYCOIDES TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY LẠC, ĐẬU TƯƠNG CỦA MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC Hà Nội, 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN BACILLUS MYCOIDES TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY LẠC, ĐẬU TƯƠNG CỦA MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC Sinh viên thực : Đào Văn Đỉnh Lớp : K63CNSHC Mã sinh viên : 637214 Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Trần Thị Bình Nguyên HÀ NỘI, 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, Các số liệu mà tơi thu thập q trình thực tập trực tiếp nghiên cứu, theo dõi ghi chép Các số liệu thu thập trung thực, khách quan chưa công bố báo cáo trước Các trích dẫn báo cáo có nguồn gốc cụ thể rõ ràng, xác Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên ĐÀO VĂN ĐỈNH i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp Bộ môn Công nghệ sinh học động vật, giúp đỡ dìu dắt tận tình thầy giáo, cán phịng thí nghiệm Bộ mơn với cố gắng nỗ lực học tập thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc Học viện, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học tồn thể thầy giáo truyền đạt cho kiến thức vô bổ ích quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Bình Ngun Giảng viên Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học người tận tình giúp đỡ, bảo hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, bạn sinh viên môn Công nghệ vi sinh, Công nghệ sinh học thực vật, môn Sinh học môn Sinh học phân tử giúp đỡ, cho sử dụng nhờ máy móc, hố chất dụng cụ thí nghiệm cần thiết kì khố luận tơi Cuối tơi xin cảm ơn anh chị cán phòng thí nghiệm Bộ mơn cơng nghệ sinh học Động vật tận tình giúp đỡ để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Một lần xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất! Hà Nội, ngày … tháng ……năm 2023 Sinh viên Đào Văn Đỉnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Nội dung nghiên cứu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn Bacillus 2.1.1 Đặc điểm hình thái Bacillus 2.1.2 Vai trò vi khuẩn Bacillus 2.2 Tổng quan vi khuẩn Bacillus mycoides 2.2.1 Đặc điểm hình thái phân loại 2.2.2 Đặc điểm sinh học điều kiện sinh trưởng vi khuẩn mycoides 2.2.3 Vai trò chủng Bacillus mycoides 11 2.3 Sử dụng 16S rRNA định danh vi khuẩn 15 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Vật liệu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1.3 Hóa chất thiết bị 21 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Địa điểm thực 22 iii 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu đất 23 3.3.2 Phương pháp làm 23 3.3.3 Phương pháp xác định hình thái vi khuẩn 24 3.3.4 Phương pháp nuôi giữ giống 24 3.3.5 Phương pháp nuôi lỏng 24 3.3.6 Phương pháp tách chiết DNA 25 3.3.7 Phương pháp chạy điện di 26 3.3.8 Kĩ thuật PCR 27 3.3.9 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 30 3.3.10 Phương pháp giải trình tự gen 30 3.3.11 Phương pháp xử lí số liệu 30 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu đất trồng họ đậu 31 4.2 Kết làm vi khuẩn 31 4.3 Kết định danh chủng vi khuẩn 35 4.3.1 Kết tách chiết dna tổng số đo quang phổ định lượng dna 36 4.3.2.Phản ứng pcr 38 4.3.3 Kết giải trình tự gen vùng 16s 38 4.3.4 Phân tích đa hình nucleotide vùng 16s chủng Bacillus mycoides (L3) với số chủng Bacillus khác có mã số genbank 41 4.3.5.Xây dựng phân tích di truyền phả hệ Bacillus mycoides nghiên cứu với Bacillus khác có mã số genbank 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Số lượng nguồn gốc mẫu 20 Bảng 3.2 Các thiết bị dụng cụ thí nghiệm 21 Bảng 3.3 Các hóa chất pha mơi trường LB 21 Bảng 3.4 Hóa chất dùng để tách chiết DNA 22 Bảng 3.5 Hóa chất sử dụng để chạy điện di DNA gel Agarose 22 Bảng 4.1 Kết đo quang phổ DNA tổng số 37 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Bacillus kính hiển vi quang học (x100) Hình 2.2 Sự phát triển B mycoides (A) môi trường lỏng LB & (B) đĩa thạch LB; hình thái tế bào quan sát kính hiển vi tương phản pha (C) .8 Hình 2.3 Phân tích phát sinh lồi dựa tồn trình tự gen chủng B mycoides phân lập đại diện khác nhóm B cereus: B cereus, B anthracis B thuringensis 10 Hình 2.4 Cấu trúc thứ cấp 16S rRNA 16 Hình 2.5 Cây phát sinh xây dựng dựa so sánh trình tự 16S 18 Hình 3.1 Chu trình phản ứng PCR .29 Hình 4.1 Hình ảnh đại diện khuẩn lạc sau nuôi cấy từ đất trồng lạc, đậu tương 10-5(A), 10-6(B) 31 Hình 4.2 Vi khuẩn có hình dạng đặc trưng Bacillus mycoides sau ni cấy .32 Hình 4.3 mycoides mơi trường thạch LB 20 32 Hình 4.4 Bacillus mycoides mơi trường thạch LB 16 33 Hình 4.5 Bacillus mycoides môi trường thạch LB 18 33 Hình 4.6 Bacillus mycoides mơi trường thạch LB 20h (A) 22h (B) 34 Hình 4.7 Bacillus mycoides mơi trường thạch LB 24 34 Hình 4.8 Chủng vi khuẩn (mẫu L3) nuôi lỏng sau 24 35 Hình 4.9 Dịch vi khuẩn (L3) sau nuôi cấy môi trường thạch LB (100µl dịch độ pha lỗng 10-6 16 giờ) 36 Hình 4.10 Kết điện di DNA tổng số đo OD từ dịch (L3) 37 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 27F/1492R 38 Hình 12 Kết giải trình tự gen .40 Hình 13 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotite chủng (L3) với chủng tương đồng Genbank .40 Hình 4.14 Kết đánh giá tương đồng chủng Bacillus mycoides (L3) với số chủng Bacillus khác có mã số Genbank .43 Hình 4.15 Cây phả hệ di truyền chủng vi khuẩn mycoides L3 số vi khuẩn chi Bacillus 44 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa từ A Adenine Nucleotide APX Ascorbate peroxidase B mycoides Bacillus mycoides bp Base pair - Cặp bazơ C Cytosine Nucleotide CDS Trình tự mã hóa giả định cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym B cereus Bacillus cereus F Forward primer – Môi xuôi B subtilis Bacillus subtilis G Guanine Nucleotide GPX Guaiacol peroxidase LB Luria Broth B.licheniformis Bacillus licheniformis MLEE Điện di enzyme đa điểm NAAT Kỹ thuật khuếch đại axit nucleic OD Optical density – Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase BBG Vác xin phòng bệnh lao sp species - loài spp species pluriel - nhiều loài vii EDTA axit aminopolycarboxylic CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide TAE Tris-acetate-EDTA Ta Annealing temperature - Nhiệt độ gắn mồi R Reverse primer – Mồi ngược RFLP Restristion Fragment Length Polymorphisms hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn rRNA Ribosomal ribonucleic acid UV Ultraviolet - Tia tử ngoại 16s rRNA 16S ribosomal RNA L3 Đa Chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lạc (Đình Bảng- Từ Sơn- Bắc Ninh) viii lơng màu kem mọc lan rộng bám gần kín mặt đĩa petri Các sợi lông xoắn theo chiều kim đồng hồ, chằng chịt đè lên liên kết mạng nhện Đây khoảng thời gian mà B mycoides phát triển mạnh mẽ Tiến hành thí nghiệm ni cấy chủng vi khuẩn mycoides điều kiện khác pH=5 pH=8 thấy B.mycoides khơng thể phát triển Vì điều kiện tối ưu để Bacillus mycoides phát triển nhiệt độ khoảng 30oC-35oC, pH=7 Kết từ 10 mẫu đất sau phân lập làm có chủng xuất hình dạng giống với mơ tả Bacillus mycoides (L1, L3, L4, L5, L6, L10), chúng tơi lấy ngẫu nhiên chủng chủng (L3) giải trình tự nucleotide gen 16S để định danh vi khuẩn B mycoides phương pháp phân tử 4.3 Kết định danh chủng vi khuẩn Thu dịch nuôi khuẩn lạc: Tiến hành nuôi chủng vi khuẩn làm môi trường LB lỏng với pH=7 điều kiện 30℃, lắc 200 vịng/phút 24 Hình 4.8 Chủng vi khuẩn (mẫu L3) nuôi lỏng sau 24 Bằng quan sát thấy chủng B Mycoides L3 ni mơi 35 trường hoạt hố lỏng, lắc 30oC 24h có phát triển rõ rệt, sinh trưởng phát triển tốt Ở đáy xuất bào tử vi khuẩn hình khối kích thước lớn có đường kính khoảng 2mm-4mm, màu trắng, có xúc tua xung quanh Kiểm tra độ khiết dịch nuôi khuẩn lạc: Sau chủng vi khuẩn nuôi lỏng đem nuôi cấy dịch môi trường thạch LB để đánh giá khách quan mật độ với độ khiết Hình 4.9 Dịch vi khuẩn (L3) sau nuôi cấy môi trường thạch LB (100µl dịch độ pha lỗng 10-6 16 giờ) Vi khuẩn nuôi cấy từ môi trường lỏng sang mơi trường thạch LB thấy lượng vi khuẩn môi trường nuôi lỏng tinh sạch, khơng có xuất vi khuẩn khác mật độ vi khuẩn dày đặc không đếm 4.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số đo quang phổ định lượng DNA Chủng vi khuẩn (L3) sau ni cấy mơi trường hoạt hố lỏng kiểm tra đem tách chiết ADN tổng số Kết đo OD xác định nồng độ ADN bước sóng 260nm 280nm cho kết tỷ số OD260/OD280 nằm khoảng 1,8-2,2 Về mặt lý thuyết, bước sóng 280nm bước sóng hấp thụ protein, tỷ số kết đo OD bước sóng 260/280 nằm khoảng 1,8-2 tinh sạch, nhỏ 1,8 ADN lẫn nhiều protein (Nguyễn Thị Phương 36 Trang & cs., 2013) Kết cho thấy ADN chủng vi khuẩn (L3) đảm bảo độ tinh tiến hành phản ứng phân tử Bảng 4.1 Kết đo quang phổ DNA tổng số Mẫu DNA OD260nm/280nm CM (ng/µl) Mau L3 1,92 215 Qua kết đo OD ADN tổng số chủng vi khuẩn (L3) cho thấy nồng độ cao, độ tinh 1,92 nằm khoảng 1,8-2 M: DNA ladder 100 bp (Thermo) L3: DNA tổng số mẫu L3 (Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng lạc Đình Bảng- Từ Sơn- Bắc Ninh) Hình 4.10 Kết điện di DNA tổng số đo OD từ dịch (L3) Bên cạnh kết (Hình 4.10) cho thấy DNA tổng số tách chiết từ dịch vi khuẩn mẫu (L3) hiển thị thành vệt sáng gel agarose 1% sau điện di Băng điện di gọn, đẹp có kích thước phân tử lớn Khơng có đứt gãy DNA Vì mẫu DNA tổng số đảm bảo chất lượng để phục vụ thí nghiệm 37 4.3.2 Phản ứng PCR DNA tổng số chủng vi khuẩn (L3) pha lỗng nồng độ 20 ng/µl, sau tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 27F 1492R nhiệt độ bắt mồi 53℃ nhằm khuếch đại vùng gen 16S Trình tự vùng 16S mơ hình phổ biến để nghiên cứu tiến hóa, phân loại xác định cho nhiều lồi vi khuẩn M: ADN ladder 100 bp (Thermo) L3: Sản phẩm PCR có kích thước 1500kp mẫu L3 (Bacillus mycoides phân lập từ đất trồng lạc Đình Bảng- Từ Sơn- Bắc Ninh) Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 27F/1492R Kết cho thấy sản phẩm PCR nằm khoảng 1500bp chủng vi khuẩn (L3) tương ứng với kích thước phân tử theo lý thuyết sản phẩm PCR vùng gen 16S cặp mồi 27F/1492R (Weisburg & cs., 1991) Nhận thấy băng vạch sáng đậm, rõ nét, đoạn gen khuếch đại thành công Tuy nhiên để xác định xác, sản phẩm PCR cần phải tinh đọc trình tự gen trực tiếp 4.3.3 Kết giải trình tự gen vùng 16S xử lý số liệu Trình tự nucleotide vùng 16S rRNA chủng Bacillus mycoides L3 (phân lập từ đất trồng lạc thu Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh) đưa giải trình tự, kết xử lý phần mềm BioEdit để xác định pick có rõ nét hay khơng (hình 4.12) 38 39 Hình 12 Kết giải trình tự gen Kết giải trình tự gen chủng Bacillus mycoides L3 đưa vào chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) NCBI (National Center for Biotechnology Information) để tìm trình tự có tương đồng nucleotide cao (hình 4.13) Hình 13 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotite chủng (L3) với chủng tương đồng Genbank 40 Kết từ chương trình BLAST cho thấy trình tự 16s rRNA số chủng Bacillus mycoides có genbank Bacillus mycoides Y-2 số tham chiếu KF483222.1; Bacillus mycoides EKE04 số tham chiếu MT994645.1; Bacillus mycoides Y7 số tham chiếu HM224388.1; Bacillus mycoides L2S8 số tham chiếu EU221418.1; Bacillus mycoides số tham chiếu L2S5 EU221416.1 có độ tương đồng cao so với trình tự gen (L3) tham chiếu Độ tương đồng trình tự gen L3 so với chủng vi khuẩn Bacillus mycoides tham chiếu lên tới 99,81% 4.3.4 Phân tích đa hình nucleotide vùng 16S chủng Bacillus mycoides (L3) với số chủng Bacillus khác có mã số genbank Sử dụng phần mềm bioedit để đánh giá mức độ tương đồng trình tự nucleotide vùng 16S chủng L3 so với số vi khuẩn khác Sự đa hình nucleotide vùng 16S Bacillus mycoides phân tích cụ thể theo (hình 4.13) Khi so sánh trình tự nucleotide gen 16S chủng L3 với chủng B Mycoides chủng vi khuẩn thuộc nhóm B cereus, số chủng Bacillus có GenBank, kết cho thấy có số vị trí đa hình thay đổi nucleotide, ví dụ vị trí 38 có nucleotide G thành A, vị trí 95 có thay nucleotide C thành nucleotide T Vị trí 102 có đột biến thay nucleotide C thành T, vị trí 110 có thay nucleotide G nucleotide A số vị trí 114, 670, 677 có thay nucleotide G nucleotide T Một số đoạn từ 529533 582-586 xuất đột biến nucleotide 41 42 Hình 4.14 Kết đánh giá tương đồng chủng Bacillus mycoides (L3) với số chủng Bacillus khác có mã số Genbank So sánh trình tự L3 với chủng Bacillus mycoides khác thấy gần tương đồng, so với chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus 43 có xảy nhiều vị trí thay nucleotide không đáng kể, so với chủng vi khuẩn bacillus khác thấy xuất nhiều vị trí có thay nucleotide 4.3.5 Xây dựng phân tích di truyền phả hệ Bacillus mycoides nghiên cứu với Bacillus khác có mã số Genbank Sử dụng 26 trình tự nucleotide 16S vi khuẩn Genbank để xây dụng di truyền phả hệ Cây phả hệ di truyền chủng (L3) số vi khuẩn chi Bacillus xây dựng hình 4.15 phần mềm MEGAX MZ144247.1 Bacillus anthracis strain Sterne 16S ribosomal RNA gene partial sequence MZ144246.1 Bacillus anthracis strain BA23 16S ribosomal RNA gene partial sequence OP796358.1 Bacillus mycoides strain ACL301 16S ribosomal RNA gene partial sequence OP936018.1 Bacillus thuringiensis strain P2 16S ribosomal RNA gene partial sequence OP936016.1 Bacillus thuringiensis strain B1 16S ribosomal RNA gene partial sequence OP936015.1 Bacillus thuringiensis strain P5 16S ribosomal RNA gene partial sequence Bacillus mycoides L3 AM910408.1 Bacillus mycoides partial 16S rRNA gene strain BGSC1 MW282916.1 Bacillus mycoides strain NG122 16S ribosomal RNA gene partial sequence OM149778.1 Bacillus mycoides strain 2861 16S ribosomal RNA gene partial sequence OQ196011.1 Bacillus mycoides strain CRRU58 16S ribosomal RNA gene partial sequence NR 024697.1 Bacillus mycoides strain DSM 11821 16S ribosomal RNA partial sequence KP006648.1 Bacillus weihenstephanensis strain JAS 83/3 16S ribosomal RNA gene partial sequence AB334765.1 Bacillus weihenstephanensis gene for 16S ribosomal RNA partial sequence MW672581.1 Bacillus mycoides strain Ter74 16S ribosomal RNA gene partial sequence MH578628.1 Bacillus pseudomycoides strain SB138 16S ribosomal RNA gene partial sequence ON823176.1 Bacillus pseudomycoides strain NZ CM000745.1 16S ribosomal RNA gene partial sequence OM315108.1 Bacillus mycoides strain AVIDPF-1 16S ribosomal RNA gene partial sequence OM398480.1 Bacillus pseudomycoides strain AVIDPF-1 16S ribosomal RNA gene partial sequence MT071635.1 Bacillus subtilis strain IJ114 16S ribosomal RNA gene partial sequence MZ723106.1 Bacillus licheniformis strain ALP3 16S ribosomal RNA gene partial sequence MN640849.1 Brevibacillus laterosporus strain NEL-011 16S ribosomal RNA gene partial sequence DQ122932.2 Brevibacillus laterosporus 16S ribosomal RNA gene partial sequence MN911426.1 Brevibacillus laterosporus strain GCTS9 16S ribosomal RNA gene partial sequence AB073198.1 Paenibacillus popilliae gene for 16S rRNA partial sequence NZ BALG01000468.1 Paenibacillus popilliae ATCC 14706 whole genome shotgun sequence Hình 4.15 Cây phả hệ di truyền chủng vi khuẩn mycoides L3 số vi khuẩn chi Bacillus Từ hình ảnh phả hệ thấy chủng vi khuẩn (L3) nhánh với chủng Bacillus mycoides số chủng vi khuẩn thuộc nhóm sereus có mã genbank Như khẳng định chủng vi khuẩn (L3) Bacillus mycoides 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận -Đã phân lập chủng Bacillus mycoides từ mẫu đất trồng lạc (Bắc Ninh), đất trồng đậu tương (Gia Lâm-Hà Nội), đất trồng đậu tương (Đơng Hưng-Thái Bình) -Đã định danh chủng Bacillus mycoides (L3) 16S rRNA, cụ thể trình tự gen chủng L3 so với trình tự gen số chủng vi khuẩn Bacillus mycoides khác có mức độ tương đồng lên tới 99,81% 5.2 Kiến nghị Sử dụng kết nghiên cứu làm tiền đề cho nghiên cứu sâu sử dụng vi khuẩn Bacillus mycoides sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho nông nghiệp, tăng suất thu hoạch trồng 45 Tài Liệu Tham Khảo Tài Liệu Tiếng Việt Dũng, N L., Quyến, N Đ & Ty, P V 2002 Vi Sinh Vật Học Hà Nội: Nhà Xuất Bản Giáo Dục Nguyễn Thị Phương Trang, Đức, N M., Thế, Đ T & Hương, T T 2013 Phương Pháp Tách Chiết Adn Tổng Số Từ Mẫu Gỗ Hội Nghị Khoa Học Toàn Quốc Về Sinh Thái Và Tài Nguyên Sinh Vật Lần Thứ Thụy, N T T 2009 Nghiên Cứu Tuyển Chọn Chủng Vi Khuẩn Bacillus Phân Lập Từ Đất Vườn Sinh Protease Kiềm Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học, Trƣờng Đh Sƣ Phạm Tp Hồ Chí Minh,(3), Tr 37-39 Vũ, N X., Nhi, P T P & Đông, T T H Khả Năng Hạn Chế Bệnh Hại Lá Trên Cây Lạc Của Chế Phẩm Sinh Học Bacillus Tại Quảng Nam Control Of Foliar Diseases On Peanut By Bacillus Bio-Products In Quang Nam Province Tài Liệu Tiếng Anh Ali, B., Wang, X., Saleem, M H., Azeem, M A., Afridi, M S., Nadeem, M., Ghazal, M., Batool, T., Qayyum, A & Alatawi, A J L 2022 Bacillus Mycoides Pm35 Reinforces Photosynthetic Efficiency, Antioxidant Defense, Expression Of Stress-Responsive Genes, And Ameliorates The Effects Of Salinity Stress In Maize 12, 219 Ambrosini, A., Sant’anna, F H., De Souza, R., Tadra-Sfeir, M., Faoro, H., Alvarenga, S M., Pedrosa, F O., Souza, E M & Passaglia, L M J G A 2015 Genome Sequence Of Bacillus Mycoides B38v, A GrowthPromoting Bacterium Of Sunflower 3, E00245-15 Ambrosini, A., Stefanski, T., Lisboa, B., Beneduzi, A., Vargas, L & Passaglia, L J A O A B 2016 Diazotrophic Bacilli Isolated From The Sunflower Rhizosphere And The Potential Of Bacillus Mycoides B38v As Biofertiliser 168, 93-110 Bargabus, R., Zidack, N., Sherwood, J., Jacobsen, B J P & Pathology, M P 2002 Characterisation Of Systemic Resistance In Sugar Beet Elicited By A Non-Pathogenic, Phyllosphere-Colonizing Bacillus Mycoides, Biological Control Agent 61, 289-298 Bargabus, R L., Zidack, N K., Sherwood, J E & Jacobsen, B J J M P.-M I 2003 Oxidative Burst Elicited By Bacillus Mycoides Isolate Bac J, A Biological Control Agent, Occurs Independently Of Hypersensitive Cell Death In Sugar Beet 16, 1145-1153 Baruzzi, F., Quintieri, L., Morea, M., Caputo, L J S A M P C C R & Advances, T 2011 Antimicrobial Compounds Produced By Bacillus Spp And Applications In Food 2, 1102-1111 46 Beryl, G P., Thazeem, B., Umesh, M., Senthilkumar, K., Kumar, M N & Preethi, K 2021 Bioconversion Of Feather Composts Using Proteolytic Bacillus Mycoides For Their Possible Application As Biofertilizer In Agriculture Waste And Biomass Valorization, 12, 6795-6809 Bhattacharjee, I., Mazumdar, D & Saha, S P 2012 Microbial Amylases And Their Potential Application In Industries: A Review Structure, 18, 19-20 Bosshard, P P., Zbinden, R., Abels, S., Böddinghaus, B., Altwegg, M & Böttger, E C 2006 16s Rrna Gene Sequencing Versus The Api 20 Ne System And The Vitek Id-Gnb Card For Identification Of Nonfermenting GramNegative Bacteria In The Clinical Laboratory J Clin Microbiol, 44, 135966 Clarridge Iii, J E J C M R 2004 Impact Of 16s Rrna Gene Sequence Analysis For Identification Of Bacteria On Clinical Microbiology And Infectious Diseases 17, 840-862 Fiedoruk, K., Drewnowska, J M., Daniluk, T., Leszczynska, K., Iwaniuk, P & Swiecicka, I J S R 2017 Ribosomal Background Of The Bacillus Cereus Group Thermotypes 7, 1-10 Flugge, C 1886 Die Mikroorganismen Mit Besonderer Berücksichtigung Der Aetiologie Der Infectionnskrankheiten, Verlag Von Fcw Vogel Fravel, D R., Spurr, H & Harvey, J J P 1977 Biocontrol Of Tobacco BrownSpot Disease By Bacillus Cereus Subsp Mycoides In A Controlled Environment 67, 930-932 Gontero, P., Bohle, A., Malmstrom, P.-U., O’donnell, M A., Oderda, M., Sylvester, R & Witjes, F J E U 2010 The Role Of Bacillus CalmetteGuérin In The Treatment Of Non–Muscle-Invasive Bladder Cancer 57, 410-429 Gordon, R., Haynes, W & Pang, C J W D., Usda 1973 The Genus Bacillus Us Department Of Agriculture Handbook, 427 109-126 Gu, Y., Xu, X., Wu, Y., Niu, T., Liu, Y., Li, J., Du, G & Liu, L 2018 Advances And Prospects Of Bacillus Subtilis Cellular Factories: From Rational Design To Industrial Applications Metabolic Engineering, 50, 109-121 Guerrero ‐ Barajas, C., Constantino ‐ Salinas, E A., Amora ‐ Lazcano, E., Tlalapango‐Ángeles, D., Mendoza‐Figueroa, J S., Cruz‐Maya, J A., Jan‐Roblero, J J J O T S O F & Agriculture 2020 Bacillus Mycoides A1 And Bacillus Tequilensis A3 Inhibit The Growth Of A Member Of The Phytopathogen Colletotrichum Gloeosporioides Species Complex In Avocado 100, 4049-4056 Hall, T A Bioedit: A User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor And Analysis Program For Windows 95/98/Nt Nucleic Acids Symposium Series, 1999 [London]: Information Retrieval Ltd., C1979-C2000., 95-98 47 Hegarty, P K., Sfakianos, J P., Giannarini, G., Dinardo, A R & Kamat, A M J E U O 2020 Covid-19 And Bacillus Calmette-Guérin: What Is The Link? 3, 259-261 Hoa, N T., Baccigalupi, L., Huxham, A., Smertenko, A., Van, P H., Ammendola, S., Ricca, E & Cutting, A S 2000 Characterization Of Bacillus Species Used For Oral Bacteriotherapy And Bacterioprophylaxis Of Gastrointestinal Disorders Appl Environ Microbiol, 66, 5241-7 Janda, J M & Abbott, S L J J O C M 2007 16s Rrna Gene Sequencing For Bacterial Identification In The Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, And Pitfalls 45, 2761-2764 Liang, T.-W., Chen, W.-T., Lin, Z.-H., Kuo, Y.-H., Nguyen, A D., Pan, P.-S & Wang, S.-L J I J O M S 2016 An Amphiprotic Novel Chitosanase From Bacillus Mycoides And Its Application In The Production Of Chitooligomers With Their Antioxidant And Anti-Inflammatory Evaluation 17, 1302 Librado, P & Rozas, J J B 2009 Dnasp V5: A Software For Comprehensive Analysis Of Dna Polymorphism Data 25, 1451-1452 Mignard, S & Flandrois, J.-P J J O M M 2006 16s Rrna Sequencing In Routine Bacterial Identification: A 30-Month Experiment 67, 574-581 Najafi, A., Rahimpour, M., Jahanmiri, A., Roostaazad, R., Arabian, D & Ghobadi, Z J C E J 2010 Enhancing Biosurfactant Production From An Indigenous Strain Of Bacillus Mycoides By Optimizing The Growth Conditions Using A Response Surface Methodology 163, 188-194 Neher, O T., Johnston, M R., Zidack, N K & Jacobsen, B J J B C 2009 Evaluation Of Bacillus Mycoides Isolate Bmj And B Mojavensis Isolate 203-7 For The Control Of Anthracnose Of Cucurbits Caused By Glomerella Cingulata Var Orbiculare 48, 140-146 Paul, B., Charles, R & Bhatnagar, T J M R 1995 Biological Control Of Pythium Mamillatum Causing Damping-Off Of Cucumber Seedlings By A Soil Bacterium, Bacillus Mycoides 150, 71-75 Peng, R., Xiong, A., Li, X., Fuan, H., Yao, Q J A M & Biotechnology 2003 A Δ-Endotoxin Encoded In Pseudomonas Fluorescens Displays A High Degree Of Insecticidal Activity 63, 300-306 Pinchuk, I V., Bressollier, P., Sorokulova, I B., Verneuil, B & Urdaci, M C J R I M 2002 Amicoumacin Antibiotic Production And Genetic Diversity Of Bacillus Subtilis Strains Isolated From Different Habitats 153, 269-276 Ramesh, A., Harani Devi, P., Chattopadhyay, S & Kavitha, M 2020 Commercial Applications Of Microbial Enzymes Microbial Enzymes: Roles And Applications In Industries, 137-184 48 Reller, L B., Weinstein, M P & Petti, C A J C I D 2007 Detection And Identification Of Microorganisms By Gene Amplification And Sequencing 44, 1108-1114 Samanta, S., Datta, D & Halder, G 2020 Biodegradation Efficacy Of Soil Inherent Novel Sp Bacillus Tropicus (Mk318648) Onto Low Density Polyethylene Matrix Journal Of Polymer Research, 27, 1-16 Seki, T., Chung, C.-K., Mikami, H., Oshima, Y J I J O S & Microbiology, E 1978 Deoxyribonucleic Acid Homology And Taxonomy Of The Genus Bacillus 28, 182-189 Skerman, V B D., Mcgowan, V & Sneath, P H A J I J O S B 1980 Approved Lists Of Bacterial Names 30, 225-420 Smith, N R., Gordon, R E & Clark, F E 1952 Aerobic Sporeforming Bacteria, Us Government Printing Office Somerville, H & Jones, M J M 1972 Dna Competition Studies Within The Bacillus Cereus Group Of Bacilli 73, 257-265 Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S J M B & Evolution 2007 Mega4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega) Software Version 4.0 24, 1596-1599 Tang, Y.-W., Ellis, N M., Hopkins, M K., Smith, D H., Dodge, D E & Persing, D H J J O C M 1998 Comparison Of Phenotypic And Genotypic Techniques For Identification Of Unusual Aerobic Pathogenic GramNegative Bacilli 36, 3674-3679 Turchi, L., Santini, T., Beccari, E & Di Franco, C J A O M 2012 Localization Of New Peptidoglycan At Poles In Bacillus Mycoides, A Member Of The Bacillus Cereus Group 194, 887-892 Van Der Maarel, M J., Van Der Veen, B., Uitdehaag, J C., Leemhuis, H & Dijkhuizen, L 2002 Properties And Applications Of Starch-Converting Enzymes Of The Α-Amylase Family Journal Of Biotechnology, 94, 137155 Weisburg, W G., Barns, S M., Pelletier, D A & Lane, D J 1991 16s Ribosomal Dna Amplification For Phylogenetic Study Journal Of Bacteriology, 173, 697-703 Yi, Y., De Jong, A., Spoelder, J., Elzenga, J T M., Van Elsas, J D & Kuipers, O P J G A 2016 Draft Genome Sequence Of Bacillus Mycoides M2e15, A Strain Isolated From The Endosphere Of Potato 4, E00031-16 49