Bài giảng công nghệ protein – enzyme chương 7
Định lượng đánh giá độ tinh chế phẩm protein Các phương pháp xác định hàm lượng protein Protein sau tách chiết làm định lượng Nếu protein nghiên cứu enzyme việc định lượng thơng qua xác định hoạt độ enzyme (theo quy ước quốc tế: đơn vị hoạt độ enzyme lượng enzyme làm chuyển hoá mol chất phút điều kiện tiêu chuẩn) Các phương pháp xác định hàm lượng protein Như sau bước tách chiết làm protein người ta thấy tổng lượng protein giảm hoạt độ enzyme tăng nghĩa hoạt độ riêng tăng cao Protein coi bước tách chiết làm sau không làm tăng hoạt độ riêng chúng nữa, ta hồn thành việc tách chiết làm protein Các phương pháp xác định hàm lượng protein Nếu protein khơng phải enzyme ta định lượng chúng phương pháp khác Nếu protein ta nghiên cứu hormon độc tố chúng xác định qua hiệu ứng sinh học mà chúng gây ra; ví dụ hormon sinh trưởng (growth hormone) kích thích sinh trưởng tế bào đích ni cấy Nếu protein vận chuyển xác định chúng thơng qua nồng độ chất mà chúng vận chuyển Định lượng nitrogen theo phương pháp Kjeldahl Phần lớn phương pháp gián tiếp xác định protein dựa sở xác định lượng nitrogen Lượng nitrogen có protein gần giống không phụ thuộc vào chất lượng nguồn protein Đương nhiên sở lượng nitrogen xác định protein tinh lượng protein mẫu nghiên cứu mà ngồi protein khơng chứa chất chứa nitrogen khác Định lượng nitrogen theo phương pháp Kjeldahl Trong nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, protein thô định lượng cách xác định lượng nitrogen toàn phần kết nhân với 6,25, nghĩa coi protein luôn chứa 16% nitrgen Định lượng nitrogen theo phương pháp Kjeldahl Thực tế, thực phẩm, bên cạnh protein cịn có chất hữu khác có chứa nitrogen amid, alcaloid, ammonia (ví dụ thực phẩm lên men) acid nitric hàm lượng nitrogen tồn phần thức cao 16% (16-17%) protein thực vật hàm lượng lại thấp 16% Hệ số 6,25 hệ số trung bình thô Định lượng nitrogen theo phương pháp Kjeldahl Ngun lý phương pháp vơ hố mẫu H2SO4 đậm đặc chất xúc tác Dùng kiềm mạnh (NaOH KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 Sau hứng NH3 vào dung dịch acid có nồng độ xác định Sau dùng kiềm có nồng độ xác định để chuẩn độ acid dư Từ tính lượng nitrogen có ngun liệu Định lượng protein theo phương pháp Lowry Phương pháp dựa sở dùng máy đo màu để xác định màu sản phẩm khử phosphomolipden phosphowolframate (thuốc thử Folin - Ciocalteau) với phức hợp đồng - protein Phức màu xanh tạo thành đo bước sóng 675nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein Dựa vào đồ thị chuẩn protein (thông thường dùng tinh thể albumin huyết bị) ta tính hàm lượng protein mẫu nghiên cứu Định lượng protein theo phương pháp Lowry Phương pháp Lowry dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép phát protein dung dịch nồng độ g/ml Tuy nhiên cường độ màu cịn tuỳ thuộc nhiều vào loại protein Ví dụ, nồng độ, dung dịch trypsin cho cường độ màu cao gấp lần gelatin, hemoglobin cho cường độ màu thấp trypsin cao gelatin Ngồi ra, nhiều chất khác làm tăng hay giảm cường độ màu phản ứng, phương pháp cho kết xác xác định protein tinh 10 Định lượng protein phương pháp quang phổ Phương pháp đơn giản để đo nồng độ protein dung dịch độ hấp thụ tia cực tím Nếu protein tinh nồng độ tuyệt đối tính theo giá trị đo Nếu protein khơng tinh (ví dụ, dịch chiết từ sắc ký) nồng độ protein tổng 11 tính tương đối từ độ hấp thụ Định lượng protein phương pháp quang phổ Nguyên tắc phương pháp protein hấp thụ tia cực tím cực đại bước sóng 280nm acid amin thơm tryptophan, tyrosine phenylalanine Độ hấp thụ 280nm thay đổi tuỳ loại protein hệ số tắt đo (nghĩa độ hấp thụ dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho protein cho phép tính nồng độ protein tinh 12 Định lượng protein phương pháp quang phổ Với hỗn hợp protein với loai protein mà hệ số tắt nồng độ protein tính sau: Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260 Trong đó: A280: độ hấp thụ bước sóng 280nm A260: độ hấp thụ bước sóng 260nm 13 Định lượng protein phương pháp quang phổ Phương pháp không dùng cho dung dịch có nồng độ protein thấp 0,1mg/ml có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ vùng cực tím (ví dụ, đệm, acid nucleic số chất béo), protein dịch truyền phù khơng phải dung dịch (Ví dụ, màng phức hợp có trọng lượng phân tử lớn) Cũng cần ý tỷ lệ A280/A260 thấp 0,6 nghĩa dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn chất khác, đặc biệt với acid nucleic nên sử dụng phương pháp Lowry để đo nồng độ protein 14 Đánh giá tính đồng thể protein Khi nhận protein enzyme trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể Độ đồng thể chế phẩm protein enzyme phải kiểm tra số phương pháp dựa nguyên lý khác Trong số trường hợp protein enzyme coi đồng thể ly tâm, lại phân chia thành số isoenzyme phương pháp điện di gel Chính vậy, dùng nhiều loại phương pháp khác để kiểm tra độ protein mà kết cho đồng thể protein cơng nhận tinh khiết Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng xây 15 dựng đồ thị độ hoà tan, điện di siêu ly tâm ... hàm lượng protein Protein sau tách chiết làm định lượng Nếu protein nghiên cứu enzyme việc định lượng thông qua xác định hoạt độ enzyme (theo quy ước quốc tế: đơn vị hoạt độ enzyme lượng enzyme. .. protein phương pháp quang phổ Với hỗn hợp protein với loai protein mà khơng biết hệ số tắt nồng độ protein tính sau: Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA280-0 ,77 xA260 Trong đó: A280: độ hấp thụ bước sóng... ta hoàn thành việc tách chiết làm protein Các phương pháp xác định hàm lượng protein Nếu protein khơng phải enzyme ta định lượng chúng phương pháp khác Nếu protein ta nghiên cứu hormon độc tố