Nghiên cứu khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn lactic và định hướng ứng dụng trong quá trình nảy mầm gạo lứt

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu khả kháng nấm mốc vi khuẩn lactic định hướng ứng dụng trình nảy mầm gạo lứt NGUYỄN BÁ THƯ UYÊN UYEN.NBT211198M@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Tiến Cường Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ sinh học Cơng nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 04/2023 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Nguyễn Bá Thư Uyên Đề tài luận văn: Nghiên cứu khả kháng nấm mốc vi khuẩn lactic định hướng ứng dụng trình nảy mầm gạo lứt Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số SV: 20211198M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 28/04/2023 với nội dung sau: - Bổ sung danh mục từ viết tắt - Bổ sung tài liệu tham khảo chương chương - Bổ sung phương pháp xác định axit hữu sắc kí lỏng hiệu cao - Bổ sung phương pháp tạo tiêu quan sát hình thái nấm mốc - Bổ sung bước xử lí gạo sau q trình nảy mầm có ứng dụng vi khuẩn lactic Ngày Giáo viên hướng dẫn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG tháng năm 2023 Tác giả luận văn ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Nghiên cứu khả kháng nấm mốc vi khuẩn lactic định hướng ứng dụng trình nảy mầm gạo lứt Giáo viên hướng dẫn Ký ghi rõ họ tên LỜI CẢM ƠN Quãng thời gian năm học Cao học quãng thời gian dài, trơi qua thật nhanh Để hồn thiện luận án tốt nghiệp này, em nhận hỗ trợ nhiều quan, tổ chức, cá nhân Cảm ơn mẹ, người cổ vũ đường học tâp Cảm ơn người bạn, người chị, người em ln động viên lúc khó khăn Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Tiến Cường TS Nguyễn Hải Vân người theo sát tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em nhiều trình học tập thực luận án Năm năm học Đại học hai năm học Cao học Đại học Bách khoa Hà Nội mang đến cho em nhiều cảm xúc trải nghiệm Bách khoa tuổi trẻ, bệ phóng cho nghiệp tương lai nơi cho em người bạn, người thầy cô sẵn sàng chia sẻ Bách khoa chắn kỉ niệm đẹp em nhớ Cảm ơn Bách khoa tất cả! Tóm tắt nội dung luận văn a) Lý chọn đề tài Trong xã hội đại, nhu cầu tiêu dùng thực phẩm ngày đa dạng, phong phú đặc biệt năm trở lại đây, trở thành vấn đề cao điểm đáng báo động trước cảnh báo thực phẩm bẩn, ô nhiễm xảy Từ xưa đến nay, nấm men nấm mốc vốn xem mặt có lợi, mặt khác đóng vai trò tác nhân gây hư hỏng thực phẩm chủ yếu, làm giảm hiệu kinh tế cho bên sản xuất lãng phí thực phẩm cho người sử dụng Thêm vào đó, chủng nấm sản sinh độc tố mycotoxin đe doạ tới sức khoẻ lâu dài tính mạng người Do đó, việc ngăn ngừa tác động từ mối nguy cần quan tâm xử lý triệt để Bên cạnh việc xử lý nấm mốc hợp chất hoá học, xu hướng gần sử dụng tác nhân sinh học bảo quản để tăng tính an toàn cho thực phẩm Đáp ứng với yêu cầu đó, vi khuẩn axit lactic số giải pháp tiềm khả kéo dài thời gian bảo quản, mức độ an toàn, giữ nguyên cấu trúc cung cấp lợi ích cho người (probiotic…) b) Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu Mục đích nghiên cứu luận văn: - Xác định khả kháng nấm số chủng vi khuẩn lactic số loại nấm mốc hay gặp sản phẩm ngũ cốc - Đánh giá hiệu bảo quản sinh học chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn đối tượng gạo lứt nảy mầm Đối tượng nghiên cứu: - chủng vi khuẩn lactic: Lactobacillus acidophilus TM, Lactobacillus acidophilus VAST, Lactobacillus plantarum NCDN4, Lactobacillus fermentum HA7, Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus paracasei B21060 - chủng nấm mốc: Aspergillus niger CBS 76997 Penicillium oxalicum 20B - Định hướng ứng dụng q trình nảy mầm gạo lứt c) Tóm tắt đọng nội dung đóng góp tác giả Các nội dung chính: Sàng lọc khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic chủng nấm mốc mục tiêu - Đánh giá khả kháng nấm dịch tế bào vi khuẩn lactic - Đánh giá khả kháng nấm sinh khối vi khuẩn lactic - Đánh giá khả kháng nấm kết hợp dịch tế bào sinh khối vi khuẩn lactic - Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic tiềm cho thí nghiệm Dự đoán chế kháng nấm vi khuẩn lactic chọn thông qua việc: - Xác định thành phần chất có dịch tế bào vi khuẩn Xác định nồng độ diệt nấm tối thiểu vi khuẩn lactic Xác định định lượng ảnh hưởng sinh khối vi khuẩn đến sinh khối nấm mốc - Quan sát ảnh hưởng vi khuẩn đến hình thái nấm mốc Ứng dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm gạo lứt: đánh giá hiệu sử dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm, xác định khả nảy mầm có mặt vi khuẩn lactic - Đóng góp mới: - Đánh giá khả kháng nấm chủng vi khuẩn với chủng nấm mốc Aspergillus niger CBS 76997 Penicillium oxalicum 20B - Bước đầu dự đoán chế kháng vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum NCDN4 với nấm mốc Aspergilus niger CBS 76997 - Chứng minh tiềm ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum NCDN4 trình nảy mầm gạo lứt d) Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp chính: - Phương pháp cấy chấm điểm nấm mốc - Phương pháp thạch hai lớp phủ (double layer) Dự đoán chế kháng nấm vi khuẩn lactic chọn thông qua việc: - Xác định thành phần axit hữu có dịch tế bào vi khuẩn phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC - Xác định định lượng ảnh hưởng sinh khối vi khuẩn đến sinh khối nấm mốc phương pháp nuôi cấy đồng thời sấy đến khối lượng không đổi - Quan sát ảnh hưởng vi khuẩn đến hình thái nấm mốc kính hiển vi quang học Ứng dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm gạo lứt phương pháp cảm nhiễm chủ động nấm mốc gạo lứt nảy mầm e) Kết luận Nghiên cứu chứng minh dịch tế bào sinh khối chủng vi khuẩn lactic sử dụng thí nghiệm ức chế nấm mốc A niger CBS 76997 P oxalicum 20B Khi kết hợp 10% dịch tế bào 106 CFU/mL sinh khối vi khuẩn, ức chế hoàn toàn P oxalicum 20B ức chế đến 58,8% đường kính tản nấm ngày thứ 5, trì ngày chưa xuất bào tử nấm mốc với A niger CBS 76997 Bước đầu giải thích chế ức chế nấm mốc bao gồm: - Do vi khuẩn sản sinh lượng lớn axit hữu cơ, đặc biệt axit lactic 18,86 g/L sau 24h nuôi cấy - Do cạnh tranh dinh dưỡng: giảm 50,84% khối lượng nấm mốc sau ngày nuôi cấy đồng thời - Ảnh hưởng đến trình tạo bào tử: làm chậm trình hình thành bào tử, giảm độ đậm đặc bào tử, gây tổn thương thành tế bào Nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng trình nảy nầm gạo lứt, giảm rõ rệt nấm mốc hình thành q trình ủ mà khơng ảnh hưởng đến khả nảy nầm hạt HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 1.2 1.3 Nấm mốc nông sản thực phẩm 1.1.1 Đặc điểm chung nấm mốc 1.1.2 Nấm mốc thường gặp nông sản thực phẩm 1.1.3 Tác hại nấm mốc 1.1.4 Các phương pháp hạn chế nấm mốc ngũ cốc Vi khuẩn lactic khả kháng nấm vi khuẩn lactic 1.2.1 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic 1.2.2 Đặc tính kháng nấm vi khuẩn lactic 11 1.2.3 Các hợp chất chuyển hóa vi khuẩn lactic 11 1.2.4 Khả cạnh tranh vi khuẩn lactic 16 1.2.5 Ứng dụng vi khuẩn lactic chất bảo quản kháng nấm 17 Tổng quan gạo lứt nảy mầm 18 1.3.1 Gạo lứt nảy mầm 18 1.3.2 Quy trình sản xuất gạo lứt nảy mầm 19 1.3.3 Giá trị dinh dưỡng lợi ích sức khỏe gạo lứt nảy mầm 21 1.3.4 Nấm mốc phương pháp chống mốc trình nảy mầm gạo lứt 22 1.4 Mục đích nghiên cứu 23 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 2.2 2.3 Vật liệu 24 2.1.1 Chủng vi sinh vật 24 2.1.2 Nguyên liệu 25 2.1.3 Hóa chất môi trường sử dụng 25 2.1.4 Dụng cụ thiết bị sử dụng 26 Phương pháp phân tích 26 2.2.1 Phương pháp đo OD chang đếm môi trường thạch 26 2.2.2 Phương pháp đo pH 28 2.2.3 Phương pháp chuẩn độ axit 28 2.2.4 Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi 28 2.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 29 Bố trí thí nghiệm 29 2.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn lactic 29 2.3.2 Nuôi cấy nấm mốc 29 2.3.3 Xác định thời điểm nuôi cấy vi khuẩn lactic 30 2.3.4 Sàng lọc khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 30 2.3.5 Xác định thành phần chất dịch tế bào vi khuẩn lactic 34 2.3.6 Xác định nồng độ tối thiểu chất dịch tế bào để ức chế hoàn toàn nấm mốc (MFC) 34 2.3.7 nấm mốc Xác định ảnh hưởng sinh khối vi khuẩn lactic đến sinh khối 36 2.3.8 Xác định ảnh hưởng vi khuẩn latic đến hình thái nấm mốc quan sát kính hiển vi 37 2.3.9 2.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm gạo lứt 37 Sơ đồ nghiên cứu 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Sàng lọc khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic chủng nấm mốc: A niger CBS 76997 P oxalicum 20B 40 3.1.1 Biến đổi pH hàm lượng axit dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic theo thời gian 40 3.1.2 Đánh giá khả kháng nấm dịch tế bào vi khuẩn lactic 41 3.1.3 Đánh giá khả kháng nấm sinh khối vi khuẩn lactic 46 3.1.4 Đánh giá khả kháng nấm kết hợp dịch tế bào sinh khối vi khuẩn lactic 53 3.1.5 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic tiềm ức chế nấm mốc 57 3.2 Bước đầu giải thích chế ức chế nấm mốc A niger CBS 7697 L plantarum NCDN4 60 3.2.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn lactic L plantarum NCDN4 61 3.2.2 Thành phần chất có dịch tế bào vi khuẩn L plantarum NCDN4 61 3.2.3 Xác định nồng độ diệt nấm tối thiểu vi khuẩn lacic L plantarum NCDN4 63 3.2.4 Ảnh hưởng vi khuẩn L plantarum NCDN4 đến tạo sinh khối nấm mốc 65 3.2.5 3.3 Ảnh hưởng vi khuẩn lactic đến hình thái nấm mốc 66 Ứng dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm gạo lứt 67 CHƯƠNG KẾT LUẬN 71 ảnh hưởng đến hoạt động kháng nấm axit hữu cơ: pKa cao pH mơi trường thấp axit dạng khơng phân ly tác dụng pH nội bào hoạt tính kháng nấm cao Tuy nhiên, tất axit hữu hoạt động theo cách Tác dụng hiệp đồng axit chế kháng cần xem xét Người ta cho tác dụng axit propionic axit axetic thường phụ thuộc vào giảm pH axit lactic gây Sản xuất axit lactic cao, pH cuối thấp lượng axit dạng khơng phân ly cao Hiệu ứng đặc biệt đáng kể độ pH giảm xuống pKa axit axetic (4,75), phần trăm axit axetic không phân ly tăng từ 34,9 lên 84,5% độ pH giảm từ xuống [57] Suzuki cs [58] hoạt tính kháng nấm quan sát thấy số chất khởi động mát vi khuẩn bao gồm chủ yếu axit lactic axit axetic; hoạt tính kháng nấm bị độ pH điều chỉnh thành Tuy nhiên, việc sản xuất axit nói khơng đủ để giải thích hoạt động kháng nấm vi khuẩn lactic Đối với vi khuẩn lactic kháng nấm, nhiều phân tử, tạo với số lượng thấp (mg/L mg/kg) MIC riêng lẻ chúng, có khả hoạt động phối hợp với axit lactic axit axetic [56] Sự giảm hoạt tính kháng nấm quan sát dịch tế bào vi khuẩn giá trị pH lớn 4,5 cho thấy tác dụng hiệp đồng axit lactic hợp chất kháng nấm khác [47] Bản chất số lượng hợp chất phụ thuộc vào lồi chủng Ví dụ, Miezkin et al (2017) [59] cho tác dụng kháng nấm L harbinensis K.V9.3.1.Np tác dụng hiệp đồng axit axetic, axit lactic, 2pyrrolidone-5-carboxylic, (S)-(−)-2–hydroxyisocapric, axit 2-hydroxybenzoic, Dal Bello cs [43] báo cáo việc xác định axit lactic, axit phenyllactic hai dipeptide tuần hồn (cyclo (L-Leu-L-Pro) cyclo(L-Phe-L-Pro)) thành phần chịu trách nhiệm cho hoạt động kháng nấm L plantarum FST 1.7 3.2.3 Xác định nồng độ diệt nấm tối thiểu vi khuẩn lacic L plantarum NCDN4 Hình 3-19 Sự phát triển nấm mốc giếng sau ngày 63 Sau ngày nuôi cấy, ta quan sát thấy từ giếng A1 đến giếng B5 (lần lượt theo thứ tự từ trái qua phải, từ xuống dưới) nhìn thấy rõ phát triển nấm mốc Giếng D5 (mẫu đối chứng âm – có nấm mốc nuôi cấy môi trường YPD), nấm mốc phát triển bình thường, độ dày đặc bào tử cao Giếng D6 (mẫu đối chứng dương với chế phẩm thị trường nystatin, nồng độ bổ sung 0,5 mg/mL) không cho thấy phát triển nấm mốc quan sát mắt thường Quan sát mắt thường thấy, tỉ lệ bổ sung dịch tế bào vi khuẩn cao, độ dày đặc bào tử nấm mốc thưa Điều chứng tỏ, nồng độ dịch tế bào sử dụng thí nghiệm tỉ lệ thuận với khả kháng nấm Từ giếng B6 (tương đương với nồng độ dịch tế bào bổ sung 340l) trở đi, ta không quan sát thấy phát triển nhìn thấy nấm mốc Như vậy, dịch tế bào vi khuẩn L plantarum NCDN4 có cho hấy hoạt tính ức chế nấm mốc A niger CBS 76997 Kết với thí nghiệm sàng lọc khả kháng nấm dịch tế bào vi khuẩn tiến hành Nồng độ tối thiểu (MIC) chất dịch tế bào vi khuẩn lactic L plantarum NCDN4 để ức chế 106 bào tử/ml nấm mốc A niger CBS 76997 thí nghiệm xác định 340 µL Với nồng độ dịch tế bào vi khuẩn L plantarum NCDN4, khơng có phát triển nấm mốc A niger CBS 76997 quan sát Hiệu kháng nấm tương đương với chế phẩm thị trường nystatin nồng độ 0,5 mg/mL Kết phù hợp với kết thí nghiệm Dopazo cs (2022) [60] Dịch tế bào từ L plantarum BN17, L plantarum BN16, L plantarum E3 L plantarum E4 cho thấy hoạt tính ức chế đối nấm mốc Aspergillus thử nghiệm, đạt MIC từ 12,5 đến 100 g/L Lấy khay giếng sau ngày nuôi 30oC, từ giếng không nhận thấy phát triển nấm mốc, hút 10µl dịch ni từ giếng đó, nhỏ vào đĩa thạch có sẵn mơi trường YPD Sau đó, đĩa đem ủ tủ nuôi 30oC ngày Khay giếng tiếp tục ủ tủ nuôi 30oC thêm ngày Quan sát phát triển nấm mốc đĩa thạch khay giếng Hình 3-14 Sự phát triển nấm mốc từ dịch nuôi giếng từ sau giếng MIC đĩa thạch sau ngày 64 Kết cho thấy, khơng có phát triển nấm mốc đĩa thạch từ giếng B6 trở Mẫu đối chứng dương với nystatin (giếng D6) không nhận thấy phát triển nấm mốc mắt thường Như vậy, dịch tế bào vi khuẩn L plantarum NCDN4 có khả diệt hồn tồn nấm mốc A niger CBS 769997 Nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) để ức chế phát triển 106 bào tử/ml nấm mốc 340 µL Với nồng độ này, dịch tế bào vi khuẩn lactic ức chế hoàn toàn 106 bào tử nấm mốc A niger CBS 76997, kết tương đương chế phẩm thương mại nystatin bổ sung với nồng độ 0,5 mg/mL Theo báo cáo nhiều tài liệu, hầu hết lồi Aspergillus có khả kháng cao với phương pháp điều trị thuốc kháng nấm [60], dịch tế bào vi khuẩn L plantarum NCDN4 thể đặc tính kháng nấm chi kết đầy hứa hẹn Một số báo khác chứng minh hoạt động chống lại Aspergillus vi khuẩn lactic tương tự; ví dụ, Luz cs (2020) [61] cho thấy MFC 250 g/l, Narazeth cs (2019) [62] với MFC từ 125 đến 250 g/l 3.2.4 Ảnh hưởng vi khuẩn L plantarum NCDN4 đến tạo sinh khối nấm mốc Bảng 3-4 Khối lượng nấm mốc thu thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn đến sinh khối nấm mốc Aspergillus niger CBS 76997 Ngày theo dõi Mẫu KC (g) 0,1128 ± 0,007 0,2944 ± 0,0104 0,3772 ± 0,0240 Mẫu TN (g) 0,0554 ± 0,0082 0,1898 ± 0,0109 0,3376 ± 0,0062 Khối lượng giảm (%) 50,84 ± 6,61% 35,53 ± 5,96% 10,51 ± 5,02% Hình 3-20 Nấm mốc sau ngày nuôi cấy môi trường mMRS (Trái: mẫu kiểm chứng; Phải: mẫu thí nghiệm ni đối kháng) 65 Khi nuôi đồng thời nấm mốc vi khuẩn lactic môi trường lỏng, sinh khối nấm mốc bị ức chế đáng kể Cụ thể sau ngày nuôi cấy, khối lượng mẫu thí nghiệm cân giảm khoảng 50,84 ± 6,61% so với mẫu kiểm chứng Kết thu 35,53 ± 5,96% 10,51 ± 5,02% ngày thứ ngày thứ sau ni cấy Như thấy, sinh khối vi khuẩn lactic L plantarum NCDN4 có ảnh hưởng rõ ràng tới khả tạo sinh khối nấm A niger CBS 769997 Hiệu ức chế tốt thể 03 ngày đầu nuôi cấy sau giảm dần ngày ni cấy Với diện tế bào vi khuẩn L plantarum, trọng lượng khô sợi nấm Karunaratne cs (1990) xác định thấp so sánh với mẫu đối chứng sau 10 ngày nuôi cấy [46] Tương tự ảnh hưởng năm vi khuẩn axit lactic phân lập giai đoạn tăng trưởng khác bào tử sợi nấm A fumigatus nghiên cứu [42] Sự phát triển nấm môi trường MRS lỏng mơi trường ni cấy đồng thời, có vi khuẩn lactic thấp so với đối chứng tất mẫu, bào tử nấm cấy vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn axit lactic sau 24 ủ LAB có khả ức chế phát triển vi sinh vật cách tiêu thụ chất dinh dưỡng có sẵn nguồn dinh dưỡng cacbon nitơ, hạn chế chí làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng thiết yếu môi trường tăng trưởng Ngồi chất chuyển hóa vi sinh vật từ LAB, cạnh tranh chất dinh dưỡng liên quan đến việc ức chế phát triển nấm mốc Honore cs (2016) [52] đo mức tiêu thụ chất chuyển hóa ba chủng L paracasei tương quan với hoạt động ức chế nấm mốc Kết cho thấy, tiêu thụ glucose glutamine Lactobacilli tương quan nghịch với phát triển nấm mốc Tương tự vậy, chế cạnh tranh nguồn cacbon (cụ thể glucose, glycerol) được Toplaghaltsyan cs (2017) [53] nghiên cứu khả kháng nấm L rhamnosus R-2002 hai chủng Mucor plumbeus Penicillium aurantioviolaceum 3.2.5 Ảnh hưởng vi khuẩn lactic đến hình thái nấm mốc Vi khuẩn L plantarum NCDN4 dịch tế bào chúng có ảnh hưởng định tới hình thái nấm mốc Khi quan sát kính hiển vi mẫu thí nghiệm bổ sung đồng thời dịch tế bào sinh khối vi khuẩn, hình thái nấm mốc cho thấy có nhiều biến đổi so với mẫu kiểm chứng (Hình 3-21) Độ đậm đặc bào tử nấm mốc mẫu kiểm chứng dày thể rõ soi vật kính 40x Bên cạnh đó, nấm mốc số ngày tuổi mẫu kiểm chứng, bào tử phát triển mạnh mẽ, hình thành chuỗi bào tử dài mà mẫu thí nghiệm khơng có Về cuống bào tử, mẫu thí nghiệm cho phần cuống trơn, mịn so với mẫu thí nghiệm Cuống bào tử mẫu thí nghiệm có dấu hiệu bị tổn thương Với tượng quan sát trên, ta dự đoán dịch tế bào vi khuẩn lactic L plantarum NCDN4 có ảnh hưởng định đến hình thái nấm mốc A niger CBS 76997 Đây số chế giúp vi khuẩn lactic ức chế phát triển nấm mốc 66 A A B B B B Hình 3-21 Hình thái nấm mốc A niger CBS 76997 kính hiển vi (Hàng - Mẫu đối chứng; Hàng - mẫu thí nghiệm bổ sung 10% v/v dịch tế bào vi khuẩn L plantarum NCDN4 + 106 CFU/ml sinh khối vi khuẩn; A – Dưới vật kính 10x; B – Dưới vật kính 40x) Những thay đổi hình thái A flavus A parasiticus ngày tuổi tiếp xúc với dịch từ L plantarum K35 nồng độ MIC quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM) kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy kết tương tự cụ thể Quan sát SEM cho thấy sợi nấm A flavus A parasiticus không xử lý giữ ngun hình dạng ống hồn chỉnh với hình dạng bình thường cấu tạo dạng thùng thành tế bào nhẵn Sau tiếp xúc với 5,87 mg/mL dịch phía từ L plantarum K35, hình thái bất thường méo mó sợi nấm quan sát rõ ràng Các thành tế bào bị co lại nhăn nheo rõ rệt sợi nấm bị dẹt thấy rõ từ SEM [50] 3.3 Ứng dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm gạo lứt A – mẫu đối chứng âm - phun nước cất; B – mẫu phun đồng thời 340l dịch tế bào vi khuẩn + 106 CFU/ml sinh khối vi khuẩn L plantarum NCDN4; C - mẫu phun đồng thời 340l dịch tế bào vi khuẩn + 106 CFU/ml sinh khối vi khuẩn L plantarum NCDN4 + 106 bào tử/ml nấm mốc A niger CBS 76997; D – mẫu phun 106 bào tử/ml nấm mốc A niger CBS 76997 67 A B C D Hình 3-22 Hình ảnh nấm mốc gạo lứt sau ngày ủ nảy mầm Kết thí nghiệm cảm nhiễm chủ động nấm mốc trình nảy mầm gạo lứt xác định thông qua tỉ lệ phần trăm số hạt nảy mầm phần trăm số hạt bị nhiễm mốc 100.00 96.00 95.33 100.00 94.00 88.67 90.00 Tỉ lệ nảy nẩm (%) 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 24.00 15.67 20.00 7.00 10.00 0.00 Kiểm chứng (phun nước cất) Phun 340ul dịch Phun 340ul dịch 10^6 bào tử/mL nấm tế bào + 10^6 tế bào + 10^6 mốc A niger CBS CFU/mL L plantarum CFU/mL L plantarum 76997 NCDN4 NCDN4 + 10^6 bào tử/mL nấm mốc A niger CBS 76997 % số hạt nảy mầm % số hạt bị mốc Hình 3-23 Khả nảy mầm gạo lứt hiệu kháng nấm phun sinh khối vi khuẩn dịch tế bào 68 Ở ngày thứ ủ nảy mầm thứ 3, mẫu đối chứng âm – phun nước cất xuất nấm mốc, với độ dày đặc bào tử cao, sợi nấm dài, tỉ lệ nhiễm mốc 24,00 ± 9,17% Nấm mốc quan sát chủ yếu mốc màu xanh, loại nấm mốc thường gặp trình nảy mầm gạo Chiều dài mầm gạo khoảng 0,5 cm mẫu đối chứng Ở mẫu đối chứng dương - phun 106 bào tử/ml nấm mốc A niger CBS 76997, toàn hạt gạo lứt bị nhiễm mốc sau ngày ủ Nấm mốc A niger CBS 76997 phát triển mạnh, hầu hết nấm mốc xuất bào tử, tơ nấm dài Số hạt nảy mầm gạo lứt điều kiện giảm nhẹ 88,67 ± 1,53%, mầm hạt ngắn, gần nhú Ở mẫu phun đồng thời 340L dịch tế bào vi khuẩn + 106 CFU/ml sinh khối vi khuẩn L plantarum NCDN4, sau ngày ủ, nấm mốc A niger CBS 76997 nấm mốc xanh quan sát thấy gạo Tuy nhiên, so sánh với mẫu đối chứng âm, tỉ lệ chủng nấm mốc thấp Tỉ lệ nhiễm mốc A niger CBS 76997 giảm mạnh, 7,00 ± 3,00% Nấm mốc chưa có hình thành bào tử dày đặc, kích thước sợi nấm hạt ngắn Về chiều dài mầm gạo, mầm đạt kích thước khoảng 0,5 cm, tương đương với mẫu đối chứng Ở mẫu phun đồng thời 106 bào tử/ml nấm mốc A niger CBS 76997 + 340l dịch tế bào vi khuẩn + 106 CFU/ml vi khuẩn lactic, phát triển nấm mốc quan sát thấy sau ngày ủ quan sát trực quan thấy tỉ lệ số hạt mốc thấp nhiều so với mẫu đối chứng dương phun 106 bào tử/ml nấm mốc, 15,67 ± 4,73% Đồng thời, ức chế thời gian hình thành bào tử nấm mốc ghi nhận Chủ yếu hạt mẫu thí nghiệm xuất tơ nấm, số hạt bắt đầu hình thành bào tử Tỉ lệ số hạt nảy mầm 95,33 ± 1,15%, khơng có khác biệt so với nảy mầm thơng thường Chiều dài mầm gạo không thay đổi, khoảng 0,5 cm Như vậy, có mặt vi khuẩn lactic dịch tế bào thể khả ức chế tốt nấm mốc A niger CBS 76997 cảm nhiễm chủ động trình nảy mầm gạo lứt Tỉ lệ số hạt mốc giảm rõ rệt mà không ảnh hưởng lớn đến khả nảy mầm hạt Một số nghiên cứu trình bày khả ức chế phát triển nấm mốc tương tự cách sử dụng vi khuẩn lactic chất bảo quản sinh học ngũ cốc loại hạt khác Đậu nành Yang cs [63] sử dụng mô hình để nghiên cứu khả ứng dụng dịch tế bào vi khuẩn lactic để loại bỏ hư hỏng nấm cho kết tương tự Tác giả thử nghiệm khả kháng nấm mốc A flavus ATCC 22546 dịch tế bào vi khuẩn L plantarum AF1 cô đặc lần, lần, lần Kết cho thấy, nấm mốc A flavus ATCC 22546 nấm mốc thường xuất đậu tương quan sát thấy đậu nành đối chứng mẫu xử lí dịch tế bào vi khuẩn L plantarum AF1 cô đặc lần Tuy nhiên, ức chế tăng trưởng phần quan sát thấy đậu nành xử lý dịch tế bào vi khuẩn L plantarum AF1 cô đặc lần không quan sát thấy phát triển nấm mốc đậu nành xử lý dịch tế bào vi khuẩn L plantarum AF1 cô đặc lần A flavus không nảy mầm đậu nành xử lý dịch nuôi cấy cô đặc gấp lần, chí sau tuần [63] 69 Hoạt tính kháng nấm dịch tế bào vi khuẩn lalctic đánh giá hạt ớt giống Cili Kulai cho kết tương tự Hạt ớt bị nhiễm nấm có biểu giảm tỷ lệ nảy mầm từ 53,3 đến 70% sau hai tuần ủ nhiệt độ phòng 28 ± 2oC Tất hạt xử lý dịch tế bào vi khuẩn có tỷ lệ nảy mầm tốt từ 82,6 đến 93,3% so với hạt mẫu kiểm chứng Thậm chí, hạt ớt xử lí xen kẽ vi khuẩn lactic – dịch tế bào vi khuần cho thấy nảy mầm sớm so với hạt đối chứng hạt cảm nhiễm nấm mốc chủ động Việc sử dụng vi khuẩn L plantarum NCDN4 dịch tế bào q trình nảy mầm gạo lứt thể khả kháng nấm hiệu quả, ức chế mạnh phát triển nấm mốc Hơn nữa, kết nghiên cứu cho thấy khả nảy mầm hạt không bị ảnh hưởng so với q trình nảy mầm thơng thường Hạt sau nảy mầm đem sấy để thu thành phẩm hoàn chỉnh Như vậy, ứng dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm gạo lứt cho thấy tiềm sử dụng phương pháp bảo quản sinh học tương lai 70 CHƯƠNG KẾT LUẬN 4.1 Kết luận Nghiên cứu chứng minh dịch tế bào sinh khối chủng vi khuẩn lactic sử dụng thí nghiệm ức chế nấm mốc A niger CBS 76997 P oxalicum 20B Khi kết hợp 10% dịch tế bào 106 CFU/mL sinh khối vi khuẩn, ức chế hoàn toàn P oxalicum 20B ức chế đến 58,8% đường kính tản nấm ngày thứ 5, trì ngày chưa xuất bào tử nấm mốc với A niger CBS 76997 Bước đầu giải thích chế ức chế nấm mốc bao gồm: - Do vi khuẩn sản sinh lượng lớn axit hữu cơ, đặc biệt axit lactic 18,86 g/L sau 24h nuôi cấy - Do cạnh tranh dinh dưỡng: giảm 58% khối lượng nấm mốc sau ngày nuôi cấy đồng thời Ảnh hưởng đến trình tạo bào tử: làm chậm trình hình thành bào tử, giảm độ đậm đặc bào tử, gây tổn thương thành tế bào Nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng trình nảy nầm gạo lứt, giảm rõ rệt nấm mốc hình thành q trình ủ mà khơng ảnh hưởng đến khả nảy nầm hạt - 4.2 Hướng phát triển luận văn tương lai Nghiên cứu sâu chế kháng nấm mốc chủng vi khuẩn L plantarum NCDN4 (phân tích thêm thành phần hợp chất khác dịch tế bào vi khuẩn) Xây dựng quy trình cụ thể ứng dụng vi khuẩn lactic trình nảy mầm gạo lứt Tiến hành đánh giá chất lượng mầm đánh giá cảm quan quy mô lớn gạo thành phẩm sau ứng dụng so sánh với mẫu gạo nảy mầm thông thường 71 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] P T N V Bá, Giáo trình mơn Nấm học Trường Đại học Cần Thơ - Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, 2005 G T P T K GS.TS Nguyễn Thị Hiền (Chủ biên), TS Trương Thị Hòa, Th.S Lê Thị Lan Chi, Vi sinh vật nhiễm tạp lương thực - thực phẩm Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2009 H M Ánh (2022) Chế biến bảo quản nơng sản: Phải cải thiện trình độ lực công nghệ Available: congnghiepsinhhocvietnam.com.vn L T N D Đậu Ngọc Hào, Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi 2003 T T Y Tiên, "Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả ức chế nấm mốc sinh aflatoxin," Công nghệ sinh học, Trường đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh, 2017 C Shi and M Maktabdar, "Lactic Acid Bacteria as Biopreservation Against Spoilage Molds in Dairy Products – A Review," (in English), Review vol 12, 2022-January-26 2022 S Siedler, R Balti, and A R Neves, "Bioprotective mechanisms of lactic acid bacteria against fungal spoilage of food," Current Opinion in Biotechnology, vol 56, pp 138-146, 2019/04/01/ 2019 A NASROLLAHZADEH, M KHOMEIRI, A SADEGHI, M MAHMOUDI, and M J J O F H EBRAHIMI, "Antifungal activity of lactic acid bacteria isolated from Masske, camel dough, and local yogurt against Aspergillus flavus and Aspergillus niger," vol 9, no (36) #g001087, pp -, 2020 E Baek, H Kim, H Choi, S Yoon, and J J J o M Kim, "Antifungal activity of Leuconostoc citreum and Weissella confusa in rice cakes," vol 50, no 5, pp 842-848, 2012 J A Reis, A T Paula, S N Casarotti, and A L B Penna, "Lactic Acid Bacteria Antimicrobial Compounds: Characteristics and Applications," Food Engineering Reviews, vol 4, no 2, pp 124-140, 2012/06/01 2012 D Herting and E J C c Drury, "Antifungal activity of volatile fatty acids on grains," 1974 P Lavermicocca et al., "Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B," vol 66, no 9, pp 4084-4090, 2000 P Prema, D Smila, A Palavesam, and G Immanuel, "Production and Characterization of an Antifungal Compound (3-Phenyllactic Acid) Produced by Lactobacillus plantarum Strain," Food and Bioprocess Technology, vol 3, no 3, pp 379-386, 2010/06/01 2010 M Ouiddir et al., "Selection of Algerian lactic acid bacteria for use as antifungal bioprotective cultures and application in dairy and bakery products," Food Microbiology, vol 82, pp 160-170, 2019/09/01/ 2019 B A Black, E Zannini, J M Curtis, M G J A Gï¿ ½nzle, and E Microbiology, "Antifungal hydroxy fatty acids produced during 73 [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] sourdough fermentation: microbial and enzymatic pathways, and antifungal activity in bread," vol 79, no 6, pp 1866-1873, 2013 C Pohl, J Kock, V J S a m p c c r Thibane, and B technological advances Formatex Research Center, Spain, "Antifungal free fatty acids: a review, p 61–71," 2011 S Liu et al., "Biological control of phytopathogenic fungi by fatty acids," vol 166, no 2, pp 93-102, 2008 D Ndagano, T Lamoureux, C Dortu, S Vandermoten, and P Thonart, "Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria of the Weissella Genus Isolated from Food," Journal of food science, vol 76, pp M305-11, 07/05 2011 A Sadeghi, M Ebrahimi, S A Mortazavi, and A Abedfar, "Application of the selected antifungal LAB isolate as a protective starter culture in pan whole-wheat sourdough bread," Food Control, vol 95, pp 298-307, 2019/01/01/ 2019 S D Aunsbjerg et al., "Contribution of volatiles to the antifungal effect of Lactobacillus paracasei in defined medium and yogurt," International Journal of Food Microbiology, vol 194, pp 46-53, 2015/02/02/ 2015 H J Z B Lagoni, "Vergleichende Untersuchungen uber den mikrobiciden Effekt verschiedener Konservienungsmittel," vol 2, pp 225-231, 1941 M G Shehata, A N Badr, and S A J B R El Sohaimy, "Novel antifungal bacteriocin from Lactobacillus paracasei KC39 with antimycotoxigenic properties," vol 15, no 4, pp 4171-4183, 2018 B J Muhialdin et al., "Antifungal activity determination for the peptides generated by Lactobacillus plantarum TE10 against Aspergillus flavus in maize seeds," Food Control, vol 109, p 106898, 2020/03/01/ 2020 S Rouse, D Harnett, A Vaughan, and D v Sinderen, "Lactic acid bacteria with potential to eliminate fungal spoilage in foods," Journal of Applied Microbiology, https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03619.x vol 104, no 3, pp 915-923, 2008/03/01 2008 Y J T i b s Shai, "Molecular recognition between membrane-spanning polypeptides," vol 20, no 11, pp 460-464, 1995 M Venturini, D Blanco, and R J J o f p Oria, "In vitro antifungal activity of several antimicrobial compounds against Penicillium expansum," vol 65, no 5, pp 834-839, 2002 E Yang, Y.-S Kim, and H J J o f p Chang, "Purification and characterization of antifungal δ-dodecalactone from Lactobacillus plantarum AF1 isolated from kimchi," vol 74, no 4, pp 651-657, 2011 H Wang, Y Yan, J Wang, H Zhang, and W J P o Qi, "Production and characterization of antifungal compounds produced by Lactobacillus plantarum IMAU10014," vol 7, no 1, p e29452, 2012 A H Honoré et al., "Metabolic footprinting for investigation of antifungal properties of Lactobacillus paracasei," vol 408, no 1, pp 83-96, 2016 74 [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] A Toplaghaltsyan, I Bazukyan, and A J C m Trchounian, "The effects of different carbon sources on the antifungal activity by lactic acid bacteria," vol 74, no 2, pp 168-174, 2017 S Siedler et al., "Competitive Exclusion Is a Major Bioprotective Mechanism of Lactobacilli against Fungal Spoilage in Fermented Milk Products," vol 86, no 7, pp e02312-19, 2020 L A Matevosyan, I L Bazukyan, and A H J C M Trchounian, "Antifungal activity of lactic acid bacteria isolates and their associations: the effects of Ca and Mg divalent cations," vol 77, no 6, pp 959-966, 2020 L Ryan, F Bello, and E Arendt, "The use of sourdough fermented by antifungal LAB to reduce the amount of calcium propionate in bread," International journal of food microbiology, vol 125, pp 274-8, 05/01 2008 S J Sathe, N N Nawani, P K Dhakephalkar, and B P Kapadnis, "Antifungal lactic acid bacteria with potential to prolong shelf-life of fresh vegetables," Journal of Applied Microbiology, https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03525.x vol 103, no 6, pp 2622-2628, 2007/12/01 2007 T H X A PGS TS Trần Như Khun, "Giáo trình Cơng nghệ bảo quản chế biến lương thực," ed Nhà xuất Hà Nội: Sở Giáo dục đào tạo, 2007 T T H C Trần Thị Thu Hương, Hồng Đình Bằng, Lê Thị Trúc Phương, "NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT GẠO LỨT GIÀU GABA (GAMMA AMINOBUTYRIC ACID) TỪ CÁC GIỐNG LÚA: 0M 5451, OM 6979 VÀ OM 1532 NẢY MẦM," (in V), TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC VĂN HIẾN, 2017 X.-L Shu, T Frank, Q.-Y Shu, K.-H J J o a Engel, and f chemistry, "Metabolite profiling of germinating rice seeds," vol 56, no 24, pp 11612-11620, 2008 H Đ Nhân, "Nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất gạo mầm giàu γAminobutyric Acid (GABA) từ gạo lứt thảo dược Vĩnh Hịa ứng dụng cơng nghệ thực phẩm," Luận văn Thạc sĩ, Khoa Cơ khí – Cơng nghệ, Đại học Nông Lâm Huế, 2019 C Thị Tố Quỳnh, N Hoàng Dũng, and L Quốc Đạt, "NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT GẠO MẦM (GẠO GABA) TỪ GẠO LỨT VIỆT NAM," Vietnam Journal of Science and Technology, vol 51, no 1, p 63, 04/09 2017 A Husain, Z Hassan, N H Faujan, and M Lani, "Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Soil Rhizosphere on Fusarium Species Infected Chilli Seeds," vol 29, pp 182-202, 01/01 2017 Y I Hassan and L B Bullerman, "Antifungal activity of Lactobacillus paracasei ssp tolerans isolated from a sourdough bread culture," International Journal of Food Microbiology, vol 121, no 1, pp 112-115, 2008/01/15/ 2008 75 [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] J.-D Kim, "Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Against Aspergillus fumigatus," (in eng), Mycobiology, vol 33, no 4, pp 210-214, 2005 F Dal Bello et al., "Improvement of the quality and shelf life of wheat bread by fermentation with the antifungal strain Lactobacillus plantarum FST 1.7," Journal of Cereal Science, vol 45, no 3, pp 309-318, 2007/05/01/ 2007 P Russo, M P Arena, D Fiocco, V Capozzi, D Drider, and G Spano, "Lactobacillus plantarum with broad antifungal activity: A promising approach to increase safety and shelf-life of cereal-based products," (in eng), Int J Food Microbiol, vol 247, pp 48-54, Apr 17 2017 B Fernandez, A Vimont, É Desfossés-Foucault, M Daga, G Arora, and I Fliss, "Antifungal activity of lactic and propionic acid bacteria and their potential as protective culture in cottage cheese," Food Control, vol 78, pp 350-356, 2017/08/01/ 2017 A Karunaratne, E Wezenberg, and L B Bullerman, "Inhibition of Mold Growth and Aflatoxin Production by Lactobacillus spp1," Journal of Food Protection, vol 53, no 3, pp 230-236, 1990/03/01/ 1990 J Magnusson and J Schnürer, "Lactobacillus coryniformis subsp coryniformis Strain Si3 Produces a Broad-Spectrum Proteinaceous Antifungal Compound," Applied and environmental microbiology, vol 67, pp 1-5, 02/01 2001 C Mille‐Lindblom, H Fischer, and L J O J Tranvik, "Antagonism between bacteria and fungi: substrate competition and a possible tradeoff between fungal growth and tolerance towards bacteria," vol 113, no 2, pp 233-242, 2006 L V Souza et al., "Evaluation of antifungal activity of lactic acid bacteria against fungi in simulated cheese matrix," LWT, p 114773, 2023/04/18/ 2023 P Sangmanee and T Hongpattarakere, "Inhibitory of multiple antifungal components produced by Lactobacillus plantarum K35 on growth, aflatoxin production and ultrastructure alterations of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus," Food Control, vol 40, pp 224-233, 2014/06/01/ 2014 K Li, W Zhang, L.-Y Kwok, and B Menghe, "Screening of Lactobacillus plantarum with broad-spectrum antifungal activity and its application in preservation of golden-red apples," Czech Journal of Food Sciences, vol 38, pp 315-322, 10/30 2020 C L Gerez, M I Torino, G Rollán, and G F J F c de Valdez, "Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties," vol 20, no 2, pp 144-148, 2009 N J P S Paster, "A commercial scale study of the efficiency of propionic acid and calcium propionate as fungistats in poultry feed," vol 58, no 3, pp 572-576, 1979 S Dagnas, E Gauvry, B Onno, and J.-M Membré, "Quantifying Effect of Lactic, Acetic, and Propionic Acids on Growth of Molds Isolated from 76 [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] Spoilesd Bakery Products," Journal of Food Protection, vol 78, no 9, pp 1689-1698, 2015/09/01/ 2015 M Stratford, A Plumridge, G Nebe-von-Caron, and D B J I j o f m Archer, "Inhibition of spoilage mould conidia by acetic acid and sorbic acid involves different modes of action, requiring modification of the classical weak-acid theory," vol 136, no 1, pp 37-43, 2009 M Leyva Salas, J Mounier, F Valence, M Coton, A Thierry, and E Coton, "Antifungal Microbial Agents for Food Biopreservation—A Review," Microorganisms, vol 5, p 37, 07/08 2017 M Cabo, A F Braber, and P Koenraad, "Apparent Antifungal Activity of Several Lactic Acid Bacteria against Penicillium discolor Is Due to Acetic Acid in the Medium," Journal of food protection, vol 65, pp 1309-16, 09/01 2002 I J M Suzuki, "Isolation of lactic acid bacteria which suppress mold growth and show antifungal action," vol 46, pp 635-639, 1991 S Mieszkin et al., "Action mechanisms involved in the bioprotective effect of Lactobacillus harbinensis K.V9.3.1.Np against Yarrowia lipolytica in fermented milk," International Journal of Food Microbiology, vol 248, pp 47-55, 2017/05/02/ 2017 V Dopazo et al., "Potential application of lactic acid bacteria in the biopreservation of red grape from mycotoxigenic fungi," Journal of the Science of Food and Agriculture, https://doi.org/10.1002/jsfa.11422 vol 102, no 3, pp 898-907, 2022/02/01 2022 C Luz, L Rodriguez, R Romano, J Mañes, and G J I J o D T Meca, "A natural strategy to improve the shelf life of the loaf bread against toxigenic fungi: The employment of fermented whey powder," vol 73, no 1, pp 88-97, 2020 T d M Nazareth et al., "Potential application of lactic acid bacteria to reduce aflatoxin B1 and fumonisin B1 occurrence on corn kernels and corn ears," vol 12, no 1, p 21, 2019 E Yang and H J I j o f m Chang, "Purification of a new antifungal compound produced by Lactobacillus plantarum AF1 isolated from kimchi," vol 139, no 1-2, pp 56-63, 2010 77