Phân lập và nghiên cứu tạo chế phẩm nấm trichoderma có khả năng đối kháng với nấm corticium salmonicolorgây bệnh nấm hồngtrên cây cao su (hevea brasiliensis)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM NẤM TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM CORTICIUM SALMONICOLOR GÂY BỆNH NẤM HỒNG TRÊN CÂY CAO SU (HEVEA BRASILIENSIS) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Anh Dũng Bình Dương, 5/2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM NẤM TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM CORTICIUM SALMONICOLOR GÂY BỆNH NẤM HỒNG TRÊN CÂY CAO SU (HEVEA BRASILIENSIS) Mã số: Xác nhận đơn vị chủ trì đề tài (chữ ký, họ tên) Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ tên) Bình Dương, 5/2016 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây cao su có tên khoa học Hevea brasiliensis, có nguồn gốc từ Nam Mỹ Cây cao su người Pháp đưa vào Việt Nam năm 1878 không sống Năm 1892, 2.000 hạt cao su từ Indonesia nhập vào Việt Nam đến 1907 đánh dấu diện cao su Việt Nam [43] Trong 10 năm trở lại đây, viêc trồng cao su mang lại hiệu kinh tế cao Theo số liệu báo cáo Theo Báo cáo Bộ NN&PTNT ước tính xuất cao su Việt Nam năm 2013 đạt 1.078 nghìn với giá trị đạt 2,52 tỷ USD [42] Giá mủ cao su tăng nhanh thời gian gần thúc đẩy nhiều thành phần kinh tế tham gia trồng cao su Theo ước tính năm 2012, diện tích vườn cao su Việt Nam đạt 910.500 ha, tăng 108.900 (13,6%) so với năm 2011 Đây xem mức tăng cao thời kỳ từ năm 1975 đến Trong cao su trồng nhiều miền Đông Nam Bộ (46,4 %), chủ yếu Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh, Vũng Tàu [43],[44] Chính việc trồng cao su tràn lan với việc thiếu kĩ thuật khâu chăm sóc chọn giống dẫn đến nhiều dịch bệnh xuất vườn trồng cao su kể đến như: bệnh héo đen đầu (Thán thư / Anthracnose) nấm: Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc; bệnh phấn trắng (Powdery mildew) nấm Oidium hevea; bệnh rụng mùa mưa thối trái nấm Phytophthora botryosa Chee Phytophthora palmivora (Bult.); bệnh Vàng rụng (Đốm xương cá Corynespora leaf spot) nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei; bệnh nấm hồng (Pink disease) nấm Corticium salmonicolor Berk & Br.v.v…[45] Bê ̣nh nấ m hồ ng (Pink disease) cao su nấ m Corticium salmonicolor gây xem bệnh vô nguy hại Bê ̣nh làm lá khô, ru ̣ng, làm cu ̣t ngo ̣n nhe ̣ thì giảm lươ ̣ng mủ 20 – 30%, còn nă ̣ng thì 60 – 70% và thâ ̣m chí gây chế t Cách phòng trừ bê ̣nh thường dùng là thuố c có nguồ n gố c hóa ho ̣c có thể gây lờn thuố c và vô cùng đô ̣c ̣i với người và môi trường Việc sử dụng loại thuốc hóa học tràn lan không gây ảnh hưởng xấu tới môi trường sống, sức khỏe người tiêu dùng mà nguyên nhân tạo chủng nấm bệnh kháng thuốc [46] Sử dụng chủng nấm Trichoderma để kiểm soát loại nấm bệnh thực vật biện pháp an toàn hiệu Trichoderma tác nhân kiểm soát sinh học nhiều loại nấm gây bệnh trồng cao su Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia, Colletotrichum, Corticium… Qua nghiên cứu năm gần nấm Trichoderma tiêu diệt nấm bệnh theo chế: kí sinh, tiết kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng không gian sống [3],[14],[25],[33],[24],[17],[20] Xuấ t phát từ thực tế chúng đề xuất thực hiê ̣n đề tài “Phân lập nghiên cứu tạo chế phẩm nấm Trichoderma có khả đối kháng với nấ m Corticium salmonicolor gây bênh ̣ nấ m hồ ng cao su (Hevea brasiliensis)” nhằ m đóng góp mô ̣t biê ̣n pháp sinh ho ̣c phòng trừ tốt mô ̣t số bê ̣nh có nguyên nhân nấ m gây cao su tỉnh Bình Dương Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu khả phòng trị bệnh nấm hồng cao su nấm Corticium salmonicolor gây Nghiên cứu tạo chế phẩm bào tử nấm Trichoderma có khả phịng trị bện nấm hồng cao su Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lâ ̣p nấ m Corticium salmonicolor gây bê ̣nh nấ m hồ ng cao su Phân lâ ̣p chủng nấ m Trichoderma từ vườn cao su Khảo sát và tuyể n cho ̣n khả đố i kháng của các chủng nấm Trichoderma phân lập với nấ m Corticium salmonicolor gây bê ̣nh nấ m hồ ng cao su môi trường tha ̣ch điã phòng thí nghiê ̣m Nghiên cứu nguồ n chấ t thić h hơ ̣p cho viê ̣c thu nhâ ̣n bào tử nấ m Trichoderma Nghiên cứu mô ̣t số điề u kiê ̣n ảnh hưởng đế n khả sinh bào tử quá trin ̀ h ta ̣o chế phẩ m + Sự ảnh hưởng của tỉ lê ̣ chấ t lên khả ta ̣o bào tử +Sự ảnh hưởng của pH ban đầ u lên khả ta ̣o bào tử + Sự ảnh hưởng của đô ̣ ẩ m lên khả ta ̣o bào tử + Sự ảnh hưởng của nhiê ̣t đô ̣ lên khả sinh bào tử + Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấ y lên khả tạo bào tử Thử nghiê ̣m khả phòng tri ̣ nấ m hồ ng của chế phẩ m bào tử Trichoderma quy mô vườn thực nghiê ̣m + Sử du ̣ng nấ m Corticium salmonicolor gây bê ̣nh nấ m hồ ng để gây bê ̣nh nhân ta ̣o cao su + Thử nghiê ̣m khả kiể m soát của chế phẩ m nấm Trichoderma với nấ m Corticium salmonicolor gây bê ̣nh nấ m hồ ng cao su Chương 1: TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1 Tổng quan nấm Corticium salmonicolor 1.1.1 Phân loại [15] Nấm Corticium salmonicolor phân loại sau Giới : Fungi Ngành : Basidiomycota Lớp: Agaricales Bộ: Corticiales Họ: Corticiaceae Chi: Corticium Loài: Corticium salmonicolor 1.1.2 Đặc điểm hình thái Nấm Corticium salmonicolor mơ tả lần hai tác giả Berkeley Broome vào năm 1874 nên cịn có tên Corticium salmonicolor Berk & Broome Trên môi trường thạch đĩa sợi nấm màu trắng, vách ngăn, để lâu sợi nấm chuyển sang màu hồng kem Nấm C salmonicolor thuộc ngành nấm đảm nên quan sinh sản đảm đảm bào tử Bào tử đảm hình elip, khơng hình thành môi trường nuôi cấy thạch đĩa mà hình thành kí sinh đối tượng gây bệnh điều kiện tự nhiên [9],[16] A B A Khuẩn lạc [12]; B Ảnh vi thể [25] Hình 1.1 Khuẩn lạc vi thể nấm C salmonicolor 1.1.3 Khả gây bệnh nấm Corticium salmonicolor Nấm Corticium salmonicolor tác nhân gây bệnh nấm hồng nhiều đối tượng như: cacao, bạch đàn, cà phê, xoài, mít, cao su.v.v… Trong số kể Việt Nam đối tượng gây bệnh thường gặp nấm Corticium salmonicolor cao su Bốn giai đoạn gây bệnh nấm Corticium salmonicolor bao gồm: hình thành mạng (cobwebby), hình thành vỏ cứng (incrustation), hình thành mụn mủ màu kem ( creampy pustule), hình thành thể (fruit body) [30],[34],[35] + Giai đoạn - hình thành mạng: giai đoạn trình phát triển bệnh nấm hồng Ở giai đoạn sợi nấm phát triển vỏ giống mạng nhện màu trắng chủ + Giai đoạn - hình thành vỏ cứng: từ sợi nấm màu trắng phát triển mạnh thành chuyển từ màu trắng sang hồng với xuất mụn màu hồng chủ + Giai đoạn - mụn mủ màu kem: mụn mủ màu hồng tiếp tục phát triển chuyển thành màu kem Những mụn màu kem thường xuất dễ nhận thấy mặt cành bị bệnh + Giai đoạn - hình thành thể: mụn màu kem phát triển chuyển thành màu cam, thể nấm Những thể màu cam thường xuất thân, cành hay nhánh chết Từ thể hình thành đảm bào tử Quả bào tử phát tán nhờ gió để tiếp tục gây bệnh Mặc dù bệnh nấm hồng có giai đoạn phát triển quan sát giai đoạn hình thành vỏ cứng dễ thấy thường mơ tả nhiều giai đoạn mà sợi nấm có màu hồng đặc trưng giai đoạn gây hại mạnh nấm Giai đoạn Giai đoạn Giai đoạn Giai đoạn Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển bệnh nấm hồng [13] 1.1.4 Bệnh nấm hồng cao su Cùng với bê ̣nh phấ n trắ ng, bê ̣nh ru ̣ng lá mùa mưa, bê ̣nh vàng ru ̣ng lá…bê ̣nh nấ m hồ ng ( Corticium salmonicolor) cũng bệnh thường xuấ t hiê ̣n và gây ̣i khá phổ biế n cao su ở nước ta Bệnh thường gây ̣i ma ̣nh mùa mưa [47],[48] Bê ̣nh thường gây ̣i cho cao su từ 3-12 năm tuổ i (nă ̣ng nhấ t là giai đoa ̣n 4-8 năm tuổ i) Do ta ̣i vi ̣trí phân cành thường hứng và giữ la ̣i nhiề u bào tử nấ m bê ̣nh, đồ ng thời ta ̣i la ̣i có đô ̣ ẩ m cao giúp cho bào tử dễ nẩ y mầ m, nên bê ̣nh thường tấ n công ở vi ̣trí này (ở vi ̣trí này có vỏ đã hóa nâu và đường kính khoảng cm trở lên) [47],[48] Nế u bị gây hại nă ̣ng, bê ̣nh sẽ làm cho toàn bô ̣ lá phiá vết bê ̣nh chuyể n dầ n sang mầ u vàng, héo rũ và chế t khô kéo theo phầ n cành phía chỗ bi ̣ vết bê ̣nh bi ̣ chế t (phiá dưới chỗ bi ̣ bê ̣nh sẽ mo ̣c chồ i mới) gây hiê ̣n tươ ̣ng cu ̣t ngo ̣n Vết bệnh thường kéo dài lên phía khoảng m lây lan qua cành khác cao Khi nhiề u cành bi ̣ha ̣i có thể làm chế t cả gây khuyế t hoă ̣c làm mấ t đô ̣ đồ ng đề u của vườn Do ảnh hưởng rấ t lớn đế n sinh trưởng, phát triể n của và làm giảm sản lươ ̣ng mủ ở những vườn cho khai thác[47],[48] 1.2 Tổng quan nấm Trichoderma 1.2.1 Đặc điểm phân loại Năm 1801, Persoon ex Gray [19] xác định Trichoderma thuộc Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống : Trichoderma 1.2.2 Đặc điểm sinh thái nấm Trichoderma Trichoderma diện hầu hết tất loại đất Chúng tìm thấy khắp nơi trừ vĩ độ cực Nam cực Bắc[1],[4] Chúng diện với mật độ cao phát triển mạnh vùng rễ cây, số giống có khả phát triển rễ Những giống bổ sung vào đất hay hạt giống nhiều phương pháp Ngay chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển bề mặt rễ hay vỏ rễ tùy theo giống [6],[27] Hầu hết dòng Trichoderma hoại sinh, chúng phổ biến khu rừng nhiệt đới, rễ cây, đất, xác sinh vật chết, thực phẩm bị chua, ngũ cốc, hay ký sinh loại nấm khác Trichoderma tìm thấy thực vật không sống nội sinh với thực vật [30],[34] Trichoderma có phân bố rộng rãi, chúng tồn gỗ mục sống ký sinh loại nấm khác, chúng có khả sản xuất nhiều loại enzyme thủy phân [9],[18] Trichoderma cịn có khả cạnh tranh dinh dưỡng cao có số đặc tính sau: [4],[18],[34] - Sinh trưởng mạnh bào tử nảy mầm nhanh - Có khả sinh tổng hợp hệ enzyme phân giải cao - Khả tạo kháng sinh, chịu chất kháng sinh 1.2.3 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma Khuẩn ty Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển nhanh, mơi trường PGA, ban đầu Trichoderma có màu trắng, sinh bào tử chuyển sang xanh đậm, xanh vàng lục trắng Ở số lồi cịn có khả tiết số chất làm thạch môi trường PGA hóa vàng [2],[9],[18],[40] Khuẩn lạc mọc nhanh sau hình thành bào tử đính sau tuần ni cấy Bào tử đính có màu sắc khác tùy theo loại nấm Thơng thường có màu xanh đậm, xanh vàng lục trắng Bào tử mọc dày đặc chùm riêng lẽ Ở số loài, sợi nấm tiết chất làm cho môi trường bên có màu vàng, hay tiết mùi thơm mang tính đặc trưng [9] Đặc điểm bật nấm Trichoderma bào tử có màu xanh đặc trưng, số có màu trắng, màu vàng hay xám Chủ yếu hình cầu, hình elip oval, đa số bào tử trơn láng, kích thước khơng q 5µm [18],[40] Hầu hết giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào chế sinh sản vơ tính bào tử đính từ khuẩn ty Bào tử đính Trichoderma khối trịn mọc lên đầu cuối cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh) Mang bào tử trần bên khơng có vách ngăn, liên kết thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy [9],[18],[40] A B A Ảnh khuẩn lạc [49]; B ảnh vi thể [50] Hình 1.3 Khuẩn lạc vi thể nấm Trichoderma 1.2.4 Đặc điểm sinh lý nấm Trichoderma Mỗi dịng nấm Trichoderma khác có u cầu nhiệt độ độ ẩm khác Dãy nhiệt độ cho phát triển loài Trichoderma tương đối rộng, 0oC (cho lồi T polysporum) 40oC (cho lồi T koningii) [23],[28] Nhiệt độ khơng ảnh hưởng tăng trưởng loài Trichoderma mà cịn ảnh hưởng lên hoạt tính biến dưỡng chúng, đặc biệt tổng hợp loại kháng sinh bay enzyme[29],[37] Các loài nấm hệ gen Trichoderma chịu ảnh hưởng tích cực từ chất có tính acid Hầu hết lồi có pH tối ưu dãy 3,5 – 5,6 pH acid có ảnh hưởng tốt đến nảy mầm bào tử Trichoderma Thậm chí có lồi phát triển pH = 2,1 [39] Trichoderma phát triển pH nhỏ phát triển tốt đất kiềm có tập hợp lượng CO2 HCO3- [22] 1.2.5 Khả đối kháng nấm bệnh hại trồng nấm Trichoderma Trichoderma có khả đối kháng với nấm bệnh nhờ vào nhiều chế khác nhau, khái quát thành chế sau [3]: + Kháng sinh: Chúng tạo chất có hoạt tính tương tự “thuốc kháng sinh” có tác dụng kìm hãm tăng trưởng tác nhân gây bệnh + Cạnh tranh: Trichoderma sử dụng nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không gian sống) với sinh vật gây bệnh nguyên nhân khả Trichoderma “xâm chiếm” môi trường trước tác nhân không mong muốn đến + Ký sinh: Tức giết chết loài gây bệnh cách xâm nhập vào bên loài nấm gây hại tiết chất (enzyme) để phân hủy chúng Năm 1932, Weinding mô tả tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm bệnh gây bệnh đặt tên cho tượng “giao thoa sợi nấm” Hiện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn sau: (1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh (2) Sau vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy sợi nấm gây bệnh (3) Cuối sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng lớp tế bào nấm gây bệnh, làm cho chất nguyên sinh nấm gây bệnh bị phân hủy dẫn đến nấm bệnh bị chết Quan sát kính hiển vi, tượng ký sinh nấm Trichiderma mô tả sau: điểm nấm Trichoderma tiếp xúc với nấm bệnh làm cho nấm bệnh bị teo lại chết Ngược lại, điểm không tiếp xúc với nấm Trichoderma, nấm bệnh chết nhà nghiên cứu cho tác động chất kháng sinh tiết từ nấm Trichoderma sinh gây độc cho nấm bệnh Q trình gọi kí sinh nấm, Trichoderma tiết enzyme làm tan vách tế bào loài nấm khác Sau cơng vào bên lồi nấm gây hại tiêu thụ chúng [3],[18],[24] Ngồi chất độc chất trao đổi kháng sinh ra, Trichoderma cịn tiết nhiều enzyme khác exo endoglucanase, cellulase chitnase có khả phân hủy thành tế bào nấm bệnh Trichoderma số nấm mốc khác Gliocladium, Calvatia có khả sinh tổng hợp lượng enzyme chitinase cao Chitinase có chức phân hủy chitin Đây thành phần cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố quan trọng hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại loại nấm gây bệnh Hoạt động đối kháng Trichoderma mang tính phịng ngừa nhưỡng Viê ̣t Nam đă ̣c biê ̣t là vùng Đông Nam Bô ̣, nơi chuyên canh cao su lớn nhấ t nước ta KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận Đã phân lập 14 chủng nấm Trichoderma từ mẫu đất, mục, cành mục đống ủ phân vườn trồng cao su có bùng phát bệnh nấm hồng tỉnh Bình Dương Đã phân lập gửi định danh cách giải trình tự gen 28S rRNA tra cứu BLAST (NCBI) với kế t quả là trùng khớp với triǹ h tự 28S rRNA của chủng nấ m Corticium salmonicolor ML-BD-06 đế n 99% Tiến hành khảo sát khả đối kháng 14 chủng nấm Trichoderma với nấm C salmonicolor + Từ kết khảo sát khả đối kháng tuyển chọn chủng Tr11, Tr12, Tr13 có khả đối kháng mạnh với nấm C salmonicolor + Ba chủng Tr11, Tr12, Tr13 gửi mẫu để định danh lồi phương pháp giải trình tự rRNA 28S tra cứu BLAST (NCBI) Kết chủng Tr11, Tr12 và Tr13 có triǹ h tự 28S rRNA tương đồ ng với triǹ h tự 28S rRNA của chủng Trichoderma harzianum CKP01 Trong đó chủng Tr11 có tỉ lê ̣ tương đồ ng là 100% còn hai chủng Tr12 và Tr13 có tỉ lê ̣ tương đồ ng là 99% Nghiên cứu ta ̣o chế phẩ m nấ m Trichoderma + Cơ chất thích hợp kết hợp kế t hơ ̣p giữa cám gạo và xác mía với tỉ lệ : pH thích hợp với chủng Tr11 với hai chủng Tr12, Tr13 + Độ ẩm thích hợp 50% + Nhiệt độ thích hợp 30oC + Thời gian ni cấy thích hợp để thu bào tử ngày Thu nhận bào tử tiến hành tạo chế phẩm nấm Trichoderma phòng trị bệnh nấm hồng Bào tử sau thu nhận phối trộn với cám gạo để tạo chế phẩm bào tử với mật độ 109/g Thử nghiê ̣m khả phòng tri ̣ nấ m hồ ng của chế phẩ m bào tử Trichoderma quy mô vườn thực nghiê ̣m cho kết trị bệnh lên đến 82,22% khả phòng bệnh 100% Khuyến nghị Tiếp tục mở rộng nghiên cứu khảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma với nhiều đối tượng gây bệnh trồng Tiến hành ứng dụng nấm Trichoderma canh tác hữu Việt Nam nói chung Bình Dương nói riêng Tiến hành thương mại hóa sản phẩm nấm Trichoderma đối kháng nấm hồng cao su TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Văn Hợp, Nguyễn Liên Hoa, Đinh Thúy Hằng, Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Hoài Hà, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Nguyễn Văn Bắc, Hoàng Văn Vinh, 2012 Vi sinh vật học, phần 1, giới vi sinh vật NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội [2] Nguyễn Lân Dũng tác giả, 1979, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh tập 2,3, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội [3] Nguyễn Văn Đĩnh cs, 2007, Giáo trình biện pháp sinh học bảo vệ thực vật, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội [4] Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000.Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB Giáo Du ̣c [5] Trần Thu Hà Phạm Thị Thanh Hoài, 2012, Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng Sclerotium rolfsii điều kiện Invitro, tạp chí khoa học ĐH Huế tập 75A, số 6, trang 49 – 55 [6] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003, Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (tập 2) – Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học quốc gia TP HCM [7] Dương Minh, Lê Phước Thạnh Đào Thị Hồng Xuyến, 2010, Một số sản phẩm nghiên cứu từ nấm Trichoderma có triển vọng Đại học Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, trang 173-179 [8] Dương Minh, Phan Văn Phấn Lê Phước Thạnh, 2007 Khảo sát khả đối kháng chủng nấm Trichoderma spp có triển vọng nấm Corticium salmonicolor Berk & Broome gây bệnh mốc hồng điều kiện phịng thí nghiệm nhà lưới, Hội thảo quốc gia bệnh sinh học phân tử lần thứ sáu, Hội Sinh học Phân tử Bệnh lý Thực vật Việt Nam, nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh, trang 71-77 [9] Lương Đức Phẩm, 2011, Sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học nông nghiệp, NXB Giáo Dục Việt Nam [10] Trần Ánh Pha, Phan Thành Dũng, Nguyễn Ngọc Mai, Nguyễn Đôn Hiệu Vũ Thị Quỳnh Chi, 2008, Nghiên cứu thăm dò khả đối kháng nấm Trichoderma số nấm gây bệnh cao su phương pháp in vitro in vivo, Thông tin Khoa học – Công nghệ cao su thiên nhiên (số – 2008) – Viện nghiên cứu cao su Việt Nam, trang – 15 [11] Trần Thanh Thủy, 1999, Hướng dẫn thực hành vi sinh vật, NXBGD [12] Trần Linh Thước, 2006, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXBGD Tài liệu nước [13] Akrofi AY, Amoako-Atta I, Assuah M, Kumi-Asare E, 2014, Pink Disease Caused by Erythricium salmonicolor (Berk & Broome) Burdsall: An Epidemiological Assessment of its Potential Effect on Cocoa Production in Ghana, Journal of Plant Pathology and Microbiology 5: 215 [14] Anna-Elisabeth Jansen, 2005, Recommendations for the Common Code for the Coffee Community-Initiative Final Version, Recommendations Agrochemicals, trang 55 – 60 [15] Begoude BAD, Lahlali R, Friel D, Tondje PR, Jijakli MH, 2007, Response surface methodology study of the combined effects of temperature, pH, and aw on the growth rate of Trichoderma asperellum, Journal of Apply Microbiology, Vol.103, trang 845–854 [16] Berkeley, M.J.; Broome, C.E.,1874, Enumeration of the fungi of Ceylon Part II, Botanical Journal of the Linnean Society 14:29-141, trang 71 [17] Chen CH et al, 2012, Antagonism of Trichoderma harzianum ETS 323 on Botrytis cinerea mycelium in culture conditions, the american phytopathological society, Vol.102, trang 1054 – 1063 [18] Christian P Kubichek and Gary E Harman, 2002, Trichoderma and Gliocladium - Volume Basic biology, taxonomy and genetics, Taylor & Francis e-Library [19] Clipson N., Landy E., Otte M., 2001, European register of marine species: a check-list of the marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification, Collection Patrimoines Naturels,Vol 50, trang 15-19 [20] Dennis C, Wesbter J., 1971, Antagonistic properties of species-group of Trichoderma III Hyphal Interactions, Trans Br Mycol Soc, Vol 57, trang 363–369 [21] Eastburn DM, Butler EE., 1991, Effect of soil moisture and temperature on the saprophytic ability of Trichoderma harzianum, Mycologia, Vol 83(3), trang 257–263 [22] G C Papavizas, 1985, Trichoderma and Gliocladium: Biology, Ecology, and Potential for Biocontrol, Annual review of phytopathology Vol 23, trang 23 – 54 [23] G E Harman, 2000, Myths and Dogmas of Biocontrol Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzinum T-22, Journal of Plant disease, Volume 84, Number 4, trang 377-393 [24] Howell CR., 2003, Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts, Plant Diseases, Vol 87, trang 4–10 [24] Jacques Avelino, G Martijn ten Hoopen and Fabrice A J DeClerck (2011), Ecological Mechanisms for Pest and Disease Control in Coffee and Cacao, Agroecosystems of the Neotropics Trang 91 – 118 [26] Jülich, W., 1975, Studies in resupinate basidiomycetes – III, tạp chí Persoonia volume issue(3):291-305, trang 295 [27] Klein D, Eveleigh DE., 1998, Ecology of Trichoderma In: Kubicek CP, Harman GE, editors Trichoderma and Gliocaldium, vol Basic Biology, Taxonomy and Genetics, Taylor and Francis, trang 57–73 [28] Knudsen GR, Bin L., 1990, Effects of temperature, soil moisture, and wheat bran on growth of Trichoderma harzianum from alginate pellets, Amer Phytopathol Soc, Vol.80, trang 724–727 [29] K H Domsch, W Gams and Traute-Heidi Anderson, 1995, Compendium of Soil Fungi, Lubrecht & Cramer Ltd [30] Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero, Phan Thuy Hien, 2009, Cẩm nang chuẩn đoán bệnh Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu nông nghệp quốc tế Australia [31] Lee, S.S et al, 1993, Diseases In Acacia mangium , Growing and Utilization MPTS Monograph Series No Bangkok, Thailand, Winrock International and FAO, trang 203–223 [32] Robert A Samson, Ellen S Hoekstra, Jems C Frivad, Ole Filtenborg, 2004, Introduction Food – Borne Fungi, CBS, Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences [33] Ram Ved, Sharma I M., 2010, Isolation, identification and evaluation of potential biocontrol agents against major cankers in apple, journal of biological control, volume 24, issue 4, trang 343 – 348 [34] Samuels GJ, 1996, Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus, Mycol Res 100, trang 923–935 [35] Seth, S.K., Bakshi, B.K., Reddy, M.A.R and Sujan Singh, 1978, Pink disease of Eucalyptus in India, European Journal of Forest Pathology 8- issue 4, pages 200 – 216 [36] Sharples A.,1936, Diseases and pests of the rubber tree Macillan & Co Ltd, London, trang 267-277 [37] Tronsmo A, Dennis C., 1978, Effect of temperature on antagonistic properties of Trichoderma species, Trans Brit Mycol Soc 71(3), trang 469–474 [38] Ram Ved, Sharma I M., 2010, Isolation, identification and evaluation of potential biocontrol agents against major cankers in apple, journal of biological control, volume 24, issue 4, trang 343 – 348 [39] R M Danielson and C.B Davey, 1973, The abundance of Trichoderma propagules and the distribution of species in forest soils, Soil Biology and Biochemistry Volume 5, Issue 5, Published by Elsevier Ltd, trang 485-494 [40] Robert A Samson, Ellen S Hoekstra, Jems C Frivad, Ole Filtenborg, 2004, Introduction Food – Borne Fungi, CBS, Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences Tài liệu từ internet [41].http://caosu.net/content/index.php?option=com_content&view=article&id=1026:t inh-hinh-sn-xut-cao-su-thien-nhien-vit-nam-nm-2012&catid=82:sn-xut-kinh doanh&Itemid=459 [42] http://thitruongcaosu.net/2013/12/26/thang-12-xuat-khau-cao-su-cua-viet-nam- uoc-dat-126-nghin-tan-gia-tri-309-trieu-usd/ [43].http://caosu.net/content/index.php?option=com_content&view=article&id=1026:t inh-hinh-sn-xut-cao-su-thien-nhien-vit-nam-nm-2012&catid=82:sn-xut-kinhdoanh&Itemid=459 [44] http://www.cesti.gov.vn/th-gi-i-d-li-u/phat-tri-n-cay-cao-su-vi-t-nam.html [45] http://www.spchcmc.vn/vn/TTNN/ZWOTKR032438/PDFILR081311/ [46] http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/45/45/111376/Benh-nam-hong-hai-cay- cao-su-va-cach-phong-tri.aspx [47] http://www.bvtvhcm.gov.vn/handbook.php?id=17&cid=1 [48] http://www.baobinhphuoc.com.vn/Content/chu-dong-phong-benh-nam-hong- tren-cay-cao-su-29474 [49] http://trongraulamvuon.com/tag/nam-trichoderma/ [50] http://www.chungvisinh.com/trichoderma-virens-nbrc-6355/ [51].http://www.thuvienbinhduong.org.vn/?ArticleId=ee9518b8-fa6c-407f-bb4af14040cb9562 [52] http://www.khuyennongvn.gov.vn/vi-VN/khoa-hoc-cong-nghe/khcn-trong nuoc/phong-tru-sau-benh-hai-trong-tai-canh-cay-ca-phe-voi_t114c40n8014 [53] http://nbco.com.vn/san-pham-17/THUOC-TRU-BENH-BIOBUS-1.00WP.html PHỤ LỤC Ảnh vi thể chủng nấm Trichoderma (độ phóng đại 40X) Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 Tr13 Tr14 Ảnh đối kháng nấm Trichoderma với nấm Corticium salmonicolor 2.1 Nghiệm thức ngày Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 Tr13 Tr14 Đối chứng Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 2.2 Nghiệm thức ngày Tr14 Đối chứng Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 Tr13 2.3 Nghiệm thức ngày Tr13 Đối chứng Tr14 Bảng thống kê khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm C salmonocolor 3.1 Bảng số liệu dtt hiệu suất đối kháng sau ngày Nghiêm ̣ thức đố i kháng Chủng (dtt, cm) 1.1 1.65 1.4 Tri1 1.5 1.35 1.6 Tr2 1.5 1.4 1.6 Tr3 1.2 1.1 Tr4 1.2 1.35 1.2 Tr5 1.4 1.24 Tr6 1.3 1.5 1.45 Tr7 1.13 1.3 1.4 Tr8 1.41 1.3 1.45 Tr9 1.52 1.3 1.6 Tr10 0.9 Tr11 0.7 1 Tr12 0.8 Tr13 1.2 1.41 1.5 Tr14 2.1 Đối chứng 2.35 2.2 dtt Trung bin ̀ h H% Lầ n H% lầ n H% lầ n H% Trung bình 1.38 ± 0.28 1.48 ± 0.13 1.5 ± 0.1 1.1 ± 0.1 1.25 ± 0.09 1.21± 0.2 1.42± 0.1 1.28 ± 0.14 1.39 ± 0.08 1.47 ± 0.16 0.97 ± 0.06 0.9 ± 0.17 0.93 ± 0.12 1.37 ± 0.15 2.22 ± 0.13 50.91 32.73 32.73 46.36 46.36 37.27 41.82 49.55 36.82 31.82 55.45 69.09 55.45 46.36 25.91 39.55 37.27 55.45 39.55 55.45 32.73 41.82 41.82 41.82 60 55.45 64.55 36.82 37.27 28.18 28.18 50.91 46.36 44.55 35 37.27 35 28.18 55.45 55.45 55.45 32.73 38.03 ± 12.52 33.49 ± 5.72 32.73 ± 4.55 50.91 ± 4.55 44.09 ± 3.93 45.76 ± 9.15 36.52 ± 4.73 42.88 ± 6.21 37.88 ± 3.53 33.94 ± 7.06 56.97 ± 2.63 60 ± 7.88 58.48 ± 5.25 38.64 ± 6.99 3.2 Bảng số liệu dtt hiệu suất đối kháng sau ngày Chủng Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 Tr13 Tr14 Nghiêm ̣ thức đố i kháng (dtt, cm) 1.2 1.7 1.6 1.62 1.45 1.7 1.8 1.81 1.9 1.3 1.2 1.2 1.3 1.45 1.4 1.5 1.2 1.3 1.4 1.51 1.5 1.3 1.4 1.5 1.5 1.4 1.45 1.6 1.4 1.7 1.1 0.9 1.1 0.7 1 0.9 1.5 1.5 1.6 dtt Trung bin ̀ h H% Lầ n H% lầ n H% lầ n H% Trung bình 1.5 ± 0.26 1.59 ± 0.13 1.84 ± 0.06 1.23 ± 0.06 1.38 ± 0.08 1.33 ± 0.15 1.47 ± 0.06 1.4 ± 0.1 1.45 ± 0.05 1.57 ± 0.15 1.03 ± 0.11 0.9 ± 0.17 0.97 ± 0.06 1.53 ± 0.06 57.89 43.16 36.84 54.39 54.39 47.37 50.88 54.39 47.37 43.86 61.4 75.44 64.91 47.37 40.35 49.12 36.49 57.89 49.12 57.89 47.02 50.88 50.88 50.88 68.42 64.91 68.42 47.37 43.86 40.35 33.33 57.89 50.88 54.39 47.37 47.37 49.12 40.35 61.4 64.91 64.91 43.86 47.37 ± 9.28 44.21 ± 4.48 35.55 ± 1.93 56.72 ± 2.02 51.46 ± 2.68 53.22 ± 5.36 48.42 ± 2.13 50.88 ± 3.51 49.12 ± 1.76 45.03 ± 5.36 63.74 ± 4.05 68.42 ± 6.08 66.08 ± 2.03 46.2 ± 2.03 Đối chứng 2.9 2.8 2.85 2.85 ± 0.05 0 0 3.4 Bảng số liệu dtt hiệu suất đối kháng sau ngày Chủng Tri1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 Tr13 Tr14 Đối chứng Nghiêm ̣ thức đố i kháng (dtt, cm) 0 0 0 2.1 2.3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4.5 4.8 dtt Trung bin ̀ h H% Lầ n H% lầ n H% lầ n H% Trung bình 0 2.13 ± 0.15 0 0 0 0 0 4.77 ± 0.25 100 100 55.97 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 58.07 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 51.78 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 55.27 ± 3.2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Nghiên cứu tạo chế phẩm 4.1 Bảng số liệu thí nghiệm thành phần chất 4.1.1 Chủng Tr11 Cám mì (CM) Cám ga ̣o (CG) Bã khoai mì (BKM) Cơ chất Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Trấ u (T) 105 105 105 106 105 106 105 104 105 Mu ̣n xơ dừa (M) 106 105 106 107 107 107 105 105 105 Xác mía (X) 106 106 106 107 107 107 106 106 106 4.1.2 Chủng Tr12 Cơ chất Cám mì (CM) Cám ga ̣o (CG) Bã khoai mì (BKM) Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Trấ u (T) 105 105 105 106 106 106 105 104 105 Mu ̣n xơ dừa (M) 106 105 106 107 107 107 106 105 105 Xác mía (X) 106 106 106 107 107 107 106 106 106 4.1.3 Chủng Tr13 Cơ chất Cám mì (CM) Cám ga ̣o (CG) Bã khoai mì (BKM) Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Lầ n Trấ u (T) 105 105 105 106 105 106 105 104 104 Mu ̣n xơ dừa (M) 106 105 105 107 107 107 105 105 105 Xác mía (X) 106 106 106 107 107 107 106 106 106 4.2 Bảng số liệu thí nghiệm tỉ lệ chất Chủng Tỉ lê ̣ giữa chấ t ta ̣o xố p (X) và chấ t dinh dưỡng (CG) 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5 4 10 10 10 10 107 Tr11 104 4.105 106 107 107 104 105 106 107 107 104 105 106 107 107 Tr12 105 105 107 107 107 103 105 107 108 108 104 104 106 107 107 Tr13 10 10 10 10 107 104 105 106 107 107 4.3 Bảng số liệu ảnh hưởng của pH ban đầ u Chủng Ảnh hưởng của pH 4 10 10 10 106 Tr11 104 4.105 108 106 104 105 108 107 104 105 106 108 Tr12 105 105 107 107 104 105 107 108 104 104 107 108 Tr13 104 104 106 108 2.105 104 106 108 4.4 Bảng ảnh hưởng độ ẩm môi trường nuôi cấy Chủng Đô ̣ ẩ m của môi trường 40% 50% 60% 70% 106 108 105 104 Tr11 106 108 105 103 106 108 105 104 106 108 105 103 Tr12 107 108 105 103 106 108 105 104 106 108 104 103 Tr13 106 108 105 103 106 108 105 104 4.5 Bảng số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của nhiêṭ đô ̣ Chủng Nhiêṭ đô ̣ 25 30 35 40 10 10 10 105 Tr11 105 108 106 105 104 104 104 105 106 106 105 106 2.105 80% 102 102 102 102 102 50 105 105 Tr12 Tr13 106 106 106 106 106 106 106 108 108 108 108 108 108 108 106 105 105 105 104 105 105 105 105 105 105 102 102 102 105 105 104 105 105 104 105 4.6 Bảng thống kê số liệu thí nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Chủng Thời gian nuôi cấ y ngày ngày ngày ngày 11 ngày 104 108 109 109 109 Tr11 105 108 109 109 109 105 108 109 109 109 105 108 109 109 109 Tr12 105 108 109 109 109 9 10 10 10 10 109 105 108 109 109 109 Tr13 105 108 109 109 109 105 108 109 109 109