(Luận văn) đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế thu thập tại tỉnh yên bái

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - lu an n va HỒNG THỊ TRỊN tn to ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN p ie gh Tên đề tài: d oa nl w NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI TỈNH YÊN BÁI lu nf va an KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC z at nh oi lm ul Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học : CNSH - CNTP @ : 2011 - 2015 m co l gm Khóa học z Khoa an Lu Thái Nguyên - 2015 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - lu an HỒNG THỊ TRỊN n va tn to Tên đề tài: ie gh ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN p NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI TỈNH YÊN BÁI oa nl w d KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC nf va an lu : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP z at nh oi lm ul Hệ đào tạo Khóa học : 2011 - 2015 z Giảng viên hƣớng dẫn : TS Phí Quyết Tiến m co l gm @ TS Trần Văn Chí an Lu Thái Nguyên - 2015 n va ac th si i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu này, tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy cán khoa học Phịng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Với lịng biết ơn sâu sắc tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Phí Quyết Tiến - Trưởng phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ lu sinh học, người hướng dẫn cách tiếp cận vấn đề suốt trình an thực đề tài va n Đồng thời gửi lời cảm ơn ThS Vũ Hạnh Nguyên, ThS Quách gh tn to Ngọc Tùng cán Phịng Cơng nghệ lên men, người tận tình ie bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt q trình thực tập tốt nghiệp p Tơi xin gửi lời cảm ơn thầy giáo TS Trần Văn Chí thầy nl w cô giáo Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, d oa thầy cô, cán trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên giúp đỡ trang nf va nghiên cứu an lu bị kiến thức hữu ích đồng hành suốt thời gian học tập lm ul Cuối cùng, xin gửi lời tri ân tới gia đình, bạn bè, người giúp z at nh oi đỡ động viên tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực tập Thái Nguyên, ngày 25 tháng năm 2014 z co l gm @ Sinh viên m Hoàng Thị Tròn an Lu n va ac th si ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 11 Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 24 Bảng 4.1: Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 26 Bảng 4.2: Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS khả sinh lu an anthracyline 36 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 31 va n Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái chủng YBQ75 môi trường nuôi cấy tn to khác 34 ie gh Bảng 4.4: Khả đồng hóa nguồn cacbon, nitơ chủng YBQ75 sau 7-10 p ngày nuôi cấy 30ºC 36 nl w Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng d oa chủng YBQ75 37 an lu Bảng 4.6: Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ nf va khuẩn YBQ75 40 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Ảnh qt hiển vi điện tử bề mặt dưa chuột sau ngày gây nhiễm với Streptomyces sp MBCu-56 (A) Hệ sợi bề mặt (B) Hệ sợi xạ khuẩn xâm nhập phát triển trên, bề mặt lớp biểu bì Hình 4.1: Hoạt tính kháng P vulgaris (A), S epidermidis ATTC 12228 (B) số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 28 Hình 4.2: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I số chủng lu xạ khuẩn đại diện 29 an va Hình 4.3: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II số chủng n xạ khuẩn đại diện 29 gh tn to Hình 4.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps số chủng xạ p ie khuẩn đại diện 30 Hình 4.5: Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường chủng YB50 YB80 oa nl w thời điểm trước (A, C) sau (B, D) thử phản ứng màu d Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc (A) mơi trường ISP2 hình ảnh bề mặt an lu 20.000 lần (C) chủng YBQ75 35 nf va Hình 4.7: Điện di đồ sản phẩm PCR gel agarose 1,0% 38 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Tên đầy đủ Từ viết tắt rDNA ADN ribosome Bp Cặp bazơ (base pair) DNR Daunorubicin DNA Deoxyribonucleic acid DOX Doxorubicin EPI Epirubicin IDA Idarumycin KTCC Khuẩn ty chất ie KTKS Khuẩn ty khí sinh lu an n va gh tn to p Kilo bazơ Kb nl w 10 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 12 PCR 13 PKS-II 14 PKS-I 15 VSV d oa 11 nf va an lu Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) lm ul Polyketide synthase II z at nh oi Polyketide synthases I Vi sinh vật z m co l gm @ an Lu n va ac th si v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật lu 2.1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh mối tương tác xạ khuẩn với chủ an 2.1.2 Đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn va n 2.1.3 Tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh gh tn to 2.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh số gen ie chức liên quan 11 p 2.2.1 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh 11 oa nl w 2.2.2 Một số gen chức liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh 12 2.2.3 Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 13 d an lu 2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 14 nf va 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 lm ul 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 z at nh oi 2.4 Cây quế tiềm khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh quế 17 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 z 3.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 18 gm @ 3.1.2 Hóa chất 18 l co 3.1.3 Thiết bị 18 m 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 19 an Lu 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 19 n va ac th si vi 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật 20 3.4.2 Xác định khả sinh anthracyline 21 3.4.3 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS xạ khuẩn 21 3.4.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 22 3.4.5 Phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 24 lu PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 an 4.1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật 26 va n 4.2 Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS tham gia sinh tổng hợp gh tn to kháng sinh 28 ie 4.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc nhóm anthraycycline 33 p 4.4 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 33 nl w 4.4.1 Đặc điểm hình thái bề mặt chuỗi bào tử xạ khuẩn YBQ75 34 d oa 4.4.2 Đặc điểm sinh hóa xạ khuẩn YBQ75 35 an lu 4.4.3 Khuếch đại phân tích trình tự gen 16S rDNA xạ khuẩn YBQ75 nf va 38 lm ul PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 z at nh oi 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 z m co l gm @ PHỤ LỤC an Lu n va ac th si PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi khuẩn gây bệnh có khả kháng thuốc vấn đề vô nghiêm trọng mối quan tâm lớn cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu, lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ưu tiên hàng đầu nhà khoa học công ty dược phẩm giới Để đáp ứng nhu cầu tại, nhà khoa học không ngừng tìm kiếm nguồn phân lập lu nhằm thu nhận hợp chất tự nhiên để phát triển, bào chế loại an kháng sinh chống lại bệnh vi sinh vật gây va n Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật nguồn tự nhiên quan trọng gh tn to điều trị bệnh gây vi sinh vật Một số loài thực vật ie sử dụng phổ biến quế tinh dầu quế Cây quế (Cinamomum p loureirii) chứa dược chất tinh dầu lá, vỏ với 90% oa nl w cinnamaldehyde có hoạt tính kháng khuẩn cao vi khuẩn Gram (+) vi khuẩn Gram (-) (Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Enterobacter) d an lu Các nghiên cứu chứng minh tinh dầu quế có tính chất chống nf va đau, co mạch, làm tăng tiết, tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu lm ul 55,94 66,9% dùng nồng độ 100 200 ppm [2] Ngoài số z at nh oi hoạt chất eugenol, cinnamaldehyde, carvacrol tinh dầu quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh như: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae Ngoài giá trị dược lý thành phần z mang lại, quế cịn mơi trường sinh trưởng xạ khuẩn nội sinh Xạ gm @ khuẩn nội cộng sinh xạ khuẩn từ vùng rễ xâm nhập vào rễ, thân, l co mà không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với chủ [24] Các hợp chất m có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội cộng sinh chứng minh đa an Lu n va ac th si dạng mặt số lượng hoạt tính sinh học như: chất kháng sinh, kháng ung thư, chống oxy hóa, chất diệt cỏ [19] Polyketide nhóm chất đại diện cho sản phẩm trao đổi chất bậc hai sản xuất vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn thực vật [38] Trong đó, polyketide synthase II (PKS-II) tham gia tổng hợp cấu trúc chuỗi polyketide polyketide synthase I (PKS-I) chịu trách nhiệm tạo khung polyketide hoàn chỉnh Và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất bậc hai không thơng qua ribosome tạo dạng lu peptide nhờ q trình tổng hợp protein acid amin an Cho đến nay, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh va n quế nói riêng dược liệu nói chung cịn hạn chế Đồng thời, gh tn to nghiên cứu gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS nhằm sàng lọc, đánh ie giá khả sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp từ xạ khuẩn nội cộng sinh p Việt Nam bỏ ngỏ Xuất phát từ định hướng trên, oa nl w thực nghiên cứu đề tài: "Đánh giá khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh quế thu thập tỉnh Yên Bái" d an lu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu nf va Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định xác định có mặt lm ul gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh chủng xạ khuẩn nội 1.3 Ý nghĩa đề tài * Ý nghĩa khoa học z at nh oi công sinh phân lập quế tỉnh Yên Bái z Đề tài kế thừa kết số nghiên cứu trước nhóm nghiên @ l gm cứu, kế thừa kết nghiên cứu nước lĩnh vực khai co thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung thư m Đề tài chọn đối tượng thực vật nghiên cứu quế nhiều an Lu nghiên cứu trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu n va ac th si 37 L-Histidine monohydrate, L-Valin, L-Lysin, amino hydroxy-methyl 1,3 promo 4.4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn YBQ75 Sinh trưởng chủng YBQ75 mơi trường Bennett điều kiện thí nghiệm thay đổi nồng độ muối, pH nhiệt độ thể bảng 4.5 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng lu chủng YBQ75 an n va Khả sinh trƣởng 15 – 40 Sinh trƣởng tối ƣu 30 Nồng độ muối (%) 0–5 pH ban đầu – 10 p ie gh tn to Điều kiện sinh trƣởng Nhiệt độ (oC) Bảng 4.5 cho thấy, chủng YBQ75 sinh trưởng tốt dải nhiệt độ từ oa nl w 15-40ºC tối thích 30ºC Có thể kết luận chủng thuộc nhóm ưa ấm d kết phù hợp với nguồn gốc phân lập mẫu (tỉnh n Bái) an lu Trong mơi trường có nồng độ muối cao, xảy tượng nước nf va tế bào làm thay đổi khả trao đổi chất tế bào, ức chế khả lm ul sinh trưởng hay tổng hợp sản phẩm trao đổi chất xạ khuẩn Chủng nồng độ 2% z at nh oi YBQ75 sinh trưởng tốt dải nồng độ muối từ – 5% phát tiển tối thích Chủng YBQ75 cịn phát triển mơi trường có dải pH từ 5-10, z gm @ phát triển tốt pH Điều phù hợp với nghiên cứu trước cho xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật phát triển tốt mơi trường l co trung tính Các giá trị pH cần cho sinh trưởng sinh sản tương ứng với m giá trị pH cần cho hoạt động nhiều enzyme, biến đổi dù nhỏ an Lu nồng độ ion H+ OH- ảnh hưởng mạnh đến vi sinh vật Do việc n va ac th si 38 xác định pH thích hợp ban đầu việc trì pH cần thiết thời gian sinh trưởng vi sinh vật cần thiết Ảnh hưởng pH lên trình hoạt động vi sinh vật kết tác động qua lại ion H+ enzyme nội bào Đây đặc điểm có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng xạ khuẩn lên men thu nhận hợp chất có hoạt tính kháng sinh, kháng u Đối chiếu đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa vào khóa định tên lồi xạ khuẩn Nomomura 1976 Gause 1983 cho thấy lu YBQ75 thuộc chi Streptomyces an 4.4.3 Khuếch đại phân tích trình tự gen 16S rDNA xạ khuẩn va n YBQ75 Để phân loại chủng YBQ75 đến lồi, nghiên cứu giải phân tích trình ie gh tn to 4.4.3.1 Khuếch đại gen 16S rDNA p tự 16S rDNA thực DNA tổng số chủng xạ khuẩn YBQ75 nl w (Phụ lục 2) sử dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại d oa gen 16S rDNA, kết thể hình 4.7 nf va an lu (Thermo scientific, Mỹ); Băng 1: z at nh oi lm ul Băng M: thang DNA chuẩn Đối chứng âm; Băng 2: Sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA z m co l gm @ gen chủng YBQ75 an Lu Hình 4.7: Điện di đồ sản phẩm PCR gel agarose 1,0% n va ac th si 39 Kết khuếch đại gen 16S rDNA chủng YBQ75 cho thấy, sản phẩm PCR cho băng rõ nét có kích thước khoảng 1,4kb (Hình 4.7) Như vậy, sản phẩm PCR thu thí nghiệm đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh giải trình tự gen 16S rDNA 4.4.3.2 Phân tích trình tự gen 16S rDNA Trình tự gen 16S rDNA chủng YBQ75 nhận từ nghiên cứu trình bày (phụ lục 4) Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng xạ khuẩn trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6: Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA lu an n va tn to chủng xạ khuẩn YBQ75 Trình tự gen 16S rDNA chủng xạ Mã số truy cập khuẩn đƣợc so sánh GenBank Streptomyces cavourensis NRRL 2740 NR 043851.1 NR 112345.1 100 NR 041144.1 99 NR 074561.1 99 ie gh Streptomyces cavourensis NBRC 13026 p Streptomyces albolongus NBRC 13465 oa nl w Streptomyces sp SirexAA-E Độ tƣơng đồng (%) 100 d Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA so sánh với trình tự gen lu nf va an công bố Genbank công cụ BLAST (NCBI) cho thấy: gen 16S rDNA chủng YBQ75 có độ tương đồng cao (100%) so với gen tương ứng rDNA lm ul chủng Streptomyces cavourensis (Bảng 4.6) Dựa vào kết nghiên cứu z at nh oi đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn YBQ75 định danh Streptomyces cavourensis YBQ75 Theo công bố trước đây, loài Streptomyces cavourensis phát z gm @ lần vào năm 1978, nhóm xạ khuẩn phổ biến tự nhiên, l thường phân lập từ đất vùng rễ loại thực vật hay mơi trường nước m co Ngồi ra, chủng xạ khuẩn cịn có khả sinh chromomycin, vi khuẩn nấm, ung thư [42] an Lu flavensomycin-loại kháng sinh sử dụng rộng rãi điều trị bệnh gây n va ac th si 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã đánh giá khả kháng VSV kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh quế Từ đó, tuyển chọn 36 chủng xạ khuẩn có khả kháng loại VSV số loại VSV kiểm định - Đã xác định có mặt gen pks-I, pks-II, nrps tham gia sinh lu tổng hợp kháng sinh 36 chủng xạ khuẩn tuyển chọn Trong đó, chủng an n va mang gen pks-I (chiếm 25%), 19 chủng mang gen pks-II (chiếm 52,8%), 13 tn to chủng xuất gen nrps (chiếm 36,1%); 04 chủng xạ khuẩn ký hiệu: YBQ59, YBQ63, YBQ75, YBQ94 mang ba gen mã hóa PKS-I, PKS-II, gh p ie NRPS w - Đã xác định 30 chủng tổng số 36 xạ khuẩn nghiên cứu có oa nl khả sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyline d - Chủng YBQ75 có khả sinh kháng sinh phổ rộng, hoạt tính cao an lu phân loại thuộc lồi Streptomyces cavourensis dựa phân tích đặc nf va điểm sinh học trình tự gen 16S rDNA Do đó, chủng YBQ75 định z at nh oi 5.2 Kiến nghị lm ul danh Streptomyces cavourensis YBQ75 Tiếp tục nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men nhằm thu nhận kháng sinh chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 z m co l gm @ an Lu n va ac th si 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Minh Khởi, Đào Văn Đơn, Hồng Văn Lương, Trần Minh Ngọc, “Chiết xuất phân lập số phenollic glycosid từ quế chi Việt Nam (cinnamomum cassia blume)” lu Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Phạm Thanh Huyền, Vũ an Thị Hạnh Nguyên, Trương Quốc Phong, Nguyễn Tiến Thành, Vũ Thu va n Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đa dạng di truyền xạ khuẩn nội cộng gh tn to sinh phân lập từ quế tỉnh Hịa Bình”, Tạp chí Khoa học Cơng ie nghệ, 52 (5B), 577-582 p Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Vũ Thị Hạnh Nguyên, nl w Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá sang lọc xạ khuẩn nội d oa cộng sinh quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh”, Tạp chí an lu Cơng nghệ Sinh học, 12 (2), 365-371 nf va Văn Thị Phương Như, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập đặc tính vi lm ul khuẩn nội cộng sinh lúa (Oryza sativa L.) trồng đất tỉnh (2), 450-454 Tài liệu tiếng Anh z at nh oi Phú Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc, z gm @ Abebe B, Feleke M, Berhanu A (2013), “Isolation and screening of antibiotic producing actinomycetes from soils in Gondar town, North West co l Ethiopia”, Asian Pac J Trop Dis 3(5), 375-381 m Ajit K, Passari, Vineet K, Mishra, Ratul S, Vijai K, Gupta and Bhim P, an Lu Singh (2015), “Isolation, abundance and phylogenetic affiliation of n va ac th si 42 endophytic actinomycetes associated with medicinal plants and screening for their in vitro antimicrobial biosynthetic potential”, Front Microbiol (273), 1-13 Bacon CW, White JF (2000) Microbial endophytes, New York, Marcel Dekker Bérdy J (2005), “Bioactive microbial metabolites”, J Antibiot, (58),1-26 10 Cane DE (1997), “A special thematic issue on polyketide and nonribosomal polypeptide biosynthesis, Chem Rev, (97), 2463-2706 lu 11 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005), “Use of an plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: va n principles, mechanisms of action, and future prospects”, Appl Environ gh tn to Microbiol, (71), 4951-4959 ie 12 Duong Minh Lam, Nguyen Dinh Viet and Tong Thi Mo (2014), p “Screening for anticancer producing endophytic actinomycetes in three oa nl w mangrove plant species”, Chemical and Biological Sci, 59(9), 114-122 13 Franco C, Michelsen P, Percy N, Conn V, Listiana E, Moll S, Loria R, d an lu Coombs J (2007), “Actinobacterial endophytes for improved crop nf va performance”, Australas Plant Pathol, (36), 524-531 lm ul 14 Gangwar M, Dogra S and Sharma N (2011), “Antagonistic Bioactivity of z at nh oi Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plants”, Journal of Advanced Laboratory Research in Biology, 2(4), 154-157 15 Gewirtz DA (1999), “A critical evaluation of the mechanism of action z @ proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics l gm adriamycin and daunorubicin”, Biochem Pharmacol, (57), pp 727-741 co 16 Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004), m “Anthracycline: Molecular Advances and pharmacologic developments in an Lu antitumor activity and cardiotixicity”, Pharmacol Rew, (56), 185-229 n va ac th si 43 17 Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010), “Sequencebased analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria”, Appl Environ Microbiol, 76(8), 2487-2499 18 Hadacek F, Greger H (2000), “Testing of antifungal natural products: Methodologies, comparability of results and assay choice”, Phytochem Anal, (11), 137-147 19 Higashide E, Asai M, OotsuK TS, Kozay Y, Hasegawa T, Kishi T, Sugino Y, Yoneda M (1977), “Ansamitocins, a group of novel lu maytansinoid antibiotics with antitumour properties from Nocardia”, an Nature (270), 721-722 va n 20 Igarashi Y (2004), “Screening of novel bioactive compounds from plant- gh tn to associated actinomycetes”, Actinomycetologica (18), 63-66 ie 21 Jeffrey EJ and Guy TC “Biosynthetic (2010), Potential of p Phylogenetically Unique Endophytic Actinomycetes from Tropical Plants”, nl w Applied and environmental Microbiology p, 4377-4386 d oa 22 Kakadumycins, “Novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL nf va (234), 183-190 an lu 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia”, FEMS Microbiol Lett lm ul 23 Kupchan SM, Komoda Y, Court WA, Thomas GJ, Smith RM, Karim A, z at nh oi Gilmore CJ, Haltiwanger RC, Bryan RF (1972), “Maytansine, a novel antileukaemic ansa macrolide from Maytenus ovatus”, J Am Chem Soc (94), 1355-1356 z @ 24 Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY,Xu LH, Jiang CL, l gm Li WJ (2008), “Antitumour and antimicrobial activities of endophytic m Microbiol (47), 574-580 co Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”, Lett Appl an Lu n va ac th si 44 25 Li Y , Kam SL , Wang H , Wong EY , Ooi VE (2006), “Antimicrobial activities of cinnamon oil and cinnamaldehyde from the Chinese medicinal herb Cinnamomum cassia Blume”, Am J Chin Med 34(3), 511-522 26 Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), “Plant pathogenecity in the genus Streptomyces”, Plant Dis (81), 836-846 27 Lu CH, Shen YM (2007), “A novel ansamycin, naphthomycin K from Streptomyces sp J”, Antibiot (60), 649-653 28 Mahera MS, Sulaiman AA, Ismet A, Milton W (2013), “Evaluation of lu antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert an environment of Saudi Arabia”, Life Sci J 10(4), 974-980 va n 29 Marahiel MA, Stachelhaus T, and Mootz HD (1997), “Modular pep-tide gh tn to synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis”, Chem Rev (97), ie 2651-2673 p 30 Matsukuma S, okuda T, Watanabe J (1994), “Isolation of actinomycetes oa nl w from pine litter layers”, Actinomycetologica (8) 57-65 31 Meguro A; Ohmura Y, Hasegawa S, Shimizu M, Nishimura T & Kunoh H d an lu (2006), “An endophytic actinomycete, Streptomyces sp MBR-52, that nf va accelerates emergence and elongation of plant adventitious roots”, lm ul Actinomycetologica (20), 1-9 z at nh oi 32 Munumbicins, “Wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans”, Microbiology, (148), 2675-2685 z 33 Nduka O (2007),“Modern Industrial Microbiology and Biotechnology”, l gm @ Science, Enfield, pp 429-453 co 34 Nimnoi P, Pongsilp N, Lumyong S (2010), “Endophytic actinomycetes m isolated from Aquilaria crassna Pierre ex Lec and screening of plant growth an Lu promoters production”, World J Microbiol Biotechnol (26), 193-203 n va ac th si 45 35 Priham TG and Tenser HD (1974), ”Streptomyces Waksman and first and second studies”, Int J Syst Bacteriol (18,) 279 36 Pullen C, Schmitz P, Meurer K, Bamberg DD, Lohmann S, Franc SDC, Groth I, Schlegel B, Möllmann U, Gollmick F, Gräfe U, Leistner E (2002), “New and bioactive compounds from Streptomyces strains residing in the wood of Celastraceae”, Planta (216), 162-167 37 Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011), “Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated lu endophytic actinobacteria”, Appl Microbiol Biotechnol (89), 457-473 an 38 Rojas DJ, Sette LD, Araujo WL, Lopes MSG, Silva LF, Furlan RLA, va n Padilla G (2012), “The diversity of polyketide synthase genes from gh tn to sugarcane-derived fungi”, Microb Ecol (63), 565-577 ie 39 Sambrook J, Russell DW (2001), “Molecular cloning A laboratory p manual, 3rded”, Cold Spring Harbor laboratory, NY oa nl w 40 Shimizu M, Yazawa S, Ushijima Y (2009), “A promising strain of endophytic Streptomyces sp for biological control of cucumber d an lu anthracnose”, J Gen Plant Pathol (75), 27-36 nf va 41 Shirling EB, Gotilieb D (1972), “Cooperative deription of type cultures lm ul of Streptomyces” V.Additional descriptions, International journual of z at nh oi systematic Bacteriology (22), 265-394 42 Skarbek JD, Brady LR (1978), “Streptomyces cavourensis sp nov (nom Rev.) and Streptomyces cavourensis subsp Washingtonensis subsp Nov., a z Bacteriology 28(1), 45-53 l gm @ Chromomycin-producing subspecies”, International Journal of Systematic co 43 Snipes CE, Duebelbeis DO, Olson M, Hahn DR, Dent WH, Gilbert JR, m Werk TL, Davis GE, Lee-Lu R, Graupner PR (2007), “The endophytes in an Lu the stems and roots of rice”, Microb Ecol (53), 700-707 n va ac th si 46 44 Sun Y, Cheng Z, Glick BR (2009), “The presence of a 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase deletion mutation alters the physiology of the endophytic plant growth promoting bacterium”, Burkholderia phytofirmans PsJN FEMS Microbiol Lett (296), 131-136 45 Suwanborirux K, Chang CJ, Spjut RW, Cassady JM (1990), “Ansamitocin P-3, a maytansinoid from Claopodium crispifolium and Anomodon attenuatus or associated actinomycetes”, Experientia (46), 117-120 46 Suzuki T, Shimizu M, Meguro A, Hasegawa S, Nishimura T, Kunoh H lu (2005), “Visualization of infection of an endophytic actinomycete an Streptomyces galbus in leaves of tissue-cultured rhododendron”, va n Actinomycetologica (19),7-12 gh tn to 47 Thomson CJ, Bialphos SH (1995), “Genetics and Biochemistry of ie antibiotic production”, 197-222 p 48 Trease GE, Evans WC (1996), “A textbook of Pharmacognosy 14th ed nl w Bailliere Tindall Ltd, London”, 832 d oa 49 Trenser HD and Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by nf va an lu Streptomyces as criteria for species differentiation”, J Bacteriol (76), 239 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy - Môi trường YIM 38 (g/L): Cao malt 4; cao men 4; glucose 4; agar 20; H2O 1L; pH 7,2 - Môi trường LBA (Luria-Bertani) (g/L): Cao nấm men 5; Tryptone 10; NaCl 10; agar 15; H2O 1L; pH= 6,5-7,0 - Môi trường MPA (g/L): Cao thịt 3; peptone 10; NaCl 5; agar 18g; H2O 1L; pH lu - Môi trường Hansen (g/L): Glucose 20; peptone 10; KH2PO4 2; MgSO4 an n va 2; cao nấm men 3; agar 18g; H2O 1L; pH 6,5 tn to - Môi trường Bennett (g/L): Cao thịt 1; glucose 10; cao men 1; Casamino - Môi trường Gause-I (g/L): Tinh bột tan 20; K2HPO4 0,5; p ie gh acid 2; agar 18-20; H2O 1L; pH 7,3-7,5 w MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; (NH4) 2SO4 2; KNO3 0,5; FeSO4 0,01; agar oa nl 18g; H2O 1L; pH 7-7,4 d - Môi trường Gause-II (g/L): Nước chiết thịt 30ml; peptone 5; NaCl 5; lu nf va an glucose 10; agar 18g; H2O 1L; pH 7-7,4 - Môi trường ISP-1 (g/L): Tryptone 5; cao nấm men 3; agar 18g; H2O lm ul 1L; pH 20g; H2O 1L; pH 7-7,2 z at nh oi - Môi trường ISP-2 (g/L): Cao nấm men 3, cao malt 10; dextrose 4; agar z - Môi trường ISP-3 (g/L): Bột kiều mạch 20; muối A 1ml; agar 20g; H2O gm @ 1L; pH 7,2 l - Môi trường ISP-4 (g/L): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 1; m co NaCl 1; (NH4)2SO4 2; CaCO3 2; muối A 1ml; agar 18g; H2O 1L; pH 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7-7,4 an Lu - Môi trường ISP-5 (g/L): Asparagin 1; glixerin 10; K2HPO4 1; muối A n va ac th si - Môi trường ISP-6 (g/L): Peptone 10; cao nấm men 1; xitrat sắt 0,5; agar 18g; H2O 1L; pH 7-7,2 - Môi trường ISP-7 (g/L): Glycerol 15; L-tyrosine 0,5; L-asparagine 1; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; muối A 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7,2-7,4 - Môi trường ISP-9 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2 PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1; dung dịch muối B 1ml, nguồn cacbon 10; agar 20g; H2O 1L; pH 6,8-7 lu - Dung dịch muối A (%): FeSO4 0,1; ZnSO4 0,15; MnCl2 0,1; H2O an 100ml va n - Dung dịch muối B (%): CuSO4 0,64; FeSO4 0,11; MgCl2 0,79; H2O ie gh tn to 100ml p Phụ lục 2: DNA tổng số chủng xạ khuẩn d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z @ gm Hình Điện di đồ sản phẩm tách chiết DNA tổng số số chủng xạ l khuẩn nội cộng sinh gel agarose 1% Trong đó: 1:YBQ128; 2:YBQ56; m co 3:YBQ40; 4:YBQ108; 5:YBQ26; 6:YBQ44; 7:YBQ80; 8:YBQ59; 9: 15: YBQ65; 16: YBQ50; 17: YBQ1 an Lu YBQ118; 10: YBQ107; 11: YBQ88; 12: YBQ21; 13: YBQ19; 14: YBQ47; n va ac th si Phụ lục 3: Bảng số liệu khả kháng loại vi sinh vật kiểm định 36 chủng xạ khuẩn YBQ01 0 0 0 0 YBQ02 0 0 0 7,2 ±0.16 0 YBQ19 15,9 ±0.1 0 0 0 11,3 ±0.12 YBQ21 0 0 16,5 ±0.35 0 YBQ25 0 0 12,8 ±0.28 14 ±0.17 0 YBQ36 0 0 ±0.17 YBQ40 0 15,7 ±0.12 YBQ44 0 ±0.05 0 YBQ46 9,2 ±0.13 17,3 ±0.12 8,8 ±0.08 0 15 ±0.05 10,1 ±0.05 21,3 ±0.12 22,7 ±0.12 0 z at nh oi 20 ±0.26 19,3 ±0.12 9,1 ±0.07 22 ±0.12 0 0 0 0 18,7 ±0.06 15,8 ±0.49 0 6,3 ±0.06 11,7 ±0.08 lu Ký hiệu chủng gh Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) STT an n va 10,8 ±0.18 4,7 ±0.15 8,2 ±0.15 tn to p ie YBQ47 19,1 ±0.32 oa nl w 10 0 16 ±0.35 2,6 ±0.07 18,8 ±0.3 12 YBQ56 13 YBQ59 12 ±0.26 16,6 ±0.42 14,9 ±0.14 14 YBQ63 0 15 YBQ65 16 YBQ75 17 YBQ76 0 18 YBQ80 14,5 ±0.06 22,9 ±0.31 16,7 ±0.21 17,7 ±0.15 8,5 ±0.13 23,3 ±0.12 19 YBQ88 0 20 YBQ90 14,2 ±0.07 14,6 ±0.45 0 21,5 ±0.11 0 0 8,5 ±0.21 23 ±0.21 21,3 ±0.14 12,3 ±0.23 19,5 ±0.13 ±0.17 19,3 ±0.15 15 ±0.26 nf va an lu 15,5 ±0.28 16,7 ±0.12 lm ul 18,8 ±0.33 16,3 ±0.28 0 0 16,7 ±0.12 15 ±0.14 19 ±0.42 l gm @ 0 co 0 z 13 ±0.14 10,3 ±0.06 7,3 ±0.21 23,2 ±0.08 22 ±0.35 5,1 ±0.13 17,6 ±0.16 0 m YBQ50 d 11 15 ±0.1 18,8 ±0.46 1,2 ±0.04 5,3 ±0.03 12,3 ±0.06 17,3 ±0.12 an Lu n va ac th si STT Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) Ký hiệu chủng 13,8 ±0.14 12,5 ±0.94 4,9 ±0.40 9,8 ±0.46 14,7 ±0.14 17,5 ±0.05 0 0 0 23 YBQ101 0 0 0 24 YBQ104 1,5 ±0.05 0 0 0 14,5 ±0.26 20 ±0.35 14,7 ±0.32 2,1 ±0.14 12,1 ±0.1 25 YBQ105 26 YBQ106 0 0 0 0 7,2 ±0.13 27 YBQ107 0 12 ±0.53 10 ±0.14 12,3 ±0.25 12,3 ±0.23 0 28 YBQ108 0 0 0 0 7,8 ±0.08 21 YBQ92 22 YBQ94 lu an n va gh tn to p ie 29 YBQ115 6,8 ±0.08 31 YBQ118 30 YBQ116 33 YBQ121 7,8 ±0.28 6,8 ±0.44 0 0 7,8 ±0.03 0 9,7 ±0.15 15,7 ±0.06 9,6 ±0.12 7,9 ±0.04 10,5 0 ±0.05 11,6 4,2 ±0.23 ±0.09 18 7,4 ±0.1 ±0.14 ±0.40 17,5 ±0.09 15 ±0.42 0 0 0 11,4 ±0.05 15,8 ±0.28 15,5 ±0.09 12,3 ±0.06 19,3 ±0.42 34 YBQ122 0 0 0 0 7,5 ±0.09 35 YBQ125 1.21 ±0.13 1.7 ±0.13 1.2 ±0.14 2.07 ±0.42 1.6 ±0.21 1.83 ±0.21 1.64 ±0.34 36 YBQ128 0 0 0 nf va an lu d oa nl w 32 YBQ119 11,2 0 ±0.03 11,2 13 ±0.09 ±0.14 5,8 5,7 16 ±0.2 ±0.04 ±0.07 lm ul z at nh oi 1.43 ±0.06 0.33 ±0.18 0 0 z Ghi chú:1 Escherichia coli ATCC 11105; Proteus vulgaris CNLM; @ gm Salmonella enterica ATCC 14028; Enterobacter aerogenes ATCC 13048; co l Pseudomonas aeruginosa CNLM; Sarcina lutea CNLM; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Bacillus cereus ATCC 1177; m an Lu Candida albicans ATCC 10231 n va ac th si Phụ lục 4: Trình tự 16S rDNA chủng YBQ75 lu 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 an n va p ie gh tn to CTTCGGTGG TGGATTAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGGGCAATCT GCCCTTCACT CTGGGACAAG CCCTGGAAAC GGGGTCTAAT ACCGGATAAT ACTCCTGCCT GCATGGGTGG GGGTTGAAAG CTCCGGCGGT GAAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGAA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGCAAGTGA CGGTACCTGC AGAAGAAGCG CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG CGCAAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCATTCGATA CGGGCTAGCT AGAGTGTGGT AGGGGAGATC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG GCCATTACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TTGGCGACAT TCCACGTCGT CGGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTT d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si