Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đất ức chế sinh trưởng tụ cầu khuẩn( staphylococus spp ) kháng thuốc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Lê Quảng Viễn PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐẤT ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TỤ CẦU KHUẨN (STAPHYLOCOCCUS SPP.) KHÁNG THUỐC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Mạnh Tuấn TS Trƣơng Phúc Hƣng Thái Nguyên - 2022 LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành Luận văn thạc sĩ trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, bên cạnh nỗ lực thân, nhận đƣợc giảng dạy hƣớng dẫn nhiệt tình q thầy giáo Lời cho phép đƣợc trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Khoa học tạo điều kiện thuận lợi cho trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới quý thầy cô giáo giảng dạy giúp đỡ tơi suốt khóa học Đại học Khoa học Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Nguyên Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới hai thầy hƣớng dẫn: Tiến sỹ Nguyễn Mạnh Tuấn, Viện Khoa học sống, Đại học Thái Nguyên; Tiến sỹ Trƣơng Phúc Hƣng, Giám đốc Trung tâm Đào tạo, Tƣ vấn Chuyển giao công nghệ, Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên Những ngƣời thầy tận tình, chu đáo hƣớng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu để tơi hoàn thành đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đất ức chế sinh trƣởng tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) kháng thuốc” Tơi xin cảm ơn tồn thể đồng chí Ban giám đốc, ban lãnh đạo tập thể đồng nghiệp phòng Kế hoạch-Nghiệp vụ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật giúp đỡ hỗ trợ tơi nhiều q trình thực luận văn Cuối vô cảm ơn quan tâm ủng hộ gia đình bạn bè Đó nguồn động viên tinh thần lớn để tơi theo đuổi hồn thành luận văn Dù cố gắng, khả kiến thức tơi cịn hạn chế nên luận văn tơi khơng tránh khỏi thiếu sót định Tơi mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến q thầy tồn thể bạn để nội dung luận văn đƣợc hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 20 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đất ức chế sinh trƣởng tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) kháng thuốc” cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn khoa học TS.Nguyễn Mạnh Tuấn TS.Trƣơng Phúc Hƣng Các kết nghiên cứu luận văn đƣợc phân tích cách trung thực, khách quan phù hợp với thực tiễn Các kết chƣa đƣợc công bố nghiên cứu khác Các số liệu, thông tin trích dẫn sử dụng phân tích luận văn ghi rõ nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Thái Nguyên, ngày tháng năm 20 Học viên Lê Quảng Viễn ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học nghiên cứu: CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nghiên cứu nƣớc 1.1.1 Tóm lƣợc lịch sử khám phá kháng sinh 1.1.2 Đặc điểm sinh học chủng tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) 1.1.3 Kháng thuốc chủng vi khuẩn gây bệnh 1.1.4 Cơ chế kháng thuốc chủng vi khuẩn gây bệnh 1.1.5 Giải pháp kiểm soát vấn đề kháng thuốc chủng vi khuẩn gây bệnh11 1.1.6 Tiềm hoạt chất kháng khuẩn chủng vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm 15 1.1.7 Thành tựu nghiên cứu hoạt chất kháng khuẩn tách chiết từ chủng vi khuẩn sinh trƣởng chậm 16 1.2 Tổng quan nghiên cứu nƣớc 19 1.2.1 Tình hình vi khuẩn kháng thuốc 19 1.2.2 Những thành tựu nghiên cứu hoạt chất kháng khuẩn 20 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Mẫu đất 23 2.1.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định 23 2.1.3 Môi trƣờng phân lập nuôi cấy 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu đất 25 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập chủng vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm 25 2.2.3 Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm sinh hoạt chất kháng khuẩn 25 iii 2.2.4 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 26 2.2.5 Phƣơng pháp khuếch đại trình tự gen 16S rRNA phản ứng PCR27 2.2.6 Phƣơng pháp đọc trình tự gen 16S rRNA 27 2.2.7 Phƣơng pháp xây dựng sơ đồ phả hệ 28 2.2.8 Phƣơng pháp xác định đặc điểm sinh học chủng phân lập 28 2.2.9 Phƣơng pháp xác định mơi trƣờng thích hợp sản sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng phân lập 28 2.2.10 Phƣơng pháp tách chiết tinh hoạt chất kháng khuẩn 28 2.2.11 Phƣơng pháp đánh giá hoạt chất kháng khuẩn (MIC) 29 2.2.12 Phƣơng pháp phân tích sơ kháng sinh thơ sắc kí lớp mỏng (TLC/Thin-layer chromatography) 29 2.2.13 Phƣơng pháp xử lý số liệu 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm ức chế sinh trƣởng Staphylococcus epidermidis CCARM 3710 30 3.2 Phân loại phân tử hai chủng C101 C102 dựa vào trình tự gen 16S rRNA 32 3.3 Đặc điểm nuôi cấy C101 C102 35 3.4 Mơi trƣờng ni cấy thích hợp cho sản sinh hoạt chất kháng khuẩn chủng C101 C102 37 3.5 Phân tích hoạt chất kháng khuẩn 38 3.5.1 Tách chiết hoạt chất kháng khuẩn 38 3.5.2 Đánh giá hoạt chất kháng khuẩn 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 50 Phụ lục Trình tự gen 16S rRNA chủng C101 50 Phụ lục Trình tự gen 16S rRNA chủng C102 51 CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ 52 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích đầy đủ ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng chuẩn Mỹ) CCARM CLSI Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes (Ngân hàng vi khuẩn kháng kháng sinh) Clinical And Laboratory Standards Institute (Viện nghiên cứu tiêu chuẩn phịng thí nghiệm Lâm sàng) DNA Deoxyribonucleic Acid ISEM Intensive soil extract medium (Môi trƣờng chiết xuất đất) MIC MRSA NCBI Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng methicillin) National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Quốc tế) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid VRE WHO Vancomycin-resistant Enterococcus (Enterrococcus kháng Vancomycin) World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các loại kháng sinh đƣợc phát từ chủng vi khuẩn sinh trƣởng chậm giai đoạn 2010-2020 17 Bảng 3.1 Các chủng phân lập sinh trƣởng chậm khuẩn ức chế Staphylococcus epidermidis CCARM 3710 31 Bảng 3.2 Nhận diện trình tự gen 16S rRNA chủng C101 C102 với liệu công bố 33 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết tổng số chủng C101 39 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Nhóm kháng sinh đƣợc phát theo thời gian Hình 1.2 Mốc thời gian phát kháng sinh kháng thuốc Hình 1.3 Cơ chế kháng kháng sinh qua đƣờng bơm đẩy 10 Hình 1.4 Các phƣơng pháp sử dụng cho phát kháng sinh 13 Hình 1.5 Cấu trúc kháng sinh tiềm đƣợc phát giai đoạn 2010-2020 19 Hình 3.1 Khuẩn lạc xuất môi trƣờng nutrient ISEM 30 Hình 3.2 Khả ức chế Staphylococcus epidermidis CCARM 3710 dịch nuôi cấy chủng phân lập 31 Hình 3.3 Điện di DNA tổng số sản phẩm PCR khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA 32 Hình 3.4 Sơ đồ phả hệ (neighbour-joining tree) thể vị trí phân loại hai chủng C101 C102 35 Hình 3.5 Hình thái tế bào chủng C101 36 Hình 3.6 Đặc điểm sinh trƣởng hai chủng C101 C102 37 Hình 3.7 Hoạt tính ức chế Staphylococcus epidermidis CCARM 3710 từ dịch nuôi cấy chủng C101 C102 38 Hình Hoạt chất kháng khuẩn tách chiết từ chủng C101 38 vii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ năm 1960, có báo cáo khả sinh enzyme penicillinase chủng Staphylococcus aureus cho phép chúng kháng lại penicillin methicillin xuất toàn giới; báo cáo Lee cộng (2018) cho thấy chủng Staphylococcus aureus có khả đa kháng kháng sinh thuộc nhóm β-lactam nhƣ penicillin, methicillin, oxacillin, cephalosporin, carbapenem [42] Nghiên cứu Arias & Murray (2013) cho thấy chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin tiến hóa nhanh chóng, kháng lại hầu hết kháng sinh thuộc nhóm β-lactam; tính riêng Mỹ, 50% loài Staphylococcus aureus phân lập bệnh viện kháng lại methicillin [10] Vấn đề kháng kháng sinh Việt Nam diễn biến phức tạp hơn, có nhiều nguyên nhân cho điều này, nhƣng đƣa số liệu dựa nghiên cứu đƣợc công bố gần Cụ thể, giai đoạn 2004-2006, có tới 74% lồi tụ cầu Staphylococcus đƣợc tìm thấy bệnh viện kháng lại methicillin Theo báo cáo Bộ Y tế, giai đoạn 2008-2009 chủng Staphylococcus aureus phân lập bệnh viện lớn: gần 70% Staphylococcus aureus đƣợc phân lập Bệnh viện Chợ Rẫy kháng với gentamicin; khoảng 64% chủng Staphylococcus aureus Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng Huế kháng lại oxacillin Gần nhất, Thuy cs (2017) tiến hành nghiên cứu bệnh nhân Bệnh viện Nhiệt đới Hồ Chí Minh cho thấy 49% chủng Staphylococcus aureus kháng ciprofloxacin levofloxacin; penicillin (95,8%), oxacillin (63,6%), erythromycin (66,4%) clindamycin (62,2%) Trong mẫu thịt lợn đƣợc thu thập chợ siêu thị Hồ Chí Minh, chủng Staphylococcus aureus phân lập thịt lợn kháng lại ampicillin 100%, penicillin (100%), kanamycin (56,1%), erythromycin (15,2%), clindamycin (13,6%) cephalexin (12,1%); có 9,1% chủng Staphylococcus aureus có khả đa kháng thuốc với loại kháng sinh khác [9] Kể từ phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn sử dụng môi trƣờng rắn đƣợc thiết lập Robert Koch năm 1876 để thu nhận vi khuẩn tinh khiết, có nhiều chủng vi khuẩn khiết đƣợc nghiên cứu đặc điểm kiểu hình kiểu gen phịng thí nghiệm Tuy nhiên, khoảng dƣới 1% tổng số cộng đồng vi khuẩn đƣợc ni cấy, khiết phịng thí nghiệm, phần lớn vi khuẩn cịn lại (>99%) chƣa đƣợc tiếp cận khó ni cấy phịng thí nghiệm, chúng đƣợc gọi chủng vi khuẩn “khó ni cấy/sinh trƣởng chậm” “uncultured bacteria” [30], [67] Nhƣ vậy, nhiều tiềm khám phá hoạt chất kháng khuẩn từ 99% cộng đồng vi khuẩn chƣa đƣợc nuôi cấy [42], [43], [57] Từ lý tiến hành đề tài: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đất ức chế sinh trƣởng tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) kháng thuốc” Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn đƣợc vi khuẩn đất, sinh trƣởng chậm Thái Nguyên có khả ức chế sinh trƣởng tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) kháng thuốc Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn 3.2 Định danh, phân loại vi khuẩn đất sinh trƣởng chậm có khả sinh hoạt chất kháng khuẩn 3.3 Xác định mơi trƣờng thích hợp sản sinh hoạt chất kháng khuẩn 3.4 Phân tích hoạt chất kháng khuẩn Ý nghĩa khoa học nghiên cứu: Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh trƣởng chậm sản sinh hoạt chất tiềm kháng tụ cầu khuẩn kháng thuốc, làm sở để phát triển loại thuốc, nhằm bƣớc ngăn chặn vấn đề kháng thuốc chủng vi khuẩn nhƣ Odilorhabdin sản sinh từ Xenorhabdus nematophila K102 [54], Darobactin đƣợc phát từ Photorhabdus khanii HGB1456 [34] C101 C102 C Hình 3.7 Hoạt tính ức chế Staphylococcus epidermidis CCARM 3710 từ dịch nuôi cấy chủng C101 C102, C: control (chỉ mơi trường ) 3.5 Phân tích hoạt chất kháng khuẩn 3.5.1 Tách chiết hoạt chất kháng khuẩn Chủng C101 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng 10 ngày, có màu vàng Hoạt chất sinh học tổng số sau đƣợc tinh sử dụng silica gel vị trí Rf (retention factor) =0,68 (Hình 3.8) Hình Hoạt chất kháng khuẩn tách chiết từ chủng C101 (A: Hoạt chất kháng khuẩn sau tinh sạch; B1: Sắc ký mỏng TLC at 254 nm; B2: Ức chế sinh trƣởng Staphylococcus epidermidis CCARM 3710) 38 3.5.2 Đánh giá hoạt chất kháng khuẩn Hoạt chất sinh học sau đƣợc tinh bay dung mơi đƣợc hịa tan dimethyl sulfoxide để xác định hoạt tính kháng khuẩn tối thiểu (MIC) Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đƣợc thể bảng 3.3 Chủng C101 có khả ức chế sinh trƣởng chủng vi khuẩn kiểm định từ 2-64 µg/ml, nhạy cảm ức chế sinh trƣởng Bacillus anthracis KEMB 211-146 Staphylococcus aureus ATCC 6538; ức chế trung bình Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Staphylococcus aureus CCARM 3155 đối chiếu với thang chuẩn CLSI (2012) Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết tổng số chủng C101 MIC (µg/ml) Chủng C101 Cephalothin Norfloxacin Bacillus subtilis KEMB 51201-001 32 0,5 Bacillus anthracis KEMB 211-146 0,125 0,25 Staphylococcus aureus ATCC 6538 32 Staphylococcus aureus CCARM 3095 64 128 256 Staphylococcus aureus CCARM 3192 32 128 32 Staphylococcus aureus CCARM 3155 16 64 Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 0,125 0,5 64 128 128 Staphylococcus epidermidis CCARM 3710 Hầu hết (hơn 70%) loại kháng sinh tự nhiên thƣơng mại có nguồn gốc từ nhóm vi khuẩn Gram dƣơng Actinomyces [13] Số lƣợng kháng sinh tự nhiên đƣợc phát có xu hƣớng giảm mạnh, chủng sinh trƣởng chậm chƣa đƣợc ni cấy thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm ứng viên tiềm cho phát loại kháng sinh [49] Ling et al (2015) phát kháng sinh Teixobactin sản sinh từ vi khuẩn Gram âm Eleftheria terrae thuộc nhóm “uncultured bacteria”, Teixobactin có khả ức chế phổ rộng vi khuẩn gây bệnh, bao gồm chủng đa kháng thuốc nhƣ Staphylococcus aureus kháng 39 methicillin (MRSA), Enteroccus faecium kháng vancomycin (VRE), Enteroccus faecalis kháng vancomycin (VRE),… nồng độ ≤ 0,5 µg/l thơng qua q trình ức chế tổng hợp thành tế bào [45] Kháng sinh Elansolid A thuộc nhóm polyketide phân lập từ vi khuẩn Chitinophaga sancti; Lysobactin từ vi khuẩn Cytophaga sp PBJ-5356/Lysobacter sp ATCC53042, Lactivicin từ Empedobacter lactamgenus YK-258 với khả ức chế MRSA [62], [24] Hƣớng nghiên cứu phát hoạt chất kháng khuẩn tự nhiên từ nhóm vi khuẩn sinh trƣởng chậm chƣa đƣợc phân lập trƣớc (“uncultured bacteria”) hƣớng nghiên cứu giới năm gần chƣa đƣợc triển khai nƣớc ta Phát hoạt chất kháng khuẩn từ nhóm vi khuẩn “uncultured bacteria” tiềm năng, triển vọng, có ý nghĩa lớn dƣợc phẩm nhằm bƣớc ngăn chặn vấn đề kháng thuốc 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu cứu này, đƣa kết luận sau: 1) Chúng tuyển chọn đƣợc 11 chủng vi khuẩn sản sinh hoạt chất kháng khuẩn từ 132 chủng phân lập (8,33%) Trong có hai chủng C101 C102 thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh 2) Chủng C101 C102 thuộc nhóm vi khuẩn chƣa đƣợc nuôi cấy trƣớc “uncultured bacteria” 3) Hai chủng C101 C102 vi khuẩn Gram âm, phát sinh trƣởng môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng , , Trên môi trƣờng khuẩn lạc chủng phân lập có hình dạng trịn, lồi, có màu vàng chanh, kích thƣớc dao động từ 1-1,5 mm, kích thƣớc t bo 0,2-0,3 ì 0,8-1,3 àm 4) Chng C101 v C102 có khả sinh trƣởng khoảng nhiệt độ từ 15-37°C (nhiệt độ thích hợp từ 25-28°C), pH từ 5-8 (pH thích hợp từ 6-7) 5) Hoạt chất kháng khuẩn chủng C101 nhạy cảm ức chế hàm lƣợng 2-4 µg/l với Bacillus anthracis KEMB 211-146 Staphylococcus aureus ATCC 6538 theo thứ tự; ức chế trung bình với Bacillus subtilis KEMB 51201001, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Staphylococcus aureus CCARM 3155 từ 8-16 µg/l; từ 32-64 µg/l Staphylococcus aureus CCARM 3095, Staphylococcus aureus CCARM 3192 Staphylococcus epidermidis CCARM 3710 Kiến nghị Tiếp tục nhận diện hoạt chất kháng khuẩn phân tích gen mã hóa cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng khuẩn thông qua hệ genome 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2011), Chọn lựa kháng sinh ban đầu điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện số bệnh viện TP.HCM, Báo cáo nghiệm thu Sở Khoa học Công nghệ TP.HCM Bộ môn Vi sinh, Khoa Y, Đại học Y dƣợc TP.HCM (2009), Vi khuẩn học, Nhà xuất Y học, TP.HCM Ngô Đức Duy, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Quốc Khánh Nguyễn Thị Tƣờng (2012) “Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân ủ kỹ thuật DGGE”, Tạp chí sinh học, 34 (3SE), tr 118-124 Bùi Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 3-48 Đỗ Thu Hà (2002), “Định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN-05 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng đƣợc phân lập từ đất tỉnh Quảng Nam”, Tạp chí sinh học, 24 (1), tr 59-63 Dƣơng Minh Lam, Đặng Ngọc Quang, Nguyễn Thị Hà (2013), “Tách chiết, tinh nghiên cứu đặc điểm kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces sp QN63 chống Staphylococus aureus nhờn kháng sinh”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 51 (5), tr 555-563 Biền Văn Minh (2002), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ, Nhà xuất Đại học Sƣ phạm Hà Nội Võ Văn Song Toàn, Đỗ Thị Cẩm Hƣờng, Hồ Quảng Đồ Trần Nhân Dũng (2017), “Phân lập, tuyển chọn định danh vi khuẩn cỏ bị để phân giải bột bã mía điều kiện in vitro”, Tạp chí Khoa học, Trƣờng Đại học Cần Thơ 48b, tr 71-80 Ly Thi Bich Thuy, Le Thi Thien Nga, Nguyen Duc Bach (2017) Vietnam J Agri Sci 15:1247-1255 42 Tiếng Anh 10 Arias CA and Murray BE (2013) The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance Nat Rev Microbiol 10(4): p266–278 11 Arias, C A & Murray, B E (2009) Antibiotic-resistant bugs in the 21st century-a clinical super-challenge N Engl J Med 360, 439-43 12 Balasubramanian D cs (2017) Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments Pathogens and Disease, 75, 2017, ftx005 13 Bérdy J ( 2005) Bioactive microbial metabolites J Antibiot (Tokyo) 58, 1– 26 14 Blair, J.M., Webber, M.A., Baylay, A.J., Ogbolu, D O & Piddock, L J (2015) Molecular mechanisms of antibiotic resistance Nat Rev Microbiol 13, 42-51 15 Blevins SM & Bronze MS (2010) Robert Koch and the 'golden age' of bacteriology Int J Infect Dis 14:e744-51 16 Browne HP, Forster SC, Anonye BO, Kumar N, Neville BA, Stares MD, Goulding D, Lawley TD (2016) Culturing of “unculturable” human microbiota reveals novel taxa and extensive sporulation Nature 533:543– 546 17 Centers for Disease Control and Prevention, Office of Infectious Disease (2018) Antibiotic resistance threats in the United States U.S department of health and human services 18 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2012) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard—Ninth edition, CLSI document M07-A9 (ISBN 1-56238783-9), vol 32 Pennsylvania 19 Culp, E.J., Waglechner, N., Wang, W et al Evolution-guided discovery of antibiotics that inhibit peptidoglycan remodelling Nature 578, 582–587 (2020) 20 Daniel, R (2005) The metagenomics of soil Nature Reviews Microbiology 3:470-478 43 21 de Kraker ME, Stewardson AJ, Harbarth S (2016) Will 10 million people die a year due to antimicrobial resistance by 2050? PLoS Med 13:e1002184 22 Escobar-Zepeda A, Vera-Ponce de León A, Sanchez-Flores A (2015) The Road to Metagenomics: From Microbiology to DNA Sequencing Technologies and Bioinformatics Front Genet 6:348 23 Eugénie Bergogne-Bérézin, Pierre Dellamonica (2004), Kháng sinh trị liệu thực hành lâm sàng, Nhà xuất Y học, Hà Nội 24 Felsenstein, J (1985) Confidence limit on phylogenies: an approach using the bootstrap Evolution 39, 783–791 25 Gabor EM, Alkema WB, Janssen DB (2004) Quantifying the accessibility of the metagenome by random expression cloning techniques Environ Microbiol 6:879-86 26 Galm U, Shen B (2006) Expression of biosynthetic gene clusters in heterologous hosts for natural product production and combinatorial biosynthesis Expert Opin Drug Discov 1:409-437 27 Gavrish E, Sit CS, Cao S, Kandror O, Spoering A, Peoples A, Ling L, Fetterman A, Hughes D, Bissell A, Torrey H, Akopian T, Mueller A, Epstein S, Goldberg A, Clardy J, Lewis K (2014) Lassomycin, a ribosomally synthesized cyclic peptide, kills Mycobacterium tuberculosis by targeting the ATP-dependent protease ClpC1P1P2 Chem Biol 21(4):509-18 28 GBD 2015 Mortality and Causes of Death Collaborators (2016) Global, regional, and national life expectancy, allcause mortality, and cause-specific mortality for 249 causes of death, 1980-2015: a systematic analysis for the 29 Global Burden of Disease Study 2015 Lancet Lond Engl 388 (10053):1459–1544 30 Gillespie DE (2002) Isolation of antibiotics turbomycin a and B from a metagenomic library of soil microbial DNA Appl Environ Microbiol 68:4301-4306 31 Giovannoni SJ, DeLong EF, Schmidt TM, Pace NR (1990) Tangential flow filtration and preliminary phylogenetic analysis of marine picoplankton Appl Environ Microbiol 56:2572–2575 44 32 Hover BM et al., 2018 Culture-independent discovery of the malacidins as calcium-dependent antibiotics with activity against multidrug-resistant Gram-positive pathogens Nat Microbiol 2018 Apr; 3(4):415-422 33 Hughes D et al Novel depsipeptides and uses thereof US Pat., US20200031871A1, 2020 34 Imai Y., et al A new antibiotic selectively kills Gram-negative pathogens Nature 576(7787) (2019) 35 Jawetz, Welnick, Adelberg’s, Medical microbiology 24th edition 2007, p.161- 196 36 K Lewis (2020) At the Crossroads of Bioenergetics and Antibiotic Discovery Biochemistry 85, 1469–1483 37 Katayama, Y., Ito, T & Hiramatsu, K (2000) A new class of genetic element, Staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus Antimicrob Agents Chemother 44, 1549–1555 38 Kaufmann SH, Schaible UE (2005) 100th anniversary of Robert Koch's Nobel Prize for the discovery of the tubercle bacillus Trends Microbiol 13:469-475 39 Kosmidis, C., Schindler, B D., Jacinto, P L., Patel, D., Bains, K., Seo, S M & Kaatz, G W (2012) Expression of multidrug resistance efflux pump genes in clinical and environmental isolates of Staphylococcus aureus Int J Antimicrob Agents 40, 204–209 40 Krieg NR, Padgett PJ (2011) Phenotypic and physiological characterization methods In Rainey, F and Oren A (eds.), Methods in Microbiology, Vol 38, 1st ed., Academic Press, Oxford, UK 41 Kumar S., Stecher G, Tamure K (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Mol Biol Evol; 33(7):1870-4 42 Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds), Nucleic acid techniques in bacterial systematics John Wiley and Sons, New York, NY, pp 115-175 45 43 Lee AS Và cs (2018) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Nature Reviews Disease Primers 4, 18033 44 Lewis K, Epstein S, D’Onofrio A, Ling LL (2010) Uncultured microorganisms as a source of secondary metabolites J Antibiot 63:468– 476 45 Ling LL, Schneider T, Peoples AJ, Spoering AL, Engels I, Conlon BP, Mueller A, Schäberle TF, Hughes DE, Epstein S, Jones M, Lazarides L, Steadman VA, Cohen DR, Felix CR, Fetterman KA, Millett WP, Nitti AG, Zullo AM, Chen C, Lewis K (2015) A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance Nature 517:455–459 46 Livermore, D M (2008) Defining an extended-spectrum betalactamase Clin Microbiol Infect 14, 3–10 47 Mandell GL, Bennett JE, Dolin R Mandell Douglas and Bennett’s principles and practice of infectious diseases Sixième édition, Elservier, Churchill Livingstone éditeurs, USA Édition en ligne 48 http://www.ppidonline com (site visité le 1er avril 2009) Lewis R US Food and Drug Administration (FDA) The rise of antibioticresistant infections http://www.fda.gov/fdac/features/795_antibio.html (site visité le 23 avril 2009) 49 Masschelein J, Jenner M, Challis GL (2017) Antibiotics from Gram-negative bacteria: a comprehensive overview and selected biosynthetic highlights Nat Prod Rep 34(7): 712-783 50 Miesel L, Greene J, Black TA (2003) Genetic strategies for antibacterial drug discovery Nature Reviews Genetics 4:442-456 51 Nguyen TM, Seo C, Ji M, Paik MJ, Myung SW, Kim J (2018) Effective Soil Extraction Method for Cultivating Previously Uncultured Soil Bacteria Appl Environ Microbiol 84:e01145-18 52 Nordmann, P., Poirel, L., Walsh, T R & Livermore, D M (2011) The emerging NDM carbapenemases Trends Microbiol 19, 588–595 53 Ogawa, W., Onishi, M., Ni, R., Tsuchiya, T & Kuroda, T (2012) Functional study of the novel multidrug efflux pump KexD from Klebsiella pneumoniae Gene 498, 177–182 46 54 Pantel L et al Odilorhabdins, Antibacterial Agents That Cause Miscoding by Binding at a New Ribosomal Site Mol Cell 2018 5;70(1):83-94.e7 55 Pidot S., et al Discovery of Clostrubin, an Exceptional Polyphenolic Polyketide Antibiotic from a Strictly Anaerobic Bacterium Angew Chem Int Ed.2014, 53, – 56 Pitout JD, Hanson ND, Church DL, Laupland KB Population-based laboratory surveillance for Escherichia coli-producing extended-spectrum βs-lactamases:importance of community isolates with blaCTX-M Genes Clin Infect Dis 2004;38: 1736-41 57 Pulschen AA, Bendia AG, Fricker AD, Pellizari VH, Galante D and Rodrigues F (2017) Isolation of uncultured bacteria from antarctica using long incubation periods and low nutritional media Front Microbiol 8: 1346 58 Saitou, N & Nei, M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol 4, 406–425 59 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p.1-170 60 Seal BS, Drider D, Oakley BB, Brüssow H, Bikard D, Rich JO, Miller S, Devillard E8, Kwan J, Bertin G, Reeves S, Swift SM, Raicek M, Gay CG (2018) Microbialderived products as potential new antimicrobials Vet Res 49:66 61 Song JH., cs (2011) pread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus between the community and the hospitals in Asian countries: an ANSORP study J Antimicrob Chemother, 66(5):1061-9 62 Steinmetz H, Gerth K, Jansen R, Schläger N, Dehn R, Reinecke S, Kirschning A, Müller R (2011) Elansolid A, a unique macrolide antibiotic from Chitinophaga sancti isolated as two stable atropisomers Angew Chem Int Ed Engl 50(2): 532-536 63 Thompson, J D., Gibson, T J., Plewniak, F., Jeanmougin, F & Higgins, D G (1997) The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acids Res 25, 4876–4882 47 64 Thuy DB, Campbell J, Hoang NVM, Trinh TTT, Duong HTH, Hieu NC, et al (2017) A one-year prospective study of colonization with antimicrobialresistant organisms on admission to a Vietnamese intensive care unit PLoS ONE 12(9): e0184847 65 Tong SYC., cs (2015) Staphylococcus aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Manifestations, and Management Clin Microbiol Rev 28(3): 603–661 66 Tschech A, Pfennig N (1984) Growth yield increase linked to caffeate reduction in Acetobacterium woodii Arch Microbiol 137:163–167 67 Unemo, M., Golparian, D., Nicholas, R., Ohnishi, M., Gallay, A & Sednaoui, P (2012) High-level cefixime- and ceftriaxoneresistant Neisseria gonorrhoeae in France: novel penA mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure Antimicrob Agents Chemother 56, 1273–1280 68 Voulgari, E., Poulou, A., Koumaki, V & Tsakris, A (2013) Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: now that the storm is finally here, how will timely detection help us fight back? Future Microbiol 8, 27– 39 69 Wang GY, Graziani E, Waters B, Pan W, Li X, McDermott J, Meurer G, Saxena G, Andersen RJ, Davies J (2000) Novel natural products from soil DNA libraries in a streptomycete host Org Lett 2:2401-2404 70 Ward DM, Weller R, Bateson MM (1990) 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community Nature 345:63–65 71 WHO’s new (2017) WHO publishes list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteria-antibioticsneeded/en/ 72 Widdel F, Kohring GW, Mayer F (1983) Studies on dissimilatory sulfate reducing bacteria that decompose fatty acids Arch Microbiol 134:286 –294 48 73.Woodford, N., Turton, J F & Livermore, D M (2011) Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of highrisk clones in the dissemination of antibiotic resistance FEMS Microbiol Rev 35, 736–755 74 Xie Y, Wright S, Shen Y, Du L (2012) Bioactive natural products from Lysobacter Nat Prod Rep 29(11): 1277–1287 75 Yamashita SK, Louie M, Simor AE, Rachlis A Microbiological surveillance and parenteral antibiotic use in a critical care unit Can J Infect Dis 2000;11: 107-11 49 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự gen 16S rRNA chủng C101 >C101 (MT756087) CTCAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCTTAATACATGCAAGTCGAGGGGCAGCAGG TCTGTAGCAATACAGATGCTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAACACGTACAGA ACCTTCCTTTAAGCGGGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCATAGTA TTGTTGAGTGGCATCACTTGATGATTAAAGATTTATCACTTAAAGATGGCTGTGC GGCTGATTAGGTAGTTGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGCCTTCGATCAGTAACTG GTGTGAGAGCACGACCAGTCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGGCAATGGACGCAAGTCTGACCCAGCCATGC CGCGTGGAGGATGAAGGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATTTGGGAAGAAAC CCGGATTTTCTAATTCGGTTGACGGTACCAGATGAATAAGCACCGGCTAACTCCG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTCACTGGGTT TAAAGGGTGCGTAGGCGGGCAGGTAAGTCAGTGGTGAAATCTCCGGGCTTAACC CGGAAACTGCCGTTGATACTATCTGTCTTGAATATCGTGGAGGTAAGCGGAATAT GTCATGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATGACATAGAACACCCATTGCGAAGGCA GCTTACTACACGATCATTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGGATACTCGACATCAGCGATAC ACTGTTGGTGTCTGAGCGAAAGCATTAAGTATCCCACCTGGGAAGTACGACCGCA AGGTTGAAACTCAAAGGAATTGGCGGGGGTCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCTGGGCTAGAATGCTGGTGGACCGT GGGTGAAAGCTCATTTTGTAGCAATACACCGCCAGTAAGGTGCTGCATGGCTGTC GTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCAT CACTAGTTGCCATCAGGTAATGCTGGGAACTCTAGTGAAACTGCCGTCGCAAGAC GTGAGGAAGGAGGGGATGATGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGCCCAGGGCTAC ACACGTGCTACAATGGAGAGGACAAAGAGCTGCCACTTGGTGACAAGGAGCTAA TCTCAAAAACCTCTTCTCAGTTCAGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGC TGGAATCGCTAGTAATCGTATATCAGCAATGATACGGTGAATACGTTCCCGGACC TTGCACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCCGGGTGTACCTAAAGTCGGTAACC GCAAGGAGCCGCCTAGGGTAAAACTGGTGACTGGGGCTAAGTCTA 50 Phụ lục Trình tự gen 16S rRNA chủng C102 >C102 (MT756088) TCAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCTTAATACATGCAAGTCGAGGGGCAGCAGGT CTGTAGCAATACAGATGCTGGCGACCGGCAAACGGGTGCGGAACACGTACAGAA CCTTCCTTTAAGCGGGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATACCCCATAGTAT TGTTGAGTGGCATCACTTGATGATTAAAGATTTATCACTTAAAGATGGCTGTGCG GCTGATTAGGTAGTTGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGCCTTCGATCAGTAACTGG TGTGAGAGCACGACCAGTCACACGGGCACTGAGACACGGGCCCGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGGCAATGGACGCAAGTCTGACCCAGCCATGCC GCGTGGAGGATGAAGGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATTTGGGAAGAAACC CGGATTTTCTAATTCGGTTGACGGTACCAGATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTCACTGGGTTT AAAGGGTGCGTAGGCGGGCAGGTAAGTCAGTGGTGAAATCTCCGGGCTTAACCC GGAAACTGCCGTTGATACTATCTGTCTTGAATATCGTGGAGGTAAGCGGAATATG TCATGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATGACATAGAACACCCATTGCGAAGGCAGC TTACTACACGATCATTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGGATACTCGACATCAGCGATACAC TGTTGGTGTCTGAGCGAAAGCATTAAGTATCCCACCTGGGAAGTACGACCGCAAG GTTGAAACTCAAAGGAATTGGCGGGGGTCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT TAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCTGGGCTAGAATGCTGGTGGACCGTGG GTGAAAGCTCATTTTGTAGCAATACACCGCCAGTAAGGTGCTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCATCA CTAGTTGCCATCAGGTAATGCTGGGAACTCTAGTGAAACTGCCGTCGCAAGACGT GAGGAAGGAGGGGATGATGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGCCCAGGGCTACAC ACGTGCTACAATGGAGAGGACAAAGAGCTGCCACTTGGTGACAAGGAGCTAATC TCAAAAACCTCTTCTCAGTTCAGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTG GAATCGCTAGTAATCGTATATCAGCAATGATACGGTGAATACGTTCCCGGACCTT GCACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCCGGGTGTACCTAAAGTCGGTAACCG CAAGGAGCCGCCTAGGGTAAAACTGGTGACTGGGGCTAAGTCGTACAAG 51 CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ Lê Quảng Viễn, Trần Minh Hằng, Nguyễn Thu Hƣơng, Trƣơng Phúc Hƣng Bài báo khoa học hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2021, 24/10/2021: Nghiên cứu tồn độc tố Cry1Ac từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đất Nguyễn Mạnh Tuấn1, Lê Quảng Viễn2, Trƣơng Phúc Hƣng2, Đỗ Thị Hiền1, Đỗ Bích Duệ1, Dƣơng Thị Khuyên1 Bài báo tạp chí khoa học Cơng nghệ sinh học 2021 phiên tiếng Anh: Identification and optional cultivation for previously uncultured Parasegetibacter sp C101 producing antimicrobial activity (Định danh điều kiện ni cấy thích hợp Parasegetibacter sp C101 sản sinh hoạt chất kháng khuẩn (Chấp nhận đăng 16/12/2021) 52