Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phương pháp gộp mẫu lớn ứng dụng trong sàng lọc covid 19 bằng realtime pcr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN TRUNG ANH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP GỘP MẪU LỚN ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC COVID-19 BẰNG REALTIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN – 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN TRUNG ANH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP GỘP MẪU LỚN ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC COVID-19 BẰNG REALTIME PCR CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Phú Hùng TS.BS Lê Thị Hương Lan THÁI NGUYÊN - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hiện dưới sự hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Phú Hùng TS.BS Lê Thị Hương Lan Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022 Tác giả ii LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Phú Hùng, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên và TS.BS Lê Thị Hương Lan, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt thời gian thực hiện hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa họcĐại học Thái Ngun, Ban chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ sinh học, phịng Sinh hóa thực vật, Viện cộng nghệ sinh học thầy cô giáo, cán Khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt sự quan tâm, giúp đỡ anh chị kỹ thuật viên phịng thí nghiệm khoa tạo điều kiện giúp đỡ trình làm luận văn thạc sĩ Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tơi hồn thành luận văn Trong trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận sự đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để tơi hồn thành luận văn Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022 Tác giả iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu: 3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm virus SARS-CoV-2 1.1.1 Đặc điểm genome virus SARS-CoV-2 1.1.2 Phương thức xâm nhập gây bệnh 1.1.3 Biến đổi di truyền virus SARS-CoV-2 1.2 Tổng quan tình hình dịch bệnh virus SARS-CoV-2 nước giới 10 1.2.1 Tình hình dịch bệnh giới 10 1.2.2 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 11 1.3 Tổng quan phương pháp xét ghiệm SARS-CoV-2 14 1.3.1 Các phương pháp chẩn đoán virus SARS-CoV-2 14 1.3.2 Kit chuẩn đoán virus SARS-CoV-2 16 1.3.3 Tổng quan đánh giá chất lượng sinh phẩm kit chẩn đốn 17 1.4 Tình hình nghiên cứu phương pháp xét nghiệm sàng lọc COVID-19 20 1.4.1 Hướng dẫn lấy mẫu, gộp mẫu xét nghiệm Bộ y tế 20 1.4.2 Các nghiên cứu phương pháp gộp mẫu giới 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 25 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2.2 Hoá chất thiết bị nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lâm sàng 27 iv 2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm sinh phẩm QIAamp Viral RNA Mini Kit 27 2.3.3 Phản ứng Realtime RT-PCR 29 2.3.4 Xây dựng quy trình gộp mẫu đánh giá quy trình gộp mẫu 31 2.3.5 Xác định độ nhạy lâm sàng, độ đặc hiệu lâm sàng, LOD 32 2.3.6 Phương pháp tiến hành thử nghiệm thực tế 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Thu nhân mẫu bệnh phẩm 35 3.1.1 Mẫu bệnh phẩm dương tính với SARS-CoV-2 35 3.1.2 Mẫu chứng âm 35 3.2 Nghiên cứu xây dựng phương pháp gộp mẫu lớn sàng lọc COVID-19 37 3.2.1 Phân tích độ nhạy lâm sàng quy trình gộp mẫu 37 3.2.2 Phân tích độ đặc hiệu lâm sàng quy trình gộp mẫu thơng qua làm giàu mẫu 42 3.2.3 Phân tích độ lặp lại tái lặp quy trình gộp mẫu 44 3.2.4 Ngưỡng phát hiện quy trình gộp mẫu 47 3.2.5 Đánh giá sự thay đổi chi phí cơng xuất xét nghiệm 48 3.3 Xây dựng quy trình thực hiện phương pháp gộp mẫu lớn sàng lọc COVID-19 49 3.3.1 Quy trình thực hiện 49 3.3.2 Sơ đồ hướng dẫn thực hiện 55 BÀN LUẬN 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 Kết luận 62 Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT WHO World Health Organization Ct Cycle threshold PC Positive control NC Negative control vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi mẫu dò 26 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 3.1 Danh sách mẫu bệnh phẩm dương tính thu thập 35 Bảng 3.2 Độ nhạy quy trình gộp mẫu mẫu bệnh phẩm dương tính 37 Bảng 3.3 Đánh giá độ đặc hiệu quy trình gộp mẫu mẫu bệnh phẩm âm tính 42 Bảng 3.4 Độ lặp lại quy trình mẫu dương tính 45 Bảng 3.5 Độ tái lặp quy trình mẫu dương tính 46 Bảng 3.6 Giới hạn phát hiện đối với mẫu chứng dương tổng hợp (CDTH) 47 Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện đối với mẫu chuẩn NIHE cung cấp 48 Bảng 3.8 Bảng so sánh tương đối sự thay đổi chi công xuất xét nghiệm so với xét nghiệm mẫu đơn 48 Bảng 3.9 Sự thay đổi chi phí so với xét nghiệm mẫu đơn theo hạng mục 49 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ phân bố gene genome virus SARS-CoV-2 (Trình tự tham chiếu NCBI: NC_045512.2) Hình 1.2 Q trình xâm nhập giải phóng SARS-CoV-2 khỏi tế bào chủ Hình 1.3 Biểu đồ phân bố số lượng đột biến genome virus SARSCoV-2 [27] Hình 1.4 Đột biến D614G sự phân bổ sự lưu hành chủng G614 châu Âu theo thời gian [4] Hình 1.5 Biến đổi gen S mã hóa cho protein kháng nguyên Spike chủng Omicron so với chủng Delta 10 Hình 3.1 Hình ảnh khuếch đại tín hiệu huỳnh quang mẫu dương tính phương pháp Realtime PCR chuẩn theo quy trình khuyến cáo WHO 36 Hình 3.2 So sánh đường tín hiệu huỳnh quang quy trình chuẩn theo WHO quy trình gộp mẫu nghiên cứu 40 Hình 3.3 So sánh giá trị Ct phương pháp Realtime PCR chuẩn PCR gộp mẫu mẫu bệnh phẩm 41 Hình 3.4 Phân bổ mẫu dương theo giá trị Ct gộp mẫu 100 41 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sàng lọc phương pháp gộp mẫu 100 55 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề COVID-19 bệnh viêm đường hô hấp cấp gây virus SARSCoV-2, lần xác định Vũ Hán, Trung Quốc vào tháng 12 năm 2019 Chỉ thời gian ngắn, bệnh trở thành đại dịch mang tính tồn cầu Tính đến nay, tồn giới có 640 triệu người bị nhiễm Đại dịch COVID-19 coi sự khủng hoảng lớn nhân loại kể tử sau chiến tranh giới lần thứ hai, cướp sinh mạng gần triệu người giới Tình hình COVID-19 giới vẫn phức tạp, chưa ổn định, nhiều quốc gia, số ca mắc mới vẫn mức cao, nhiều loại biến chủng mới, biến chủng phụ, tiềm ẩn khả lây lan nhanh khó dự đốn mức độ nguy hiểm Ủy ban Khẩn cấp Tổ chức Y tế giới (WHO) đánh giá: “Thế giới vẫn tình trạng đại dịch COVID-19 nước vẫn phải tiếp tục tăng cường hệ thống giám sát mở rộng lực điều trị, vắc-xin cho đối tượng nguy cao, đồng thời tiếp tục cập nhật kế hoạch chuẩn bị ứng phó quốc gia với đại dịch COVID-19” Việt Nam quốc gia bị ảnh hưởng nghiêm trọng dịch bệnh với 40 nghìn người chết Mặc dù giai đoạn nghiêm trọng qua xong việc đề phòng cho đợt bùng phát mới cần thiết Thời gian gần đây, nhiều người dân bắt đầu chủ quan, lơ việc thực hiện biện pháp phòng bệnh sau tiêm mũi vắc-xin mắc COVID-19 Đặc biệt việc chưa tích cực tham gia tiêm vắc xin mũi 3, mũi tiêm vaccine cho trẻ em Người mắc COVID19 vẫn có khả bị tái nhiễm mắc biến chứng bệnh, bao gồm trẻ em người lớn Nguy xuất hiện biến chủng mới, thoát khỏi tác động vaccine thuốc điều trị mối lo ngại nhiều quốc gia giới, có Việt Nam 56 Quy trình sàng lọc phương pháp gộp mẫu lượng lớn gồm đến bước mơ tả hình 3.5 Theo đó, mẫu âm tính trải qua bước mẫu dương tính trải qua bước q trình sàng lọc Nhận định kết quả: Mẫu gộp âm tính mẫu khơng có giá trị Ct PCR Mẫu gộp dương tính xác định mẫu có giá trị Ct thấp (Ct < 15) (các giá trị Ct lớn chưa nghiên cứu này) 57 BÀN LUẬN Xét nghiệm đóng vai trị đặc biệt cơng tác kiểm sốt dịch bệnh Tuy nhiên, chi phí cho xét nghiệm phịng chống dịch COVID-19 lớn ảnh hưởng không nhỏ tới kinh tế địi hỏi phải có giải pháp cho vấn đề Trong giai đoạn đầu dịch bệnh, xét nghiệm PCR xét nghiệm mẫu đơn chi phí xét nghiệm đầu người cao Các giải pháp sau y tế đưa xét nghiệm gộp sau gộp 10 Một số địa phương triển khai phương án gộp tới 20 Việc sự dụng phương pháp gộp mẫu đưa lại hiệu kinh tế thiết thực xét nghiệm Chi phí xét nghiệm giảm rõ từ đến 10 lần nhiều so với xét nghiệm mẫu đơn ban đầu Bên cạnh đó, xét nghiệm nhanh kháng nguyên hiện giải pháp tốt, giúp tiết kiệm chi phí so với xét nghiệm PCR mẫu đơn Mặc dù có thay đổi vẫn tồn vấn đề cần phải giải Thứ nhất, xét nghiệm gộp 10 20 mẫu xét nghiệm nhanh giảm chi phí chi phí xét nghiệm tính đầu người vẫn cao (từ 50 - 100 nghìn đồng/người) Với chi phí việc sàng lọc cộng đồng sàng lọc quy mơ lớn (các nhà máy, xí nghiệp, trường học) có tính lặp lại nhiều lần vẫn gánh nặng cho doanh nghiệp cho ngân sách Thứ 2, với xét nghiệm gộp từ 10 – 20 mẫu quy trình PCR chuẩn theo khuyến cáo WHO hiện loại gộp mẫu có rủi ro âm tính giả Rủi ro nghiên cứu Srujana Mohanty cộng sự có đến 15,5% bỏ sót mẫu dương tính với Ct > 35 tiến hành gộp mẫu [34] Thứ 3, công xuất từ phương pháp gộp mẫu hiện (phổ biến gộp – 10 mẫu) vẫn hạn chế trường hợp khẩn cấp cần sàng lọc quy mơ lớn Chính vậy, việc nghiên cứu, cải tiến quy trình xét nghiệm giúp cho cỡ mẫu gộp tăng lên độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng cao phương pháp chuẩn cần thiết 58 Trong nghiên cứu này, chúng tơi đưa giải pháp cải tiến quy trình xét nghiệm để tăng cỡ mẫu gộp lên 100 tăng độ nhạy xét nghiệm giữ nguyên độ đặc hiệu so với xét nghiệm chuẩn hiện nay, đồng thời đảm bảo tính đơn giản, dễ thực hiện chuyển giao cho phòng xét nghiệm Thứ nhất, quy trình gộp mẫu cải tiến quy trình xét nghiệm PCR chuẩn WHO khuyến cáo, quy trình phát hiện chẩn đốn SARS-CoV-2 Realtime RT PCR Victor Corman cộng sự trình bày, Berlin (Đức) [36] Đây quy trình áp dụng phổ biến tất phòng xét nghiệm khẳng định Việt Nam chẩn đoán COVID-19 Thứ 2, với quy trình cải tiến khơng đòi hỏi phải bổ sung thêm trang thiết bị mà phòng xét nghiệm COVID-19 phương pháp Realtime PCR có Với hai tiêu chí cho phép công việc chuyển giao triển khai kỹ thuật vào phòng xét nghiệm thuận tiện dễ dàng việc xây dựng quy trình xét nghiệm mới hồn tồn cần thêm trang thiết bị bổ sung Trong quy trình xét nghiệm này, điểm mẫu chốt chìa khóa quy trình bước làm giàu mẫu Bước cho phép khuếch đại ban đầu 25 chu kỳ để làm tăng số lượng copy từ mẫu gộp 100, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng PCR để khẳng định kết Kết đạt đề tài rằng, độ nhạy phương pháp gộp mẫu thông qua làm giàu mẫu đạt 100% Toàn mẫu dương phát hiện Điểm đáng lưu ý độ nhạy lâm sàng phương pháp cao, cho phép phát hiện mẫu có Ct ban đầu cao (Ct 30 mẫu có Ct lên tới 36) Điều có ý nghĩa đặc biệt quan trọng việc không bỏ sót trường hợp dương tính, hay nói cách khác hạn chế hiện tượng âm tính giả độ nhạy xét nghiệm thấp 59 Một điểm đặc biệt quan trọng khác liên quan trực tiếp tới việc kết luận kết sau phản ứng PCR kết thúc giá trị Ct Hiện giá trị Ct để khẳng định kết âm tính hay dương tính khơng giống sinh phẩm xét nghiệm, quy trình xét nghiệm Nhìn chung phần lớn đưa giá trị Ct để kết luận dương tính < 35 Một số quốc gia áp dụng mức Ct thấp dưới 30 [33] Trong thực tiễn xét nghiệm, kết xét nghiệm cho giá trị Ct xấp xỉ phạm vi từ 30 - 35 gây nhiều khó khăn cho người nhận định kết xét nghiệm, chí cịn phải thực hiện lại xét nghiệm thêm đến hai lần Điều làm tăng thời gian chi phí cho xét nghiệm Trong nghiên cứu rằng, giá trị Ct thu nhận sau kết thúc PCR nhỏ 15 Biểu đồ biểu diễn tín hiệu huỳnh quang rõ ràng Điều tạo thuận lợi định việc kết luận mẫu xét nghiệm có virus hay không Đây ưu điểm phương pháp Về độ đặc hiệu lâm sàng Cùng với độ nhạy lâm sàng độ đặc hiệu lâm sàng tiêu chí đặc biệt quan trọng cho việc đánh giá chất lượng xét nghiệm Các xét nghiệm Realtime PCR hiện cho độ đặc hiệu lâm sàng lên tới 100% Trong nghiên cứu chúng tơi, tiến hành 12 nghìn người âm tính, tương ứng với 120 mẫu gộp cho thấy tất mẫu cho kết âm tính phương pháp PCR gộp mẫu Điều cho thấy, độ nhạy lâm sàng cao phương pháp gộp mẫu không cho kết dương tính giả, hay nói cách khác độ đặc hiệu lâm sàng xét nghiệm đáp ứng yêu cầu xét nghiệm Realtime PCR Đánh giá độ lặp lại tái lặp phương pháp, việc sử dụng mẫu dương tính có giá trị Ct 20,51 13,55 Kết cho thấy biên độ giao động giá trị Ct sau làm giàu mẫu thấp, hệ số biến thiên CV lặp lại 2,21%; CV tái lặp 1,28% Cho thấy tính ổn định 60 xác quy trình xét nghiệm lần chạy lặp lại chạy độc lập nghiên cứu Điều với khuyến cáo việc xây dựng quy trình xét nghiệm với %CV < 0,25 [37] Một điểm mấu chốt phương pháp gộp mẫu 100 giúp cho phương pháp phát hiện mẫu dương tính độ pha lỗng mẫu tăng cao giới hạn phát hiện (LOD95) Các thử nghiệm độ pha loãng từ – 50 copy cho thấy kỹ thuật PCR gộp mẫu thông qua làm giàu mẫu cho phép 80% mẫu có nồng độ copy/phản ứng phát hiện tất mẫu có nồng độ từ copy/phản ứng (LOD95 ~ copy/phản ứng) Đây ngưỡng phát hiện thấp, cao hầu hết thông số công bố sinh phẩm xét nghiệm SARS-CoV-2 hiện Chính điều cho phép phát hiện mẫu có nồng độ virus ban đầu thấp (Ct lên tới 36) sau trộn vào mẫu âm tính khác Về khía cạnh hiệu xuất chi phí xét nghiệm Đây vấn đề mấu chốt sàng lọc diện rộng sàng lọc cộng đồng mà nghiên cứu hướng tới Việc việc gộp 100 mẫu cho lần tách chiết giảm chi phí xét nghiệm từ khâu tách chiết Thêm vào đó, hóa chất để thực hiện phản ứng PCR sau phản ứng phản ứng làm giàu mẫu không cần sử dụng mẫu dò phản ứng PCR2 giống hệ với PCR thường quy theo khuyến cáo WHO [36] Từ thực tế đó, chúng tơi ước tính loại xét nghiệm cho phép giảm chi phí hóa chất tới 50 lần so với PCR mẫu đơn thường quy Điều tạo thay đổi tích cực vấn đề giảm chi phí triển khai xét nghiệm diện rộng Mặt khác, theo tính tốn, cơng xuất loại xét nghiệm tính tốn phịng thí nghiệm với điều kiện trang thiết bị, nhân lực không đổi tăng gấp khoảng 20 lần Đây xem ưu vượt trội so với xét nghiệm mẫu đơn xét nghiệm gộp mẫu 61 thấp từ – 10 mẫu triển khai xét nghiệm diện rộng trường hợp khẩn cấp Về vấn đề chuyển giao triển khai thực tế Đây khía cạnh đặc biệt quan trọng mà đề tài hướng tới Một phương pháp phục vụ cho sàng lọc quy mô cộng đồng lượng mẫu lớn cần thiết phải triển khai nhiều địa phương khác nhiều phòng xét nghiệm khác Trong nghiên cứu này, tiếp cận theo phương pháp cải tiến quy trình chuẩn mà WHO khuyến cáo toàn giới [36] Điều giúp cho quy trình trở lên đơn giản, quen thuộc với nhân viên xét nghiệm triển khai quy trình mà chuẩn WHO Mặt khác, với quy trình này, khơng có thiết bị mới địi hỏi phải bổ sung so với trang thiết bị hiện có phòng xét nghiệm triển khai xét nghiệm COVID-19 Realtime PCR Những hạn chế tồn phương pháp này: Một hạn chế gặp phải triển khai loại xét nghiệm khả nhiễm chéo xuất hiện khơng đảm bảo điều kiện chống tạp nhiễm không đảm bảo Giải pháp cho vẫn đề cần thực hiện nghiêm ngặt quy trình khử nhiễm chống tạp nhiễm tiến hành thao tác theo khuyến cáo 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Thu thập 58 mẫu bệnh nhân dương tính 12000 mẫu bệnh nhân âm tính Xây dựng thành cơng quy trình gộp mẫu 100 Kỹ thuật PCR gộp mẫu 100 cải tiến có độ nhạy lâm sàng cao đạt tới 100% Kỹ thuật PCR gộp mẫu 100 cải tiến có độ đặc hiệu lâm sàng đạt 100% Giới hạn phát hiện LOD95 đạt xấp xỉ copy/phản ứng Chi phí hóa chất xét nghiệm phương pháp gộp mẫu 100 cho phép giảm xuống tới 50 lần Cơng xuất xét nghiệm tăng lên tới 20 lần điều kiện phòng xét nghiệm trang thiết bị nhân lực Kiến nghị Nghiên cứu gộp mẫu từ mẫu gộp 10 để tiếp tục giảm chi phí tăng cỡ mẫu gộp Nghiên cứu đánh giá hiệu tách chiết máy để tiếp tục giảm thời gian chi phí xét nghiệm 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alicia T Widge, Nadine G Rouphael et al, “Durability of Responses after SARS-CoV-2 mRNA-1273 Vaccination” , Affiliations N Engl J Med 2021 Jan 7;384(1):80-82 doi: 10.1056/NEJMc2032195 Epub 2020 Dec [2] A Maitra et al., “Mutations in SARS-CoV-2 viral RNA identified in Eastern India: Possible implications for the ongoing outbreak in India and impact on viral structure and host susceptibility”, J Biosci., vol 45, 2020 [3] A Dömling and L Gao, “Chemistry and Biology of SARS-CoV-2,” Chem, vol 6, no 6, pp 1283–1295, Jun 2020, doi: 10.1016/j.chempr.2020.04.023 [4] B Korber et al., “Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike: Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus”, Cell, p S0092867420308205, Jul 2020, doi: 10.1016/j.cell.2020.06.043 [5] B Liu, P Wang, D X Yang , W N Xiong , M Zhou , J M Qu , Y Feng , Y Guo, “Development of multiple organ dysfunction syndrome in patients with Coronavirus Disease 2019: clinical characteristics and risk factors”, Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi 2021 May 12;44(5):435-442 doi: 10.3760/cma.j.cn112147-20200605-00675 [6] David, S Khoury, Deborah Cromer, Arnold Reynaldi, Timothy E Schlub, Adam K Wheatley, Jennifer A Juno, Kanta Subbarao, Stephen J Kent, James A Triccas & Miles P Davenport, ” Neutralizing antibody levels are highly predictive of immune protection from symptomatic SARS-CoV-2 infection”, Nature Medicine volume 27, pages 1205–1211 (2021) [7] D K Bonilla-Aldana et al., “SARS-CoV, MERS-CoV and now the 2019-novel CoV: Have we investigated enough about coronaviruses? - A bibliometric analysis,” Travel Med Infect Dis, vol 33, p 101566, Feb 2020, doi: 10.1016/j.tmaid.2020.101566 64 [8] D K W Chu et al., “Molecular Diagnosis of a Novel Coronavirus (2019-nCoV) Causing an Outbreak of Pneumonia,” Clinical Chemistry, vol 66, no 4, pp 549–555, Apr 2020, doi: 10.1093/clinchem/hvaa029 [9] D R Marinowic et al., “A new Syber Green real time PCR to detect SARS-CoV-2,” In Review, preprint, May 2020 doi: 10.21203/rs.3.rs28188/v1 [10] E Padron-Regalado, “Vaccines for SARS-CoV-2: Lessons from Other Coronavirus Strains,” Infect Dis Ther, pp 1–20, Apr 2020, doi: 10.1007/s40121-020-00300-x [11] Fenghua Chen, Zhi Geng , Jian Wang , Wenbo Liuchang , Da Huang, Yuandong Xu , Zheng Wang , Lin Wang, “Comparing two sample pooling strategies for SARS-CoV-2 RNA detection for efficient screening of COVID-19”, J Med Virol 2021 May;93(5):2805-2809 doi: 10.1002/jmv.26632 Epub 2021 Mar 11 [12] G Caruana et al., “Diagnostic strategies for SARS-CoV-2 infection and interpretation of microbiological results,” Clinical Microbiology and Infection, p S1198743X20303633, Jun 2020, doi: 10.1016/j.cmi.2020.06.019 [13] H N Thanh et al., “Outbreak investigation for COVID-19 in northern Vietnam,” Lancet Infect Dis, vol 20, no 5, pp 535–536, 2020, doi: 10.1016/S1473-3099(20)30159-6 [14] H K H Luk, X Li, J Fung, S K P Lau, and P C Y Woo, “Molecular epidemiology, evolution and phylogeny of SARS coronavirus,” Infect Genet Evol., vol 71, pp 21–30, 2019, doi: 10.1016/j.meegid.2019.03.001 [15] H Yao et al., “Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARSCoV-2,” Infectious Diseases (except HIV/AIDS), preprint, Apr 2020 doi: 10.1101/2020.04.14.20060160 65 [16] I Hamming, W Timens, M Bulthuis, A Lely, G Navis, and H van Goor, “Tissue distribution of ACE2 protein, the functional receptor for SARS coronavirus A first step in understanding SARS pathogenesis,” J Pathol., vol 203, no 2, pp 631–637, Jun 2004, doi: 10.1002/path.1570 [17] J Zheng, “SARS-CoV-2: an Emerging Coronavirus that Causes a Global Threat,” Int J Biol Sci., vol 16, no 10, pp 1678–1685, 2020, doi: 10.7150/ijbs.45053 [17] J.-M Kim et al., “Identification of Coronavirus Isolated from a Patient in Korea with COVID-19,” Osong Public Health Res Perspect, vol 11, no 1, pp 3–7, Feb 2020, doi: 10.24171/j.phrp.2020.11.1.02 [18] K.-S Yuen, Z.-W Ye, S.-Y Fung, C.-P Chan, and D.-Y Jin, “SARSCoV-2 and COVID-19: The most important research questions,” Cell Biosci, vol 10, p 40, 2020, doi: 10.1186/s13578-020-00404-4 [19] L T Phan et al., “Importation and Human-to-Human Transmission of a Novel Coronavirus in Vietnam,” N Engl J Med., vol 382, no 9, pp 872–874, 27 2020, doi: 10.1056/NEJMc2001272 [20] L Van Cuong et al., “The first Vietnamese case of COVID-19 acquired from China,” Lancet Infect Dis, vol 20, no 4, pp 408–409, 2020, doi: 10.1016/S1473-3099(20)30111-0 [21] L T Phan et al., “Clinical features, isolation, and complete genome sequence of severe acute respiratory syndrome coronavirus from the first two patients in Vietnam,” J Med Virol., May 2020, doi: 10.1002/jmv.26075 [22] M F Romeiro et al., “Evaluation and optimization of SYBR Green realtime reverse transcription polymerase chain reaction as a tool for diagnosis of the Flavivirus genus in Brazil,” Rev Soc Bras Med Trop., vol 49, no 3, pp 279–285, Jun 2016, doi: 10.1590/0037-8682-0444-2015 66 [23] M L DeDiego et al., “A severe acute respiratory syndrome coronavirus that lacks the E gene is attenuated in vitro and in vivo,” J Virol., vol 81, no 4, pp 1701–1713, Feb 2007, doi: 10.1128/JVI.01467-06 [24] M Li et al., “Age related human T cell subset evolution and senescence,” Immun Ageing, vol 16, no 1, p 24, Dec 2019, doi: 10.1186/s12979-019-0165-8 [25] M Pachetti et al., “Emerging SARS-CoV-2 mutation hot spots include a novel RNA-dependent-RNA polymerase variant,” J Transl Med, vol 18, no 1, p 179, 22 2020, doi: 10.1186/s12967-020-02344-6 [26] M Tajadini, M Panjehpour, and S H Javanmard, “Comparison of SYBR Green and TaqMan methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes,” Adv Biomed Res, vol 3, p 85, 2014, doi: 10.4103/2277-9175.127998 [27] N Vankadari, “Overwhelming mutations or SNPs of SARS-CoV-2: A point of caution,” Gene, vol 752, p 144792, Aug 2020, doi: 10.1016/j.gene.2020.144792 [28] Peter B Gilbert, Immune Correlates Analysis of the mRNA-1273 COVID-19 Vaccine Efficacy Trial [29] P S Masters, “The Molecular Biology of Coronaviruses,” in Advances in Virus Research, vol 66, Elsevier, 2006, pp 193–292 [30] P Saule, J Trauet, V Dutriez, V Lekeux, J.-P Dessaint, and M Labalette, “Accumulation of memory T cells from childhood to old age: Central and effector memory cells in CD4+ versus effector memory and terminally differentiated memory cells in CD8+ compartment,” Mechanisms of Ageing and Development, vol 127, no 3, pp 274–281, Mar 2006, doi: 10.1016/j.mad.2005.11.001 67 [31] Q Li et al., “Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus–Infected Pneumonia,” N Engl J Med, vol 382, no 13, pp 1199–1207, Mar 2020, doi: 10.1056/NEJMoa2001316 [32] R Sah et al., “Complete Genome Sequence of a 2019 Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Strain Isolated in Nepal,” Microbiol Resour Announc, vol 9, no 11, Mar 2020, doi: 10.1128/MRA.00169-20 [33] Soha Al Bayat, Jesha Mundodan, Samina Hasnain, Mohamed Sallam, Hayat Khogali, Dina Ali, Saif Alateeg , Mohamed Osama, Aiman Elberdiny, Hamad Al-Romaihi, Mohammed Hamad J Al-Thani, “Can the cycle threshold (Ct) value of RT-PCR test for SARS CoV2 predict infectivity among close contacts?”, J Infect Public Health 2021 Sep;14(9):1201-1205 doi: 10.1016/j.jiph.2021.08.013 Epub 2021 Aug 13 43 [34] Srujana Mohanty, Akshatha Hallur, Bijayini Ravindra, Kavita Behera, Ashoka Gupta, Vinaykumar Mahaptra, Swarnatrisha Saha, Jai Ranjan, Poesy Payal, Monalisa Mohanty, Sutapa Rath, Baijayantimala Mishra, “Intricacies in characterizing positivity in pooled sample testing for SARS-CoV-2”, J Med Virol 2021 May;93(5):2799-2804 doi: 10.1002/jmv.26618 Epub 2021 Feb 23 [35] T Phan, “Genetic diversity and evolution of SARS-CoV-2,” Infect Genet Evol., vol 81, p 104260, 2020, doi: 10.1016/j.meegid.2020.104260 [36] Victor Corman, Tobias Bleicker, Sebastian Brünink, Christian Drosten Jan 17th, 2020, Charité Virology, Berlin, Germany, “Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT PCR” [37] Yingping Wu, Wei Xu, Zhiqiang Zhu, Xiaoping Xia, “Laboratory verification of an RT-PCR assay for SARS-CoV-2”, J Clin Lab Anal 2020 Oct;34(10):e23507 doi: 10.1002/jcla.23507 Epub 2020 Aug 68 [38] Y Yang et al., “The deadly coronaviruses: The 2003 SARS pandemic and the 2020 novel coronavirus epidemic in China,” J Autoimmun., vol 109, p 102434, 2020, doi: 10.1016/j.jaut.2020.102434 [39] Z Li et al., “Development and clinical application of a rapid IgM-IgG combined antibody test for SARS-CoV-2 infection diagnosis,” J Med Virol., Feb 2020, doi: 10.1002/jmv.25727 [40] Zavaleta-H M , Cesar Copaja-Corzo, Vicente A Benites-Zapata, Pedro Cardenas-Rueda, Jorge L Maguiña, Alfonso J Rodríguez-Morales, “Diagnostic performance of RT-PCR-based sample pooling strategy for the detection of SARS-CoV-2”, Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2022 Mar 14; 21(1):11, doi: 10.1186/s12941-022-00501-x [41] https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detectioninstruction.html) [42] https://www.who.int/diagnostics_laboratory/eual/listing/en/ [43] https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnosticseuas#individual-molecular) 69 PHỤ LỤC Thiết kế chứng dương Chứng dương tổng hợp kit plasmid PUC19 mang đoạn gene E virus SARS-CoV-2 tổng hợp PHUSA Biochem Nồng độ gốc chứng dương tổng hợp 107 copy/µl (10.000.000 copy/µl) Pha lỗng chứng dương nồng độ gốc thành nồng độ thích hợp dùng thí nghiệm để tối ưu đánh giá tiêu chuẩn kỹ thuật kit Đoạn gene E tổng hợp hóa học để làm chứng dương có trình tự Hình CATCCGGAGTTGTTAATCCAGTAATGGAACCAATTTATGATGAACCGACGACG ACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTC ATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCT TGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTG TGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTAC GTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCT AAACGAACTAAATATTATATTAGTTTTTCTGTTTGGAACTTTAATTTTAGC 70 Hình Vector PCU19 mang gene E virus SARS-CoV-2 sử dụng làm chứng dương