Ky thuat chuyen gen thuc vat ung dung m3drk 20130427101505 15188 uyvw

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng MỤC LỤC A MỞ ĐẦU B NỘI DUNG Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Các bước kỹ thuật chuyển gen Một số phương pháp chuyển gen thực vật 11 3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp .11 3.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 11 3.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus .16 3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 17 3.2.1 Chuyển gen súng bắn gen (gene gun) 17 3.2.2 Chuyển gen xung điện (electroporation) 20 3.2.3 Chuyển gen vi tiêm (microinjection) 21 3.2.4 Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 22 3.2.5 Chuyển gen phương pháp hóa học .22 3.2.6 Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) 23 Lợi ích nguy trồng chuyển gen 24 Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng 4.1 Lợi ícha 24 4.2 Nguy tiềm ẩn 26 Những thành tựu, triển vọng chủ yếu tạo giống trồng chuyển gen 30 Các hướng tạo trồng chuyển gen 32 6.1 Chuyển gen kháng sâu 32 6.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 33 6.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh 34 6.4 Chuyển gen tạo sản xuất protein động vật 36 6.5 Chuyển gen thay đổi hàm lượng chất lượng chất dinh dưỡng 37 6.6 Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc 38 Quy trình tạo hoa hồng xanh kỹ thuật RNA interference (RNAi) 40 C KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 A MỞ ĐẦU Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Một kỹ thuật công nghệ tế bào thực vật kỹ thuật chuyển gen Trước đây, để tạo giống nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại gen hai cá thể thực vật tạo thể lai mang tính trạng mong muốn Phương pháp thực cách chuyển hạt phấn từ sang nhụy hoa khác Tuy nhiên phép lai chéo bị hạn chế thực cá thể loài (lai gần), lai cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ khơng thể tạo lai Tuy nhiên, lai gần phải nhiều thời gian thu kết mong muốn thơng thường tính trạng quan tâm lại khơng tồn lồi có họ hàng gần Kể từ năm 1984, lúc người ta bắt đầu tạo trồng chuyển gen đến có bước tiến lớn Nhiều trồng quan trọng chuyển gen đời lúa, ngơ, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen chuyển gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả sản xuất loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống lúc đưa vào loài trồng gen mong muốn có nguồn gốc từ thể sống khác nhau, khơng lồi có họ gần mà cịn lồi xa Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Phương pháp hữu hiệu cho phép nhà tạo giống thực vật thu giống nhanh vượt qua giới hạn kỹ thuật tạo giống truyền thống Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen kỹ thuật đưa gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn plasmid tế bào chủ gắn gen tế bào chủ, tồn tái với gen tế bào chủ Gen lạ tế bào chủ hoạt động tổng hợp protein đặc hiệu, gây biến đổi đặc điểm có làm xuất đặc điểm thể chuyển gen Nhìn chung, việc ứng dụng chuyển gen có lợi ích rõ rệt sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những chuyển gen “thế hệ thứ nhất” giúp giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa học hướng đến việc tạo chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng giá trị dinh dưỡng có Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng đặc điểm thích hợp cho cơng nghiệp chế biến Lợi ích trồng hướng trực tiếp vào người tiêu dùng Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ngơ khoai tây - Những giống ngơ trồng điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khỏe từ đậu nành cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm có nguy tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật Bao gồm: - Mối nguy hiểm việc vơ tình đưa chất gây dị ứng làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả phát tán gen biến nạp trồng sang họ hoang dại - Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với chất độc tiết từ chuyển gen - Nguy chất độc tác động tới sinh vật loại sinh vật cần diệt, làm cân sinh thái Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng Nhìn chung, điểm chưa rõ ràng chuyển gen với khả tạo giống trồng có giá trị kinh tế, cơng nghệ có vai trị khơng thể phủ nhận Tuy vậy, số vấn đề đáng lo ngại Để giải vấn đề kết luận thu phải dựa thông tin tin cậy có sở khoa học Triển vọng công nghệ chuyển gen thực vật lớn, cho phép tạo giống trồng mang đặc tính di truyền hồn tồn mới, có lợi cho người mà chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, luôn có Đối với phát triển cơng nghệ sinh học kỷ XXI cơng nghệ chuyển gen có vị trí đặc biệt quan trọng Có thể nói cơng nghệ chuyển gen hướng công nghệ cao công nghệ sinh học đại phục vụ sản xuất đời sống Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng B NỘI DUNG Các nguyên tắc sinh học kỹ thuật chuyển gen Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: - Khơng phải tồn tế bào thể tính tồn (totipotency) - Các khác có phản ứng khơng giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hồn tồn khơng có khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập ADN ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thơng qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các ADN (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Trong đó, ADN virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) Các bước kỹ thuật chuyển gen Từ người ta khám phá thí nghiệm chuyển gen thực nhờ loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, nhà khoa học tin Agrobacterium chuyển gen vào tất trồng Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc (một mầm) mà hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bắn gen vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) Đến nay, nhờ cải tiến vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Quá trình chuyển gen thực qua bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm Kỹ Thuật Chuyển Gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cADN từ thư viện genomic ADN) - Gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E coli - Tách chiết ADN plasmid - Biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác kể - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) Nguyên liệu để thực biến nạp tế bào thực vật riêng rẽ, mô hoàn chỉnh Cản trở lớn tiếp nhận ADN phần lớn sinh vật thành tế bào Muốn làm thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym điều kiện thích hợp người ta tạo tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng Sau biến nạp người ta tách Kỹ Thuật Chuyển Gen