LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – Tiến Sỹ Quản Lê Hà Người đã trực tiếp hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện đề tài Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giá[.]
LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – Tiến Sỹ Quản Lê Hà - Người trực tiếp hướng dẫn dìu dắt em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, cán phịng thí nghiệm Vi sinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em tiến hành thí nghiệm hồn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm Hoá sinh hỗ trợ em thực số thí nghiệm thời gian triển khai đề tài Em xin chân thành cảm ơn động viên, chia sẻ, giúp đỡ gia đình, bạn bè suốt thời gian vừa qua Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2008 Sinh viên Trịnh thị Thuỳ DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Hình 1.2 Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces Hình 1.3 Sản phẩm Marmit Hình 1.4 Sản phẩm Vegemite Hình 1.5 Chế phẩm β – glucan Hình 1.6 Vị trí xúc tác neutrase gồm gốc Asp 102, His57 Ser195 Hình 2.1 Đường chuẩn glutamic Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men Hình 3.2 Ảnh hưỏng nhiệt độ đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm Flavourzyme Hình 3.3 Ảnh hưởng xử lý tế bào chế phẩm enzym cereflo đến khả thuỷ phân protein nấm men Hình 3.4 Ảnh hưởng trình xử lý nhiệt tế bào đến khả thuỷ phân protein nấm men Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm neutrase 0.8L Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men Hình 3.7 So sánh khả thuỷ phân flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân Hình 3.8 Sắc ký đồ Bảng 1.1 Ảnh hưởng NaCl đến phân bố độ ẩm nấm bảng 1.2 Thành phần nấm men trích ly sản xuất phương pháp thuỷ phân Bảng 3.1 Kết đo độ ẩm Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.3 Ảnh hưỏng nhiệt độ đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm Flavourzyme Bảng 3.4 Ảnh hưởng xử lý tế bào chế phẩm enzym cereflo đến khả thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.5 Ảnh hưởng trình xử lý nhiệt tế bào đến khả thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm neutrase 0.8L Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.8 So sánh khả thuỷ phân flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân nấm men DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EDTA : Ethylen Diamin Tetra Acetic Acid HdP :Hoạt độ protease KTĐ :Khô tuyệt đối TCA :Trichloroaceticacid TGTP : Thời gian thuỷ phân MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nấm men Saccharomyces ứng dụng 1.1.1 Giới thiệu Saccharomyces 1.1.1.1 Hình dạng kích thước tế bào nấm men 1.1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men 1.1.1.3 Thành phần hoá học tế bào nấm men 1.1.2 Các ứng dụng nấm men ngành công nghiệp thực phẩm 1.1.2.1 Ứng dụng sản xuất đồ uống lên men 1.1.2.2 Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men 1.1.2.3 Ứng dụng sản xuất sản phẩm bánh mì 10 1.1.2.4 Thu nhận enzym 10 1.1.2.5 Thu nhận protein 10 1.1.2.6 Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi 10 1.1.2.7 Ứng dụng nấm men tạo sản phẩm chữa bệnh 11 1.1.3 Ứng dụng dịch thuỷ phân nấm men 11 1.1.3.1 Sử dụng làm chất điều vị 11 1.1.3.2 Sản xuất số sản phẩm truyền thống 12 1.1.3.3 Sử dụng làm môi trường vi sinh vật 13 1.1.3.4 Bổ sung vào trình nấu bia 14 1.1.3.5 Sử dụng tạo số sản phẩm chữa bệnh 14 1.1.3.6 Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi 16 1.2 Tổng quan protease 16 1.2.1 Khái quát protease 16 1.2.1.1 Phân loại protease 16 1.2.1.2 Nguồn gốc protease 18 1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzym 21 1.2.2 Ứng dụng protease thuỷ phân protein 23 1.2.2.1 Ứng dụng điều chế dịch đạm thuỷ phân 24 1.2.2.2 Ứng dụng sản xuất nước mắm 24 1.2.2.3 Ứng dụng trình sản xuất bia 24 1.2.2.4 Ứng dụng chế biến thịt cá 25 1.2.2.5 Ứng dụng ngành công nghiệp khác 25 1.2.3 Một số chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật 25 1.2.3.1 Chế phẩm neutrase 0.8L 25 1.2.3.2 Chế phẩm enzym Flavourzyme 28 1.3 Các phương pháp thủy phân nấm men 29 1.3.1 Phương pháp hoá học 29 1.3.1.1 Thuỷ phân axit 29 1.3.1.2 Thuỷ phân kiềm 30 1.3.2 Phương pháp enzym 30 1.3.2.1 Phương pháp tự phân nấm men 30 1.3.2.2 Phương pháp thuỷ phân có bổ sung enzym protease 30 1.3.3 Phương pháp thuỷ phân enzym kết hợp với axit: 31 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Nguyên vật liệu 32 2.1.1 Nấm men 32 2.1.2 Các chế phẩm enzym 32 2.1.3 Các loại hoá chất sử dụng đề tài 32 2.1.4 Thiết bị sử dụng 33 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzym protease 33 2.2.2 Phương pháp rửa nấm men 35 2.2.3 Phương pháp xác định độ ẩm 35 2.2.4 Nghiên cứu thuỷ phân nấm men 35 2.2.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzym protease 35 2.2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thuỷ phân 36 2.2.4.3 Nghiên cứu xử lý tế bào chế phẩm enzym cereflo 36 2.2.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng trình xử lý nhiệt tế bào đến khả thuỷ phân protein nấm men enzym 37 2.2.5 Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng axit amin 37 2.2.6 Phương pháp sắc ký mỏng 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Xác định độ ẩm nấm men lọc chân không 40 3.2 Xác định hoạt độ enzym protease 40 3.2.1 Xác định hoạt độ enzym protease chế phẩm Flavourzyme 500MG 40 3.2.2 Xác định hoạt độ enzym protease chế phẩm neutrase 0.8L 41 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm flavourzyme 500MG 41 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ flavourzyme 41 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thuỷ phân 43 3.4 Nghiên cứu xử lý tế bào chế phẩm enzym cereflo 44 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng trình xử lý nhiệt tế bào đến khả thuỷ phân protein nấm men 46 3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm neutrase 0.8L 48 3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thuỷ phân 48 3.6.2 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzym neutrase thời gian thuỷ phân 50 3.7 So sánh hiệu thuỷ phân chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme phương pháp tự phân 51 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 MỞ ĐẦU Ngành công nghệ sản xuất bia Việt Nam ngày phát triển Sản lượng bia Việt Nam tăng từ 1,29 tỷ lít vào năm 2003; 1,37 tỷ lít năm 2004; 1,5 tỷ lít năm 2005 đạt 1,7 tỷ lít vào năm 2006 Nấm men bia tác nhân quan trọng thiếu tham gia trực tiếp vào trình lên men bia Sau lên men, lượng lớn nấm men thải Trung bình sản xuất 100 lít bia thải mơi trường lít men có thuỷ phần 88% Men bia có hàm lượng protein cao trung bình khoảng 50% (tính theo chất khơ), thành phần protein có đầy đủ acid amin, đặc biệt acid amin khơng thay Ngồi ra, cịn chứa chất khống, giàu vitamin nhóm B, nhóm D chất kích thích sinh trưởng Trong g chất khơ nấm men chứa 300 μg vitamin B1, 40 μg vitamin B2, 50μg vitamin B6, 600μg vitamin PP, 80μg axit pantoteic, 25μg axit folic, 1μg biotin 500μg inozit Trên giới, nấm men bia quan tâm nghiên cứu tận dụng với nhiều mục đích khác làm thực phẩm, làm nguồn thuốc bổ giàu axit amin vitamin Tuy nhiên Việt Nam nhà máy sản xuất bia chưa ứng dụng men bia thải cách hiệu quả, men thải từ nhà máy bia sử dụng chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi, khả khai thác thành phần có giá trị sinh học men bia để tạo sản phẩm ứng dụng cho người cịn hạn chế Hơn nữa, khơng sử dụng triệt để nguồn bã nấm men cịn ngun nhân gây nhiễm mơi trường Xuất phát từ điều với gợi ý giáo viên hướng dẫn, để góp phần tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cho người nguồn tận thu nấm men bia, em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men” Nội dung bao gồm: - Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thuỷ phân nấm men bia chế phẩm enzim Neutrase Flavourzyme (điều kiện nhiệt độ, nồng độ enzim, thời gian) so sánh với trình tự phân nấm men - Nghiên cứu xử lý tế bào chế phẩm enzym cereflo - Nghiên cứu ảnh hưởng trình xử lý nhiệt tế bào đến khả thuỷ phân protein nấm men enzym - Định tính số thành phần axit amin quan trọng sản phẩm thuỷ phân CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nấm men Saccharomyces ứng dụng 1.1.1 Giới thiệu Saccharomyces Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp Ascomycetes, ngành nấm Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, khơng di động, có khả sinh sản nhanh, sinh sản chủ yếu phương pháp nảy chồi Sinh khối chúng giàu protein, vitamin lipit Tế bào nấm men thuộc loại Eucaryot (nhân thật), có khả hơ hấp yếm khí tuỳ tiện Chúng phân bố rộng rãi thiên nhiên đất, nói đất mơi trường tự nhiên để giữ giống nấm men đặc biệt bề mặt nhiều loại cây, loại hay loại lương thực thực phẩm khác Nấm men có khả lên men loại đường để tạo thành rượu điều kiện yếm khí, cịn điều kiện hiếu khí chúng tạo thành sinh khối tế bào Vì thế, nấm men ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo,… [18], [23], [25], [26], [34] 1.1.1.1 Hình dạng kích thước tế bào nấm men Nấm men thuộc lồi khác thường có hình dạng khác Ngay lồi, hình dạng tế bào thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện sống tuổi đời Trong mơi trường đặc biệt nấm men có hình dạng ổn định Đa số nấm men có hình ovan, hình bầu dục, hình trịn Nấm men có hình trịn, hình trứng Saccharomyces cerevisiae, hình elip Saccharomyces ellipsoideus, hình chanh Saccharomyces apiculatus, đơi có hình chai Saccharomyces ludwigii So với vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men có kích thước tương đối lớn Một số nấm men sử dụng công nghệ thực phẩm thng cú kớch thc khong ữ ì ÷ 10µm [34] Kích thước thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống,… Tế bào nấm men tự nhiên đứng riêng lẻ sau nảy chồi dính vào tạo thành chuỗi Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Hiện Thế Giới Việt Nam sử dụng hai loại nấm men bia, nấm men (Saccharomyces cerevisiae) nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước 2.5-10 µm chiều rộng 4.5-21 µm chiều dài 1.1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men Nấm men sinh vật đơn bào, hiển vi, tế bào giống động vật, thực vật So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có tiến hố nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn Cùng với tiến hoá nhân chế phân chia nhân (nhân có màng, nhiễm sắc, phân bào có tơ,…), thể nhân chuẩn xuất nhiều thể không thấy thể nhân sơ như: Ti thể, lục lạp,… [26] 3.6.2 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzym neutrase thời gian thuỷ phân Để xác định tỉ lệ chế phẩm enzym neutrase 0.8L thích hợp cần bổ sung Ta tiến hành mẫu thí nghiệm với nhiệt độ thuỷ phân 50 0C tỉ lệ enzym bổ sung khác nhau: - Mẫu 1: Không bổ sung enzym - Mẫu 2: Bổ sung 0.1% enzym (0.01ml enzym/10g nấm men) - Mẫu 3: Bổ sung 0.2% enzym (0.02ml enzym/10g nấm men) - Mẫu 4: Bổ sung 0.3% enzym (0.03ml enzym/10g nấm men) Sau lại lấy mẫu lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (mục 2.2.5) Kết trình bày hình 3.6 bảng 3.7 (xem phụ lục) 60 Lượng axit amin, g/100g men khô 50 40 Không bổ sung enzym 30 Bổ sung 0.1% enzym Bổ sung 0.2% enzym 20 Bổ sung 0.3% enzym 10 Thời gian, h 0 12 16 20 24 28 32 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men 50 Kết thu cho thấy: Việc bổ sung chế phẩm enzym neutrase 0.8L vào làm hiệu thuỷ phân tăng hẳn so với mẫu không bổ sung enzym Cụ thể là, sau 16 thuỷ phân hàm lượng axit amin tạo thành mẫu so sánh với mẫu đối chứng không bổ sung enzym sau: Tăng 29 % (đạt 45.6g) mẫu bổ sung 0.1% enzym, tăng 45.5% (đạt 51.44 g) mẫu bổ sung 0.2% enzym, tăng 45.5 % (đạt 51.44 g) mẫu bổ sung 0.3% enzym Nồng độ enzym 0.3% cho lượng axit amin tạo thành cao nồng độ enzym 0.2% chút 12 Nhưng sau 12 thuỷ phân, đường biểu diễn nhập làm một, tức hiệu thuỷ phân chúng Lượng axit amin tạo thành tất mẫu tăng mạnh thời gian thuỷ phân từ 0-16 giờ, sau 16 thuỷ phân lượng axit amin tạo thành tăng chậm nhiều (axit amin tạo thành mẫu bổ sung 0.2 % enzym tăng 32 % tăng thời gian thuỷ phân từ lên 12 giờ, tăng 16.8 % tăng thời gian thuỷ phân thuỷ phân từ 12 lên 16 giờ, tăng 3.65 % tăng thời gian thuỷ phân từ 16 lên 20 giờ) Vì vậy, ta chọn thời gian thuỷ phân 16 thơi gian thích hợp để tiến hành phản ứng thuỷ phân 3.7 So sánh hiệu thuỷ phân chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme phương pháp tự phân Các enzym protease có nguồn gốc khác khả phân cắt chúng lên mạch protein khác Kết hàm lượng axit amin tạo thành dịch thuỷ phân cấu tỉ lệ thành phân sản phẩm khác Để so sánh hiệu thuỷ phân chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme phương pháp tự phân, ta chọn điều kiện thuỷ phân cho mẫu điều kiện thích hợp cho hoạt động nó, tức là: Đối với chế phẩm enzym flavourzyme: Thuỷ phân điều kiện tối ưu nồng độ enzym 1%, nhiệt độ thuỷ phân 550C Đối với chế phẩm enzym neutrase: Thuỷ phân điều kiện tối ưu nồng độ enzym 0.2%, nhiệt độ thuỷ phân 500C Đối với mẫu tự phân: Chọn nhiệt độ tự phân 50 0C (cho hàm lượng axit amin tạo thành cao 550C) 51 Hàm lượng axit amin, g/100g men KTĐ Kết trình bày hình 3.7 70 60 50 40 30 20 10 tự phân 12 16 neutrase 20 24 Thời gian, flavourzyme Hình 3.7 So sánh khả thuỷ phân flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân Từ đồ thị cho thấy: Hàm lượng axit amin tạo thành mẫu thuỷ phân flavourzyme cao mẫu thuỷ phân neutrase mẫu tự phân Hiệu suất thuỷ phân đạt cao mẫu sau 16 thuỷ phân mẫu thủy phân flavourzyme mẫu thuỷ phân neutrase Sau 16 thuỷ phân, hàm lượng axit amin tạo thành mẫu thuỷ phân enzym flavourzyme neutrase cao mẫu tự phân tương ứng 78% 45.5% Vậy thủy phân flavourzyme (1% enzym, 550C) cho hiệu thuỷ phân cao sử dụng enzym neutrase phương pháp tự phân 3.8 Định tính thành phần axit amin dịch thuỷ phân nấm men Để khảo sát thành phần axit amin dịch thuỷ phân nấm men, em tiến hành theo phương pháp sắc ký mỏng hệ dung môi n-butanol axit axetic - nước (3:1:1) (xem mục 2.2.6) 52 Bao gồm mẫu phân tích Trong có mẫu axit amin chuẩn Mẫu 1: Dịch axit amin sản phẩm thuỷ phân 16 sử dụng 0.2% chế phẩm neutrase 0.8L (kí hiệu N) Mẫu 2: Dịch axit amin sản phẩm thuỷ phân 16 sử dụng 1% chế phẩm flavourzyme 500MG (kí hiệu F) Mẫu 3: Dung dịch axit glutamic chuẩn ( kí hiệu Glu) Mẫu 4: Dung dịch Leucin chuẩn (kí hiệu Leu) Mẫu 5: Dung dịch Lysin chuẩn (kí hiệu Lys) Mẫu 6: Dung dịch Methionin chuẩn (kí hiệu Met) Thời gian chạy sắc ký Kết thể sắc ký đồ hình 3.8 N F Glu Leu Hình 3.8 Sắc ký đồ Kết thu sắc ký đồ cho thấy: 53 Lys Met Thành phần axit amin dịch thuỷ phân sử dụng chế phẩm neutrase dịch thuỷ phân sử dụng chế phẩm flavourzyme không khác nhiều Hai dung dịch tạo vệt tương ứng với quãng đường chạy, kích thước, độ rõ vệt tương tự sắc ký đồ Dung dịch thuỷ phân thu sử dụng flavourzyme neutrase có axit amin chiếm thành phần nhiều So với vệt axit amin chuẩn, thấy dung dịch mẫu N F chứa Lysin Theo tài liệu tham khảo, lysin thành phần axit amin chiếm tương đối nhiều dịch thuỷ phân nấm men (3.2% theo [27]) Trên sắc ký đồ cho thấy có mặt Leucin dịch thủy phân mẫu N F Leucin thành phần axit amin có sản phẩm thuỷ phân nấm men , chiếm 2.9% [27] Giá trị R axit amin chuẩn sắc ký đồ sau: Axit glutamic RGlu = 0.3, Leucin RLeu = 0.68, Lysin RLys = 0.14, methionin RMet = 0.61 Độ lớn giá trị không với [37], thứ tự độ lớn với [37] tức theo [37] RLys < RGlu < RMet < RLeu Vì vậy, ta dựa vào giá trị R thu giếng sắc ký đồ dung dịch thuỷ phân để dự đoán thành phần xuất sắc ký đồ - Vệt số số có qng đường chạy khơng trùng với axit amin chuẩn Các axit amin vị trí có giá trị R nằm khoảng R lysin leucin Vệt có quãng đường chạy xa axit glutamic nên ta dự đốn vệt valin (2.3% dịch thuỷ phân [27]), alanin (chiếm 3.4% dịch thuỷ phân [27]) Vệt số có quãng đường chạy ngắn methionin nên ta dự đốn vệt số valin (chiếm 2.3% dịch thuỷ phân [27]) Tóm lại khảo sát sơ sắc ký lớp mỏng để khẳng định sản phẩm thủy phân nấm men có chứa axit amin khơng thay quan trọng người động vật, đặc biệt Lysin, Leucin 54 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, em rút kết luận sau: Đã nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzym, nhiệt độ thời gian đến khả thuỷ phân nấm men chế phẩm Flavourzyme 500MG - Nồng độ enzym thích hợp 1% - Nhiệt độ thuỷ phân tối ưu 550C - Thời gian thuỷ phân thích hợp 16 - Hiệu thuỷ phân tăng 78% so với trình tự phân (3.3.1) Đã nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzym, nhiệt độ thời gian đến khả thuỷ phân nấm men chế phẩm neutrase 0.8L - Nồng độ enzym thích hợp 0.2% - Nhiệt độ thuỷ phân tối ưu 500C - Thời gian thuỷ phân thích hợp 16 - Hiệu suất thuỷ phân tăng 45.5% so với trình tự phân (3.6.2) Quá trình xử lý nhiệt tế bào đem lại hiệu thuỷ phân thấp nhiều so với trình tự phân Sự kết hợp sử dụng enzym β-glucanase (cereflo) enzym protease (neutrase) cho hiệu thuỷ phân khơng cao Đã định tính thành phần dịch thuỷ phân nấm men - Thành phần dịch thuỷ phân chế phẩm flavourzyme neutrase có chứa axit amin tương tự - Thành phần dịch thuỷ phân chế phẩm flavourzyme neutrase có chứa lysin leucin 55 KIẾN NGHỊ Qua trình nghiên cứu, em xin đề xuất số ý kiến sau: - Tiến hành thử nghiệm sản xuất sản phẩm thuỷ phân nấm men bia với quy mô rộng chế phẩm flavourzyme - Khai thác thêm ảnh hưởng yếu tố khác (pH, chất kìm hãm, chất hoạt hố,…) đến q trình thuỷ phân nấm men bia enzym protease - Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thuỷ phân nấm men bia enzym khác - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện tối ưu để công phá thành tế bào nấm men phương pháp khác - Nghiên cứu phương pháp giảm hàm lượng acid nucleic dịch phân - Tiếp tục nghiên cứu thành phần dịch thuỷ phân nấm men 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, 2000 Sử dụng chế phẩm sinh học chăn nuôi Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998 Công nghệ enzym NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 1998 Hoá sinh học NXB Giáo dục Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, 1997 Thực hành hoá sinh học NXB Giáo dục Densikow, M.T., 1963 Tận dụng phế liệu công nghệ thực phẩm (Nguyễn Văn Đạt – Bùi Huy Thanh dịch) NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tống Thị Anh Đào, Lê Văn Nhương, Nguyễn Đức Lượng, 1999 Thu nhận enzym superoxit dismutaza theo công nghệ nghiền tế bào Saccharomyces cerevisiae Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 37(5): tr 20 25 Nguyễn Văn Đạt, Ngô Văn Tàm, 1974 Phân tích lương thực thực phẩm Bộ Lương thực – Thực phẩm Quản Lê Hà, 1999 Nghiên cứu số đặc tính ứng dụng hệ enzym thuỷ phân tinh bột protein sản xuất đồ uống Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sản phẩm lên men nước uống khơng có rượu Trường ĐHBK Hà Nội 57 Nguyễn Ngọc Hải, 1994 Nấm men công nghệ sinh học Viện Di truyền Nông Nghiệp 10 Vương Thị Việt Hoa, Nguyễn Hải Sự, Đặng Ngọc Thuỳ Dương, 2005 Tận dụng men dư thừa từ nhà máy bia để sản xuất yeasts extract bột dùng môi trường ni cấy vi sinh Tạp chí khoa học kỹ thuật Nơng Lâm nghiệp, TP Hồ Chí Minh, (2) 11 Hồng Đình Hịa, 2002 Cơng nghệ sản xuất malt bia NXB Khoa Học Kĩ Thuật 12 Trương Thị Hoà, 1994 Nghiên cứu ứng dụng protease sản xuất bia 13 Nguyễn Văn Hồng, 2004 Báo cáo tuyển tập hội nghị khoa học Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym protease dùng để thay số chất xúc tác hố học cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 14.http:// www.forum.hanoifishing.com/showthread.php?t=2424 15.http://www.google.com.vn/search?q=thu%E1%BB%B7+ph%C3%A2n +protein&hl=vi&start=40&sa=N 16 http:// www.nanogenpharma.com 17 http:// www.novozymes.com 18 Khoa học - Công nghệ - Môi trường Tuyên Quang Chế biến thức ăn gia súc gia cầm Nhà xuất văn hố dân tộc, tr 18-20 19 Ngơ Tuấn Kỳ, 1988 Enzym đời sống NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 20 Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, 2005 Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 19 21 Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự, Thái Thị Hảo, Trần Việt Lan, 1998 Ứng dụng enzym protease để rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm Viện Công nghiệp Thực phẩm 22 Lê Văn Việt Mẫn, Phạm Quốc Chương, 2007 Nghiên cứu cải thiện trình lên men nồng độ cao sản xuất bia Đại học Quốc Gia, TP Hồ Chí Minh, 10 (6): tr 66-70 58 23 Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thâm Minh Hoàng, Nguyễn Ngọc Tuyết Sương, 2006 Nghiên cứu trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase Tạp chí phát triển Khoa học Cơng nghệ, (12) 24 Lê Văn Việt Mẫn, Phạm Quốc Chương, 2007 Nghiên cứu cải thiện trình lên men nồng độ cao sản xuất bia Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 25 Lao Thị Nga, 1987 Kỹ thuật sản xuất nấm men bánh mì số lồi nấm ăn NXB TP Hồ Chí Minh 26 Lương Đức Phẩm, 2005 Nấm men công nghiệp NXB Khoa học Kỹ thuật 27 Lê Xuân Phương, 2001 Vi sinh vật công nghiệp NXB Xây dựng, Hà Nội 28 Nguyễn Phương, 2007 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sấy phun để thiết kế chế tạo thiết bị sản xuất bột đậu nành uống liền bột nấm men giàu protein khống chất Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Hà Nội 29 Lường Văn Sơn, Trinh Xuân Bài, Hà Thị Hạnh, Lê Đức Lễ, 1999 Nghiên cứu sử dụng sinh khối nấm men bia nhà máy bia Thanh Hoá sản xuất thuốc ống uống Biofil quy mô công nghiệp Công ty cổ phần Dược - Vật tư Y tế Thanh Hoá 30 Lâm Xuân Thanh Nghiên cứu phương pháp biến hình protein đậu tương ứng dụng công nghiệp thực phẩm Luận văn phó tiến sĩ khoa học kỹ thuật, ĐHBK Hà Nội 31 Quản Văn Thịnh, 1978 Sinh tổng hợp enzym protease từ chủng nấm mốc Asp Oryzae VN1 ứng dụng sản xuất nước chấm Luận án phó tiến sĩ Khoa học kỹ thuật, Trường ĐHBK Hà Nội 32 Nguyễn Bích Thuỷ, năm Nghiên cứu sử dụng số enzym thuỷ phân sản xuất bia Luận văn thạc sĩ ngành công nghệ thực phẩm, ĐHBK Hà Nội 33 Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thanh Trà, Lương Đức Phẩm, năm Nghiên cứu thu nhận chế phẩm proteaza từ Aspergillus oryzae TP-98 phương pháp nuôi cấy bề mặt Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 59 34 Đặng Trung Trụ Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ lên men đến thoái hoá nấm men sản xuất bia Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm, ĐHBK Hà Nội 35 Trường đại học Y Hà Nội, 2001 hoá sinh NXB Y học 36 Hoàng Vân, 2004 Một số nét enzym sử dụng chất tẩy rửa Tạp chí Cơng nghệ Hố Chất, 37 Đào Hữu Vinh Nguyễn Xuân Dũng Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Việt Hùng, 1985 Các phương pháp sắc ký Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 38 Anna Halász, Radomir Lásztity, 1991 Use of yeast biomass in food production CRC press, Boca Raton Ann Arbor Boston 39 Behalova B and Berank, 1986 Autolysis of disintegrated cells of the yeasts Saccharomycess cerevisiae Acta biotechnology Vol 6; pp 147 – 152 40 Carl C.Lindegren, 1949 The yeast cell Educat.publ 41 Champagne C.P., Gaudreau H., Conway J., 2003 Effect of the production or use of mixtures of bakers’ or brewers’ yeast extract on their ability to promote growth of lactobacilli and pediococci Electronic journal of biotechnology, vol 60 42 Conway J, Gaudreau.H, Champagne C.P., 2001 The effect of the addition of proteases and glucanases during yeast autolysis on the production and properties of yeast extraxt Canadian J of Microbiology Vol.47, Number 1, pp 18-24 43 F.G Walter, 1953 The manufacture of compressed yeast Chapman and Hall 44 Hanlon GW, Hodges NA, Russel AD, 1982 The influence of glucose, ammonium and magnesium by A.oryzae- J.Gen microbial 128, pp 845-851 45 H.d.A.H Cook, 1958 The chemistry and biology of yeasts Acad 46 Henry J Peppler, 1973 Yeast technology Avi Publ Co., 47 J Ladder, Rij N.j W Kreger – Van, 1967 The yeast North – Holland 48 K Arima, H.d w Roman, 1957 Yeasts W.Junk Publ 49 Owen P Ward, 1983 Properties of microbial protease – Microbial enzymes and biotechnology, pp 263-281 50 Schanus, Edward G, Mcpherson, Marinelle, 1994 Yeast extract from Candida utilis, production and use as emulsifier of same 51 Tatjana Vukasinovic Milic, Marica Rakin and Slavica SilerMarinkovic, 2006 Utilization of baker’s yeast (Saccharomyces cerevisiae) for the production of yeast extract: effect of different enzymatic treatments on solid, protein and carbohydrate recovery J Serb Soc 72(5) PHỤ LỤC Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men TGTP, Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Không bổ sung enzym 0.1% enzym 0.4% enzym 61 0.7% enzym 1% enzym 2% enzym 27.86 31.75 35.58 37.04 39.61 42.36 16 33.40 38.25 47.43 49.05 59.47 62.0 24 33.83 38.83 48.74 54.34 63.20 64.66 32 39.08 50.73 52.18 56.28 63.88 64.66 40 42.31 54.60 54.60 59.06 64.60 66.0 Bảng 3.3 Ảnh hưỏng nhiệt độ đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm Flavourzyme TGTP, Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) 450C 500C 550C 600C 2.67 12.26 22.34 3.25 11.18 31.36 39.61 10.39 12 16.17 43.40 51.21 14.71 16 31.46 44.22 59.47 23.69 20 43.69 48.54 62.96 28.98 24 46.84 52.52 63.20 38.30 28 49.63 55.58 63.88 39.06 32 52.54 57.62 63.88 42.07 Bảng 3.4 Ảnh hưởng xử lý tế bào chế phẩm enzym cereflo đến khả thuỷ phân protein nấm men TGTP, Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Không bổ sung enzym 0.1% neutrase 28.40 32.08 0.1% cereflo 0.2% cereflo 0.1% neutrase 0.1% neutrase 33.32 35.66 62 0.4% cereflo 0.1% neutrase 35.77 16 35.37 45.60 46.28 48.98 48.22 24 40.26 49.35 50.26 52.38 52.11 32 42.38 53.08 53.22 54.29 54.32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng trình xử lý nhiệt tế bào đến khả thuỷ phân protein nấm men TGTP, Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Xử lý 800C (15 phút), Tự phân 0.1% neutrase 0.1% enzym neutrase 1.45 28.40 32.08 16 2.98 35.37 45.60 24 3.06 40.26 49.35 32 3.84 42.38 53.08 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm neutrase 0.8L TGTP, Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) 450C 500C 550C 13.27 23.88 16.52 29.46 36.09 21.71 63 12 39.03 46.14 35.94 16 48.69 51.44 41.51 20 51.44 53.52 42.79 24 52.66 55.29 43.28 28 52.89 55.29 44.79 32 55.06 55.48 45.81 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men TGTP, Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Không bổ sung enzym 0.1% neutrase 0.2% neutrase 0.3% neutrase 12.35 16.58 19.64 23.88 28.40 32.08 33.38 36.09 12 33.08 38.53 44.03 46.14 16 35.37 45.60 51.44 51.44 20 38.83 46.97 53.32 53.52 24 40.26 49.35 54.48 55.29 28 41.25 51.04 54.72 55.29 32 42.38 53.08 54.72 55.48 64