Nghiên Cứu Nuôi Cấy In Vitro Cây Dương Đồng (Adinandra Sp.).Pdf

Untitled ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ MAI NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO CÂY DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra sp ) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG[.]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ MAI NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO CÂY DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra sp.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ MAI NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO CÂY DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra sp.) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thu Ngà Thái Nguyên, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020 Tác giả luận văn Phan Thị Mai XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TS Nguyễn Thị Thu Ngà i LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thu Ngà, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ em trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Sinh học đại Giáo dục sinh học, phận Sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình học tập hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, thầy kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp em suốt trình nghiên cứu Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp bạn bè động viên, khuyến khích giúp đỡ em tiến trình học tập hồn thành luận văn Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020 Tác giả luận văn Phan Thị Mai ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU .1 Lý chọn đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) 1.1.1 Nguồn gốc phân loại .3 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị dược liệu chi Dương đồng 1.2 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA phân loại thực vật 1.2.1 Một số thành tựu sử dụng mã vạch DNA phân loại thực vật .7 1.2.2 Một số thành tựu sử dụng mã vạch DNA phân loại loài thuộc họ Chè (Theaceae) .9 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.3.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.3.2 Một số thành tựu nuôi cấy in vitro 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 18 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 18 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2 Các phương pháp nghiên cứu .20 2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 20 iii 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21 2.2.3 Phương pháp phân tích xử lý số liệu .25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Nghiên cứu định danh mẫu thuộc chi Dương đồng DNA barcode .26 3.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số 26 3.2.2 Kết khuếch đại phân tích trình tự nucleotide vùng gen sử dụng cặp mồi ITS2 ITS4 26 3.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro mẫu thuộc chi Dương đồng 30 3.2.1 Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu 30 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP nước dừa đến sinh trưởng mẫu Dương đồng 36 3.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến sinh trưởng mẫu Dương đồng 43 3.2.4 Nghiên cứu khả tạo rễ Dương đồng 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 Kết luận 51 Kiến nghị 51 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách loài thuộc chi Adinandra Việt Nam Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm định danh loài .19 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng thí nghiệm .19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân cặp mồi ITS2 ITS4 .21 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 21 Bảng 3.1 Danh sách vùng gen ITS sử dụng nghiên cứu với mẫu Dương đồng .29 Bảng 3.2 Kết tạo nguồn vật liệu ban đầu từ đoạn thân mang chồi nách 31 Bảng 3.3 Kết tạo nguồn vật liệu ban đầu từ hạt Dương đồng .33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến sinh trưởng mẫu Dương đồng 37 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nước dừa đến sinh trưởng mẫu Dương đồng 39 Bảng 3.6 Ảnh hưởng BAP nước dừa đến sinh trưởng mẫu Dương đồng .42 Bảng 3.7 Ảnh hưởng GA3 đến sinh trưởng mẫu Dương đồng 44 Bảng 3.8 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Dương đồng 46 Bảng 3.9 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ Dương đồng 48 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh vùng gen ITS Hình 1.2 Cặp mồi ITS2 ITS4 sử dụng để khuếch đại khu vực ITS Hình 2.1 Thân, hạt Dương đồng thu thập Lào Cai 18 Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số 26 Hình 3.2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR vùng gen ITS .26 Hình 3.3 Trình tự nucleotide vùng gen sử dụng mồi ITS2 phân lập từ mẫu Dương đồng thu thập tỉnh Lào Cai 27 Hình 3.4 Trình tự nucleotide vùng gen sử dụng mồi ITS4 phân lập từ mẫu Dương đồng thu thập tỉnh Lào Cai 27 Hình 3.5 Kết BLAST trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS2 28 Hình 3.6 Kết BLAST trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS4 28 Hình 3.7 Sơ đồ mơ tả mối quan hệ di truyền số loài thuộc chi Adinandra dựa trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS2 .29 Hình 3.8 Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền số lồi thuộc chi Adinandra dựa trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS4 .30 Hình 3.9 Đoạn thân mang chồi nách khử trùng Javen 60% .32 Hình 3.10 Hạt Dương đồng khử trùng 35 Hình 3.11 Cây Dương đồng môi trường BAP .38 Hình 3.12 Cây Dương đồng môi trường nước dừa 40 Hình 3.13 Cây Dương đồng mơi trường BAP nước dừa 41 Hình 3.14 Cây Dương đồng môi trường GA3 .45 Hình 3.15 Cây Dương đồng môi trường IBA 47 Hình 3.16 Cây Dương đồng mơi trường IAA .49 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt APG II Tên đầy đủ An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the ordors and families of flowering plants (Hệ thống phân loại thực vật) BAP 6-Benzyl Amino Purin Bp Base pair Cs Cộng CT Công thức DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Etylen diamin tetraxetic Acid GA3 Gibberellic Acid IAA Indoly Acetic Acid IBA Indoly Butyric Acid ITS Internal transcribed space (Vùng gen ITS) KT Khử trùng MS Murashige - Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) vi MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Chi Dương đồng (Adinandra) thuộc họ chè (Theaceae), gồm số loài khác như: Adinandra annamensis Gagnep (Dương đồng, Súm đỏ, Xúm, Hồng đạm trung bộ), Adinandra bockiana Pritz ex Diels (Dương đồng bốc, Hồng đạm tam đảo), Adinandra var acutifolia (Hand.-Mazz.) Kobuski (Dương đồng bốc nhọn, Hồng đạm nhọn), Adinandra caudata Gagnep (Dương đồng đuôi, Sum đuôi, Sô lô, Ko sa num, Hồng đạm đuôi) Adinandra glischroloma Hand.-Mazz var hirta (Gagnep.) Kobuski (Sum lông, Hồng đạm lông) Theo sách đỏ Việt Nam, loài chi Adinandra nguồn gen hiếm, phân bố hẹp số tỉnh Lào Cai, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Hà Giang, Lâm Đồng Các hợp chất có thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng để chữa bệnh giảm huyết áp, kháng viêm, chống độc giảm đau Ngoài ra, thuộc họ Chè chứa tinh dầu, hợp chất có vai trị quan trọng lĩnh vực y học Nhờ hợp chất có mà từ xưa y học cổ truyền sử dụng loài thuộc chi Adinandra làm thuốc điều trị bệnh ung thư vòm họng, đau dày, rắn cắn, Cây Sum millett (A millettii) sử dụng điều trị đau dày; Sum nguyên A integerrima dùng để trị bong gân, rắn cắn Lá thân Sum đỏ hay Sum Hải Nam A Hainanensis (A rubropunctata) dùng cho trường hợp viêm, ung thư vòm họng [4] Lồi Adinandra glischroloma xác định có số tỉnh thuộc Trung Quốc Việt Nam Loài đưa vào sách đỏ mức độ bị đe dọa cấp T cần bảo vệ Loài Adinandra megaphylla Hu đưa vào sách đỏ Việt Nam mức độ nguy cấp (VU) cần bảo vệ [1] Với giá trị dược liệu đáng quý loài thuộc chi Dương đồng việc bảo tồn phát triển để tạo nguồn nguyên liệu dồi nhằm phục vụ việc khai thác dược liệu quý vấn đề cần thiết Việc bảo tồn giống dược liệu nói chung lồi thuộc chi Dương đồng nói riêng thực nhiều biện pháp truyền thống chiết cành, ghép cành gieo hạt Tuy nhiên hiệu đạt chưa cao, khó khăn chọn cành chiết - ghép, tỉ lệ hạt nảy mầm yếu… Thực trạng đặt vấn đề cần giải Với phát triển lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật, đặc biệt kỹ thuật nhân giống in vitro cho phép tạo lượng lớn thời gian ngắn Việc sử dụng kỹ IAA tác động đến trình phát sinh rễ IBA IAA chất kích thích chủ yếu tác động lên trình phân chia tế bào hình thành rễ Để chồi in vitro Dương đồng phát triển thành hoàn chỉnh ống nghiệm, chúng tơi thăm dị ảnh hưởng riêng rẽ IBA IAA đến phát sinh rễ Dương đồng 3.2.4.1 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ Dương đồng Các chồi in vitro Dương đồng có chiều cao từ cm, - chúng tơi sử dụng để thăm dị mơi trường nuôi cấy Chồi in vitro nuôi cấy mơi trường có chứa IBA nồng độ khác để nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến hình thành rễ Cây cắt bỏ bớt lá, cấy vào môi trường MS + đường sucrose 30 g/l + agar g/l + IBA thay đổi nồng độ Môi trường đối chứng MS + đường sucrose 30 g/l + agar g/l Mỗi công thức mơi trường cấy 30 chồi Theo dõi hình thành rễ chồi sau 4, tuần Kết theo dõi thể bảng 3.8 hình 3.15 Bảng 3.8 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Dương đồng Công thức Nồng độ IBA (mg/l) Số lượng rễ Chiều dài Chất lượng rễ (cm) rễ Sau tuần CT1 (ĐC) 0 CT2 0,3 1,80±0,06 0,30±0,04 + CT3 0,5 2,30±0,04 0,37±0,04 ++ CT4 0,7 2,93±0,04 0,42±0,03 ++ CT5 0,9 2,53±0,07 0,40±0,03 ++ Sau tuần CT1 (ĐC) 0 CT2 0,3 3,48±0,08 0,46±0,06 + CT3 0,5 4,98±0,04 0,49±0,07 ++ CT4 0,7 5,53±0,05 0,65±0,01 +++ CT5 0,9 5,03±0,10 0,58±0,06 +++ Sau tuần CT1 (ĐC) 0 CT2 0,3 5,13±0,05 0,59±0,02 + CT3 0,5 5,43±0,05 0,67±0,01 ++ CT4 0,7 7,93±0,04 0,89±0,01 +++ 46 CT5 0,9 6,83±0,07 0,75±0,03 +++ Ghi chú: (+) rễ ngắn, nhỏ, màu vàng; (++): rễ bình thường, màu trắng; (+++): rễ mập, dài, có rễ phụ, màu trắng Kết bảng 3.8 cho thấy, mơi trường thí nghiệm có bổ sung IBA cho tiêu theo dõi cao đối chứng Sau tuần, số rễ trung bình đạt từ 1,80 - 2,93 rễ/chồi; sau tuần, số rễ trung bình đạt từ 3,48 - 5,53 rễ/chồi; sau tuần, số rễ trung bình đạt từ 5,13 - 7,93 rễ/chồi Trong đó, mơi trường bổ sung IBA 0,7 mg/l cho hiệu qủa tạo rễ tốt Sau tuần, số rễ trung bình đạt 7,93 rễ/chồi Nồng độ IBA ảnh hưởng đến phát triển chiều dài rễ Dương đồng Chiều dài trung bình rễ tăng dần nồng độ IBA môi trường nuôi cấy tăng từ 0,3 - 0,9 mg/l Chiều dài trung bình rễ tăng cao mơi trường có bổ sung IBA nồng độ 0,7 mg/l, đạt 0,89 cm Khi tiếp tục tăng nồng độ IBA chiều dài trung bình rễ giảm A B Hình 3.15 Cây Dương đồng môi trường IBA A Cây Dương đồng môi trường đối chứng B Cây Dương đồng môi trường IBA 0,7 mg/l sau tuần Xét đồng thời tiêu theo dõi thí nghiệm cho thấy, môi trường tối ưu nồng độ nghiên cứu cho việc tạo rễ Dương đồng môi trường bổ sung IBA 0,7 mg/l Trên môi trường này, số rễ/chồi đạt 7,93, chiều dài trung bình 0,89 cm, rễ có nhiều rễ phụ, màu trắng 3.2.4.2 Ảnh hưởng IAA đến phát sinh rễ Dương đồng 47 IAA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sinh trưởng dãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ Dựa đặc tính IAA, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến phát sinh rễ Dương đồng Thí nghiệm tiến hành cơng thức có bổ sung IAA nồng độ khác Kết thu sau nuôi cấy 4, tuần thể bảng 3.9 hình 3.16 Bảng 3.9 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ Dương đồng Công thức Nồng độ IAA (mg/l) Số lượng rễ Chiều dài Chất lượng rễ (cm) rễ Sau tuần CT1 (ĐC) 0 CT2 0,3 1,87±0,05 0,32±0,03 + CT3 0,5 2,30±0,04 0,40±0,05 ++ CT4 0,7 2,13±0,05 0,39±0,07 ++ CT5 0,9 2,23±0,07 0,37±0,06 ++ Sau tuần CT1 (ĐC) 0 CT2 0,3 3,48±0,07 0,46±0,05 + CT3 0,5 4,98±0,06 0,58±0,07 ++ CT4 0,7 4,53±0,05 0,49±0,01 ++ CT5 0,9 4,65±0,09 0,52±0,07 ++ Sau tuần CT1 (ĐC) 0 CT2 0,3 4,93±0,05 0,55±0,04 + CT3 0,5 5,93±0,02 0,67±0,01 +++ CT4 0,7 5,13±0,03 0,59±0,02 ++ CT5 0,9 5,33±0,05 0,61±0,03 ++ Ghi chú: (+) rễ gầy, nhỏ, màu vàng; (++): rễ bình thường, màu trắng vàng; (+++): rễ mập, dài, màu trắng vàng 48 Từ kết trình bày bảng 3.9 cho thấy, tất mơi trường thí nghiệm chồi in vitro hình thành rễ, nhiên khả hình thành rễ chồi Dương đồng khác mơi trường có bổ sung IAA với nồng độ khác Các môi trường có chất kích thích sinh trưởng IAA cho tỉ lệ chồi rễ cao nhiều so với mơi trường đối chứng (mơi trường khơng có chất kích thích sinh trưởng IAA) Trong cơng thức mơi trường có chất kích thích sinh trưởng mơi trường CT3 (mơi trường có IAA 0,5 mg/l) mơi trường cho tỉ lệ chồi rễ cao (sau tuần đạt 5,93 rễ) Mơi trường CT4 CT5 có nồng độ IAA 0,7 0,9 mg/l cao môi trường CT3 có nồng độ IAA 0,5 mg/l tỉ lệ chồi rễ thấp Kết cho thấy, nồng độ IAA cao gây ức chế khả hình thành rễ Dương đồng Vì vậy, thí nghiệm này, công thức môi trường CT3 môi trường chứa IAA thích hợp cho tạo rễ Dương đồng A B Hình 3.16 Cây Dương đồng mơi trường IAA A Cây Dương đồng môi trường đối chứng B Cây Dương đồng môi trường IAA 0,5 mg/l sau tuần Từ kết nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (IBA, IAA) đến phát sinh rễ Dương đồng nhận thấy, môi trường tạo chất lượng rễ tốt Nếu nghiên cứu tạo hồn chỉnh mang đặc điểm hình thái rễ Dương đồng (có rễ rễ phụ), mơi trường bổ sung IBA phù hợp Do vậy, môi trường thích hợp cho tạo rễ Dương đồng phạm vi nghiên cứu đề tài môi trường MS có bổ sung đường sucrose 30 g/l + agar g/l + IBA 0,7 mg/l 49 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận (1) Vùng gen nhân lên sử dụng cặp mồi ITS2 ITS4 từ mẫu nghiên cứu thu tỉnh Lào Cai, Việt Nam phân lập dài 360 357 nucleotide mẫu nghiên cứu thuộc chi Adinandra thông qua phần mềm BLAST NCBI Cây phát sinh chủng loại mối quan hệ di truyền loài thuộc chi Adinandra xây dựng dựa phần mềm MegAlign (2) Hạt Dương đồng khử trùng sơ cồn 70o (1 phút), sau khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% 12 phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm tối ưu đạt 87,33% (3) Trên môi trường MS + đường sucrose 30 g/l + agar g/l + BAP 1,0 mg/l + nước dừa 150 ml/l cho hiệu tạo đa chồi tốt nồng độ nghiên cứu Trên môi trường chồi mập, phát triển tốt, số chồi/mẫu đạt 2,53 sau tuần nuôi cấy (4) Mơi trường tối ưu cho q trình tạo Dương đồng in vitro hoàn chỉnh MS + đường sucrose 30 g/l + agar g/l có bổ sung IBA 0,7 mg/l Rễ phát sinh mập, khỏe, rễ mang nhiều rễ phụ Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu theo dõi sinh trưởng phát triển Dương đồng đến giai đoạn ngồi vườn ươm So sánh phân tích hàm lượng dược chất tự nhiên in vitro 51 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nguyễn Thị Thu Ngà, Phan Thị Mai, Đào Thị Thu Hà, Phạm Thị Hòa, Nguyễn Hữu Quân (2020), “Nghiên cứu hình thái, giải phẫu phương pháp khử trùng tạo mẫu phục vụ nhân giống in vitro Dương đồng Adinandra sp.”, Tạp chí Khoa học Công nghệ , 225(08), tr 134-141 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam phần II - Thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Cơng nghệ Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Văn Phú, Đinh Trường Sơn, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Văn Huấn, Trần Văn Lin, Nguyễn Thị Thùy Linh (2017), “Quy trình nhân giống in vitro Trà hoa vàng (Camellia sp.)”, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2017, 15(12), tr.1664-1678 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Cơng nghệ tế bào thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam (Bộ mới), Nxb Y học Trần Việt Hà, Nguyễn Văn Việt, Đoàn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Huyền, Đinh Văn Hùng, Sounthone Douangmala (2018), “Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhân giống Gừng gió (Zingiber zerumbet)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp, số 6, tr 10-16 Hoàng Đăng Hiếu, Chu Hoàng Hà (2012), “Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định dạng tập đồn Dó Bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh”, Nxb Đại học KHTN - Đại học Quốc gia Hà Nội Trần Thu Hoa, Trần Hoàng Dũng, Nguyễn Lê Huyền Thanh, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trần Hồng Bảo Quyên, Trần Cơng Luận (2013), “Khảo sát đặc tính dược liệu bước đầu định danh trình tự ITS matK cho mẫu Ngải tìm thấy vùng núi Cấm - An Giang”, Tạp chí Dược học, 2, tr 53 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây Cỏ Việt Nam 2, Nxb trẻ, Tp Hồ Chí Minh Lê Thị Tâm Hồng, Lê Thị Thủy Tiên, Trần Văn Minh (2018), “ Bảo tồn phát triển Xạ Đen (Ehretia Asperula Zollinger Et Moritzi) kỹ thuật nuôi cấy đốt thân in vitro”, Hội thảo khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, tr.1602-1607 10 Hà Văn Huân (2014), “Phân lập gen matK từ Sến mật (Madhuca pasquierii) làm ADN mã vạch (DNA barcode) phục vụ giám định lồi”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 13, tr.130-136 53 11 Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “ Xác định đoạn mã vạch DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis): loài đặc hữu Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 5, tr 123-130 12 Lê Hồi Hương, Nguyễn Hồng An Thụy, Bùi Thanh Hịa, Trần văn Minh (2018), “Nghiên cứu nhân giống in vitro ni cấy tế bào thuốc Hồn Ngọc (Pseuderanthemum Palatiferum (Nees) Radlk, Ex Lindau) định lượng hoạt chất tích tụ”, Hội thảo khoa học cơng nghệ sinh học toàn quốc, tr.1608-1614 13 Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh Thị Thu Huệ , Nông Văn Hải , Hà Văn Huân , Lê Thị Thu Hiền (2017), “ Ứng dụng mã vạch DNA hỗ trợ định loại loài số mẫu sâm thuộc chi Nhân sâm (Panax L.)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(1), tr 63-72 14 Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Văn Việt (2017), “Nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakada) kỹ thuật nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp, số 4/2017, tr.17-22 15 Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Trung Thành (2014), “Khảo sát khả nhân giống Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tập 30, số 3/2014 tr.17-25 16 Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nxb Đại Học Quốc gia Hồ Chí Minh 17 Nguyễn Thanh Mai, Nguyễn Sỹ Tuấn (2007), “Ảnh hưởng ABA môi trường nuôi cấy lên tái sinh chồi trực tiếp từ nuôi cấy mẫu chè (Camellia sinensin L.)”, Báo cáo đề tài Khoa học Công nghệ cấp sở, Sở khoa học Công nghệ Lâm Đồng 18 Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), “Đánh giá đa dạng di truyền số loài dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật DNA mã vạch”, Nxb Đại học KHTN - Đại học Quốc gia Hà Nội 19 Nguyễn Quang, Nguyễn Thị Lý Anh (2007), Công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb Đại học Sư phạm 54 20 Nguyễn Hữu Quân, Kiều Thị Trà Giang (2019), “Sử dụng mã vạch DNA matK để định danh mẫu sum liên thu tỉnh Lào Cai, Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Công nghệ ĐHTN, tập 197, số 04, tr 205-210 21 Dương Văn Tăng, Nguyễn Quốc Bình, Đinh Thị Phịng (2011), “Trình tự nucleotide vùng ITS nhân mối quan hệ di truyền loài gỗ quý việt nam: Trắc (Dalbergia cochinchinensis), Cẩm lai (D Oliveri) Sưa (D Tonkinensis)”, Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 4, tr 12961300 22 Nguyễn Tập (2006), “Điều tra thuốc nghiên cứu bảo tồn”, Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nxb Khoa học Kĩ thuật 23 Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Trung Hậu, Trần Văn Minh (2018), “ Nuôi cấy rễ bất định Đinh Lăng nhỏ (Polyscias Fruticosa L Harms) định lượng hoạt chất saponin tích lũy”, Hội thảo khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc, tr.1658-1664 24 Nguyễn Thị Thơ, Vũ Thị Phan, Lê Viết Việt, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Hải Hà, Nguyễn Thùy Linh, Bùi Văn Thắng (2018), “Nghiên cứu nhân giống Râu Hùm (Tacca Chantrieri André) kỹ thuật nuôi cấy in vitro ”, Hội thảo khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, tr.1615-1620 25 Hoàng Minh Trang, Hà Văn Huân, Phạm Thành Trang, Dương Thị Hoa, Vũ Thị Bích Thuận (2016), “Xác định đoạn mã vạch DNA (DNA Barcode) cho loài Hải đường vàng (Camellia tienii Ninh): phục vụ giám định lồi”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, tháng 6, tr 240-246 26 Viện dược liệu (2016), “Danh lục thuốc Việt Nam”, Nxb Khoa học Kĩ thuật 27 Nguyễn Văn Việt, Trần Việt Hà, Khương Thị Thu Hương (2018), “Ảnh hưởng số yếu tố môi trường nuôi đến nhân giống in vitro Trà hoa vàng (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda)”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, tr 163-173 28 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), Nxb Giáo dục, Hà Nội 29 Nguyễn Thị Hải Yến, Trần Thị Thu Hương (2014), “Nghiên cứu khả tái sinh in vitro chè”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 123, số 9/2014, tr.23 - 29 TIẾNG ANH 55 30 Hoang Thanh Son, Luong Van Dung (2014), Adinandra hongiaoensis (Theaceae) a New Species from Lam Dong, Vietnam, J Jpn Bot 89, pp 331-334 31 Chen Y., Chen G., Fu X., Liu R H (2015), Phytochemical Profiles and Antioxidant Activity of Different Varieties of Adinandra Tea (Adinandra Jack), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63 (1), pp 169-176 32 Danso, K., E Azu, W Elegba, A Asumeng, H M Amoatey and G Y P Klu (2011), Effective decontamination and subsequent plantlet regeneration of sugarcane (Saccharum officinarum L.) in vitro, International Journal of Integrative Biology, 11(2), pp 90-96 33 Gao H., Liu B., Liu F., Chen Y (2010), Anti-proliferative effect of camellianin A in Adinandra nitida leaves and its apoptotic induction in human Hep G2 and MCF7 cells, Molecules, 15(6), pp 3878-3886 34 Liu B., Ning Z., Zhan Y., Xu K., Gao J (2008), Characterization and 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl radical scavenging activity of methanol and supercritical carbon dioxide extracts from leaves of Adinandra nitida, Journal of Food Biochemistry 32, pp 431-442 35 Liu B., Yang J., Ma Y., Yuan E., Chen C (2010), Antioxidant and angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activities of ethanol extract and pure flavonoid from Adinandra nitida leaves, Pharmaceutical biology, 48(12), pp 14321438 36 Mondal, T K., A Bhattacharya, A Sood and P S Ahuja (1998), Micropropagation of tea (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) using thidiazuron, Plant Growth Regulation, 26(1): 57-61 37 Osono T (2008), Endophytic and epiphytic phyllosphere fungi of Camellia japonica: seasonal and leaf age - dependent variations, Mycologia, 100 (3), pp 387391 38 Saghai-Maroof M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W (1984), “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: enzymedelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81(24), pp 8014-8018 56 39 Sharma P (2002), “Effect of incorporation of full fat and defatted legume flours on the acceptability and nutritional quality of maize products”, Depff of Food Sciences and Nutrition, CSK.HPKV, Palampur (H.P) 40 Van O., Conklin J (1941), “Factors in Coconut Milk Essential for Growth and Development of Very Young Datura Embryos”, Science, 94, pp 350-351 INTERNET 41 Hà Văn Huân (2015), “Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA (mã vạch DNA) phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam”, http://dnabank.vn/publication?id=28, ngày 13/6/2020 42 SBC Việt Nam (2015), “Nhân giống invitro chè (Camellia sinensis (L) O Kuntze) từ mẫu chè khác nhau”, https://www.sbc-vietnam.com/sanpham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/nhan-giong-invitro-cay-checamellia-sinensis-l.aspx.s 43 Thực vật chí Trung Quốc, http://www.efloras.org/, 10/4/2019 44 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam, http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Adinandra&list=genus, 10/5/2019 45 Viện nghiên cứu phát triển lâm nghiệp (5/2016), https://ifrad.vn/newsContents/view/669-nghien-cuu-nhan-giong-ba-kich-tim.html 46 Viện nghiên cứu phát triển lâm nghiệp (5/2016), https://ifrad.vn/newsContents/view/670-nghien-cuu-nhan-giong-ha-thu-o-do.html 47 https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/theaceae 48 http://www1.vnua.edu.vn/tapchi/Upload/2-2017/9.pdf 49 https://www.hevs.ch/media/document/0/antioxidantcapacityoftea.pdf 50.https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814611014956 57 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH CÂY DƯƠNG ĐỒNG TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU A B Hình 1: Cây Dương đồng môi trường BAP A Cây Dương đồng môi trường BAP nồng độ 1,0 mg/l sau tuần B Cây Dương đồng môi trường BAP nồng độ 1,0 mg/l sau tuần A B C Hình 2: Cây Dương đồng mơi trường GA3 có nồng độ thay đổi sau tuần A Mơi trường có bổ sung GA3 nồng độ 0,3 mg/l B Mơi trường có bổ sung GA3 nồng độ 0,5 mg/l C Mơi trường có bổ sung GA3 nồng độ 0,9 mg/l A B C Hình 3: Cây Dương đồng môi trường nước dừa A Cây trường đồng môi trường nước dừa nồng độ 100 ml/l sau tuần B Cây trường đồng môi trường nước dừa nồng độ 100 ml/l sau tuần C Cây trường đồng môi trường nước dừa nồng độ 100 ml/l sau tuần A B Hình 4: Cây Dương đồng môi trường BAP nước dừa A Cây Dương đồng môi trường BAP 1,0 mg/l 150 ml/l nước dừa sau tuần B Cây Dương đồng môi trường BAP 1,0 mg/l 150 ml/l nước dừa sau tuần A B Hình 5: Cây Dương đồng môi trường IBA 0,7 mg/l A Cây Dương đồng môi trường IBA 0,7 mg/l sau tuần B Cây Dương đồng môi trường IBA 0,7 mg/l sau tuần A B Hình 6: Cây Dương đồng môi trường IAA 0,5 mg/l A Cây Dương đồng môi trường IAA 0,5 mg/l sau tuần B Cây Dương đồng môi trường IAA 0,5 mg/l sau tuần