Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với ba chủng nấm mốc pilidium lythri, pilidium septatum, mucor circinelloides gây bệnh trên cây dâu tây

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: TUYỂN CHỌN CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI BA CHỦNG NẤM MỐC Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides GÂY BỆNH TRÊN CÂY DÂU TÂY Mã số đề tài: 21/1SHTPSV10 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thuý Kiều Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, chúng em nhận giúp đỡ quý Thầy Cô, gia đình bạn bè suốt khoảng thời gian thực đề tài Qua đây, chúng em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện, Ban quản lý phịng thí nghiệm hỗ trợ sở vật chất quý Thầy Cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tạo điều kiện tốt chúng em học tập Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm kiến thức chuyên môn giúp chúng em kịp thời giải vấn đề hoàn thành đề tài nghiên cứu Chúng em xin gửi lời cảm ơn TS Phạm Tấn Việt TS Nguyễn Ngọc Ẩn bảo hỗ trợ chúng em suốt thời gian thực đề tài Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên làm việc Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm giúp đỡ chúng em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Tuy cố gắng nhiều vốn kiến thức, kinh nghiệm thân hạn chế với lý khách quan, q trình thực hồn thành đề tài, chúng em khơng tránh khỏi thiếu sót nên mong nhận ý kiến đóng góp quý Thầy Cơ để chúng em hồn thiện Cuối cùng, chúng em xin kính chúc q Thầy Cơ ln dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công công việc sống Một lần nữa, chúng em xin chân thành cảm ơn! PHẦN I: THƠNG TIN CHUNG I Thông tin tởng quát 1.1 Tên đề tài: Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với ba chủng nấm mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides gây bệnh dâu tây 1.2 Mã số: 21/1SHTPSV10 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài: TT Họ tên (học hàm, học vị) Nguyễn Thuý Kiều Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài Viện Công nghệ Sinh Chủ nhiệm đề tài học & Thực phẩm Quách Thị Bé Bảy Viện Công nghệ Sinh Thành viên tham gia học & Thực phẩm Trần Đặng Tú Quyên Viện Công nghệ Sinh Thành viên tham gia học & Thực phẩm 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: Từ tháng năm 2021 đến tháng năm 2022 1.5.2 Gia hạn: tháng 1.5.3 Thực thực tế: Từ tháng năm 2021 đến tháng năm 2022 1.6 Những thay đởi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Nội dung Thay Kiểm tra ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên khả nảy mầm khuẩn lên hệ sợi tơ mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides Các nội dung bổ sung thêm đề tài: Bổ sung thêm thí nghiệm khảo sát khả sinh chitinase ngoại bào xạ khuẩn đối kháng với nấm mốc gây bệnh Bổ sung thêm thí nghiệm khảo sát mơi trường ni cấy thích hợp với chủng xạ khuẩn Bổ sung thêm thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy xạ khuẩn cho hoạt tính kháng nấm mốc cao Bổ sung thêm thí nghiệm đánh giá khả kháng nấm mốc chủng xạ khuẩn mơ hình lá, dâu tây bệnh 1.7 Tởng kinh phí phê duyệt đề tài: 10 triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề: Dâu tây (Fragaria x ananassa) loại trồng thương mại nhiều nơi giới, đặc biệt vùng có khí hậu lạnh Loại ưa chuộng nhờ vào hương thơm đặc trưng, vị ngọt, mọng nước Trong dâu tây có chứa nhiều chất dinh dưỡng, bật hàm lượng vitamin C cao (58,8 mg 100 g dâu tây tươi), với vitamin C, hàm lượng folate dâu tây cao (24 mg 100 g dâu tây tươi) Ngồi ra, dâu tây cịn chứa loại vitamin khác vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B6, vitamin K, vitamin A, vitamin E chất phytochemical flavonoid, axit phenolic, lignan tannin Dâu tây nguồn thực phẩm lành mạnh, chứa nhiều chất xơ fructose thực phẩm góp phần điều chỉnh lượng đường máu bằng cách làm chậm q trình tiêu hóa, góp phần kiểm sốt lượng calo tiêu thụ nhờ tác dụng làm no Bên cạnh đó, dâu tây cịn nguồn cung cấp axit béo thiết yếu dầu hạt dâu tây giàu axit béo khơng bão hịa [1] Từ năm 2008 đến 2018, sản lượng dâu tây toàn cầu tăng 39,4% [2] Năm 2019, Trung Quốc quốc gia dẫn đầu sản xuất dâu tây với 3.041.560 tấn, xếp sau Hoa Kỳ, Mexico Thổ Nhĩ Kỳ [3] Hiện nay, sản lượng dâu tây giảm sút tác nhân gây bệnh nấm, vi khuẩn, vi rút tuyến trùng Các bệnh dâu tây ảnh hưởng đến quả, hoa, lá, rễ, gây đổ ngã Trong số tác nhân bệnh nấm tác nhân nguy hại, chúng lây nhiễm từ vị trí bệnh sang tất phận khác gây thiệt hại nghiêm trọng [4] Một số chủng nấm mốc thường gây bệnh dâu tây: bệnh thối Botrytis cinerea, bệnh thối đen rễ Rhizoctonia fragariae, bệnh thối gốc thối rễ nấm Phytophthora, bệnh thối nâu Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides, Bệnh đốm dâu tây Mycosphaerella fragariae thường xuất đốm màu tía nhỏ bề mặt non Sau đó, vết bệnh lan rộng, chuyển sang màu trắng bao quanh đường viền màu nâu đỏ [5] Các chất bảo vệ thực vật hoá học thường sử dụng để kiểm soát loại nấm bệnh trồng trọt Việc dẫn đến nhiều tác động nghiêm trọng đến môi trường, làm giảm đa dạng vi sinh vật có lợi đất, gây thối hóa đất, nhiễm mơi trường nước, khơng khí ảnh hưởng đến sức khỏe người Một hướng nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để kiểm sốt nấm bệnh Trong đó, xạ khuẩn với khả sản sinh nhiều loại enzyme, hợp chất thứ cấp chất kháng sinh đối tượng tiềm sử dụng để ức chế nấm mốc gây bệnh cho trồng [6] [7] Do đó, đề tài Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với ba chủng nấm mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides gây bệnh dâu tây thực nhằm sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nơng nghiệp, góp phần hướng tới nông nghiệp xanh – – bền vững tương lai Mục tiêu đề tài Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với chủng nấm mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides gây bệnh dâu tây Phương pháp nghiên cứu 3.1 Thu thập liệu - Thu thập tài liệu từ cơng trình nghiên cứu liên quan Việt Nam giới với từ khoá: Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides, plant pathogenic fungal, actinomyces, leafspot of strawberry, - Dữ liệu tìm từ tạp chí trường đại học, viện nghiên cứu ngồi nước - Thu thập thơng tin từ sách báo Internet 3.2 Định danh 3.2.1 Quan sát hình thái chủng xạ khuẩn Đặc điểm đại thể: chủng xạ khuẩn cấy ria làm môi trường thạch Gause I, ủ nhiệt độ phịng ngày Sau thời gian ni cấy, khuẩn lạc đặc trưng sẽ xuất môi trường thạch Gause I, tiến hành quan sát ghi nhận đặc điểm hình thái khuẩn lạc xạ khuẩn dựa yếu tố chủ yếu: kích thước, bề mặt khuẩn lạc, tâm khuẩn lạc sắc tố khuẩn lạc [8] Đặc điểm vi thể: thực quan sát đặc điểm vi thể bằng phương pháp phòng ẩm [9]: - Chuẩn bị đĩa phịng ẩm vơ trùng: lót bơng thấm nước lớp mỏng đáy đĩa, đặt giấy lọc lên lớp thấm nước, cho lame lamelle vào Tiến hành sấy vô trùng 30 phút 180°C - Chuẩn bị thạch Gause I: môi trường Gause I Agar đổ vào đĩa với độ dày khoảng 2-3 mm Sau ngày, kiểm tra môi trường không nhiễm, tiến hành cắt khối thạch với kích thước 1x1 cm đặt lên lame - Dùng que cấy vòng cấy chủng xạ khuẩn lên mép xung quanh khối thạch đặt lamelle lên Sau đó, cho nước cất vơ trùng vào đĩa cho nước thấm vừa đủ vào Nước thêm vào để tạo môi trường ẩm thuận lợi cho xạ khuẩn phát triển Đĩa phòng ẩm ủ ngày, sau khuẩn ty lan lamelle, dùng kẹp tách lamelle khỏi khối thạch đặt sang lame khác thực quan sát tiêu vật kính 100X 3.2.2 Định danh chủng xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường Gause I Broth ngày điều kiện nhiệt độ phịng, 120 rpm Sau đó, dịch ni cấy ly tâm 6000 rpm phút để thu tế bào Tế bào rửa qua nước muối sinh lý lần tiếp tục trộn với 100 μl buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA pH 8,0) Đun sôi hỗn hợp phút, hút μl làm mẫu DNA khuôn DNA xạ khuẩn tách chiết sẽ khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F: 5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1540R: 5’- AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ Thực phản ứng PCR với thể tích tổng phản ứng 50 μl (25μl Master mix, μl mồi xuôi, μl mồi ngược, μl DNA khuôn, 16 μl nước cất lần μl DMSO 25%) Chu trình nhiệt thực sau: tiền biến tính 94°C 10 phút, biến tính 94°C 30 giây, bắt cặp 55°C 45 giây, kéo dài 72°C phút, chu trình cuối kéo dài 72°C 10 phút bảo quản 4°C Trong đó, ba giai đoạn biến tính, bắt cặp kéo dài thực với 30 chu kỳ [10] Sản phẩm PCR sau nạp vào giếng điện di gel agarose 1,5 % đệm TAE 1X 110V 20 phút để xác định diện DNA xạ khuẩn DNA marker (G106ABM) sử dụng điện di có kích thước từ 100bp – 10kb Sau đó, sản phẩm PCR giải trình tự 16S rRNA, có trình tự gene chủng xạ khuẩn nghiên cứu, thực xây dựng phát sinh loài bằng cách tìm trình tự gene tương đồng bằng công cụ BLAST ngân hàng liệu NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Sắp giống trình tự gene tính tốn mức độ tương đồng bằng phần mềm Clustal X2 Cây phát sinh lồi xây dựng dựa thuật tốn Neighbor-Joining với bootstrap 1000 lần lặp lại bằng phần mềm MEGA phiên 5.0 3.2.3 Xác định đặc điểm chủng nấm mốc Đặc điểm đại thể: chủng nấm mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides cấy môi trường PGA điều kiện nhiệt độ phòng ngày Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành quan sát ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc về: hình dạng, tâm, rìa, dạng [8] Đặc điểm vi thể: thực tương tự phương pháp xác định đặc điểm vi thể xạ khuẩn, thay môi trường Gause I Agar bằng môi trường PGA Đĩa phòng ẩm ủ – ngày, sau quan sát thấy hệ sợi tơ nấm mốc lan lamelle, dùng kẹp tách lamelle khỏi khối thạch đặt sang lame khác thực quan sát tiêu độ phóng đại 1000 lần [9] 3.3 Khảo sát hoạt tính đối kháng chủng xạ khuẩn phát triển nấm mốc mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides Nguyên tắc: hoạt tính đối kháng chủng xạ khuẩn biểu dựa kích thước vịng kháng thơng qua phương pháp khuếch tán giếng thạch Khi hợp chất đối kháng sinh ra, hợp chất sẽ ức chế phát triển hệ sợi tơ nấm mốc mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides, từ hình thành nên vịng kháng Cách thực hiện: từ ống giống tủ đông sâu, chủng xạ khuẩn hoạt hố mơi trường Gause I Agar ngày, sau tiến hành tăng sinh chủng xạ khuẩn môi trường Gause I Broth vòng ngày với điều kiện lắc 120 rpm nhiệt độ phòng Đối với nấm mốc, chủng mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides nuôi cấy môi trường PGA sau khoảng – ngày, từ đĩa thạch sẽ cắt vng thạch chứa tơ nấm có diện tích cm2 đặt vào trung tâm đĩa PGA Sau đó, tạo giếng đĩa bằng đầu đục kim loại có đường kính 0,8 cm đối xứng xung quanh ô vuông thạch chứa tơ nấm Sau nuôi nấm mốc ngày, dịch xạ khuẩn sẽ ly tâm 13000 rpm 10 phút Tiến hành hút 100 μl dịch xạ khuẩn vào giếng tạo đĩa thạch, thực ủ – ngày nhiệt độ phòng để xác định hoạt tính đối kháng Đồng thời, đối chứng âm thực đĩa môi trường Gause I Broth với thể tích Hoạt tính đối kháng thể qua cơng thức: Trong đó, R hoạt tính đối kháng (%), D khoảng cách từ tâm khuẩn lạc nấm đến đối chứng âm (cm), d khoảng cách từ tâm khuẩn lạc nấm đến vùng tơ nấm bị ức chế (cm) [10] 3.4 Khảo sát môi trường thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tởng hợp các hợp chất kháng nấm mốc chủng xạ khuẩn Giống xạ khuẩn chuẩn bị trước mục 3.3, tiếp tục thực tăng sinh xạ khuẩn môi trường khảo sát (10 ml môi trường) gồm: Gause I Broth, Gause II Broth, Inorganic Salts Starch Broth (ISP 4), môi trường Emerson Broth, môi trường SNB Broth ngày với điều kiện lắc 120 rpm nhiệt độ phòng Sau ngày, hút 1% dịch ni cấy xạ khuẩn bổ sung vào bình 30 ml với môi trường tương ứng, tiến hành lên men với điều kiện Sau 24 giờ, thực thu dịch nuôi cấy xạ khuẩn để xác định hoạt tính đối kháng nấm chủng xạ khuẩn theo phương pháp đồng ni cấy (như mục 3.3), thí nghiệm lặp lại lần Môi trường thời gian ni cấy xạ khuẩn cho hoạt tính đối kháng cao ổn định sẽ chọn để tiến hành thí nghiệm 3.5 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên hệ sợ tơ chủng nấm mốc Cách thực hiện: cấy nấm mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides có diện tích 0,5 cm2 đĩa PGA, ủ ngày nhiệt độ phòng để nấm lan khoảng 2/3 đĩa petri Tiến hành thu hệ sợi tơ nấm mốc bằng cách hút ml môi trường PGB vào đĩa nấm mốc trên, dùng que cấy trải kéo nhẹ bề mặt đĩa, sau hút ml vào eppendorf vô trùng, ủ 16 để hệ sợi tơ hình thành Ở ngày thứ kể từ thời điểm cấy nấm mốc, tiến hành nuôi cấy tăng sinh xạ khuẩn 10 ml môi trường, nhiệt độ thời gian thích hợp lắc 120 rpm, tiếp tục ly tâm 13000 rpm phút thu dịch lọc bằng màng lọc 0,45 μm Sau đó, trộn dịch tăng sinh xạ khuẩn dịch hệ sợi tơ mốc tỉ lệ 1:1, ủ nhiệt độ phòng Quan sát ghi nhận thay đổi hệ sợi tơ nấm 24 Đối chứng thực tương tự với dịch bào tử nấm mốc thay dịch xạ khuẩn bằng mơi trường PGB Thí hiệm lặp lại lần, kết quan sát bằng kính hiển vi quang học, vật kính 100X 3.6 Khảo sát khả năng bền nhiệt độ, pH đến hoạt tính đối kháng nấm mốc dịch nuôi cấy xạ khuẩn Nguyên tắc: nhiệt độ pH có ảnh hưởng định đến ổn định hoạt tính chất đối kháng nấm Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides dịch nuôi cấy Khi điều kiện nhiệt độ pH khác nhau, protein enzyme ngoại bào số hợp chất có hoạt tính kháng nấm sẽ bị biến tính Điều dẫn đến hoạt tính đối kháng dịch ni cấy xạ khuẩn bị giảm khơng cịn khả đối kháng với nấm mốc Pilidium lythri, Pilidium septatum, Mucor circinelloides Cách tiến hành: thu nhận dịch nuôi cấy xạ khuẩn từ môi trường nuôi cấy phù hợp thời điểm dịch ni cấy xạ khuẩn cho hoạt tính cao Dịch ly tâm với tốc độ 13000 rpm 10 phút Đối với khảo sát hoạt tính hợp chất đối kháng dịch nuôi cấy ảnh hưởng nhiệt độ, dịch nuôi cấy xạ khuẩn ủ khoảng thời gian 30 phút với nhiệt độ từ 50, 60, 70,… 121°C Trong đó, đối chứng dương dịch xạ khuẩn không xử lý nhiệt đối chứng âm dịch môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Hoạt tính đối kháng dịch ni cấy xạ khuẩn xác định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Đối với phương pháp khảo sát ảnh hưởng pH dịch nuôi cấy xạ khuẩn thực tương tư trên, dịch nuôi cấy xạ khuẩn chỉnh pH 3,0 đến 12,0 bằng HCl 2N NaOH 2N Sau đó, dịch nuôi cấy xạ khuẩn điều chỉnh pH sẽ ủ Trong đó, đối chứng dương dịch xạ khuẩn không điều chỉnh pH, đối chứng âm môi trường nuôi cấy tương ứng Hoạt tính đối kháng cịn lại dịch ni cấy xạ khuẩn xác định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch với lần lặp lại mục 3.3 (đối chứng dương sẽ quy 100%) [11] 3.7 Khảo sát khả năng sinh chitinase ngoại bào xạ khuẩn đối kháng với nấm mốc gây bệnh Cấy xạ khuẩn bằng phương pháp cấy chấm điểm bằng que cấy móc mơi trường Gause I Agar bổ sung 1% keo chitin môi trường Gause I Agar bổ sung 1% casein, ủ nhiệt độ phòng ngày Sau đó, nhuộm đĩa thạch bằng dung dịch lugol (đối với chitinase ngoại bào) TCA 10% (đối với proteinase ngoại bào) để đo vịng phân giải Thí nghiệm lặp lại lần Độ lớn vòng phân giải (mm) = Đường kính vịng phân giải (mm) – Đường kính khuẩn lạc xạ khuẩn (mm) [12] 3.8 Đánh giá khả năng kháng nấm mốc chủng xạ khuẩn mô hình lá dâu tây Thực đánh giá khả kháng nấm bệnh mơ hình dâu tây dịch nuôi cấy xạ khuẩn bằng cách sử dụng dâu tây Hana Nhật Bản (tên gọi khác Tochiotome) Lá dâu tây chọn không non không già, đủ dày để dễ dàng tiêm khoẻ mạnh Đầu tiên xử lý với NaClO 2% phút, rửa lần qua nước cất vô trùng Tiếp theo, đặt vào đĩa petri vơ trùng, phía có lớp giấy lọc thấm, để khô tự nhiên Sau đó, tiêm lên phần thịt bề mặt, nơi gân nhỏ với hỗn hợp 15 μl dịch nuôi cấy xạ khuẩn dịch nấm mốc (tỉ lệ 1:1) Đối chứng dương tiêm với 15 μl dịch nuôi cấy xạ khuẩn, đối chứng âm tiêm 15 μl nước cất vô trùng mẫu gây bệnh tiêm 15 μl dịch nấm mốc Mỗi ngày cho ml nước cất vô trùng vào đĩa để tạo độ ẩm cho mơi trường bên Thí nghiệm thực lặp lại lần nhiệt độ phịng [13] (dịch ni cấy xạ khuẩn thu với điều kiện xác định bên Đối với dịch nấm mốc, chuẩn bị mục 3.5) 3.9 Phương pháp kiểm tra hoạt tính đối kháng nấm Pilidium lythri xạ khuẩn mô hình dâu tây Nhằm đánh giá khách quan khả đối kháng nấm P lythri dịch xạ khuẩn CNXK việc phòng chữa bệnh mức độ in vitro dâu tây, thí nghiệm thực sau: [20] D van Dissel, D Claessen, and G P van Wezel, Morphogenesis of streptomyces in submerged cultures, 1st ed., vol 89 Elsevier Inc., 2014 [21] N Xuân Cảnh, H Tú Cường, N Thị Định, and P Thị Hiếu, “Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tôm Characterization of An Actinomycete Strain with Bioactivity against Vibrio parahaemolyticus Causing Disease on Shrimp,” vol 14, no 11, pp 1809–1816, 2016, [Online] Available: www.vnua.edu.vn [22] A S Anderson and E M H Wellington, “The taxonomy of Streptomyces and related genera,” Int J Syst Evol Microbiol., vol 51, no 3, pp 797–814, 2001, doi: 10.1099/00207713-51-3-797 [23] S B Ilic et al., “Characterization and antimicrobial activity of the bioactive metabolites in Streptomycete isolates,” Microbiology, vol 76, no 4, pp 421–428, 2007, doi: 10.1134/S0026261707040066 [24] D Dhanasekaran, N Thajuddin, and A Panneerselvam, “Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine,” Fungic Plant Anim Dis., no January, 2012, doi: 10.5772/25549 [25] H L Ser et al., “Streptomyces antioxidans sp nov., a novel mangrove soil actinobacterium with antioxidative and neuroprotective potentials,” Front Microbiol., vol 7, no JUN, pp 1–14, 2016, doi: 10.3389/fmicb.2016.00899 [26] H Weissbach, B G Redfield, V Beaven, and E Katz, “Actinomycin synthesis in washed cells of Streptomyces antibioticus.,” J Biol Chem., vol 240, no 11, pp 4377– 4381, 1965, doi: 10.1016/s0021-9258(18)97072-9 [27] Y Igarashi et al., “Yatakemycin, a novel antifungal antibiotic produced by Streptomyces sp TP-A0356,” J Antibiot (Tokyo)., vol 56, no 2, pp 107–113, 2003, doi: 10.7164/antibiotics.56.107 [28] “Khả đối kháng nấm,” vol 31, pp 7–11, 2014 112 [29] V Barbe et al., “Complete genome sequence of Streptomyces cattleya NRRL 8057, a producer of antibiotics and fluorometabolites,” J Bacteriol., vol 193, no 18, pp 5055– 5056, 2011, doi: 10.1128/JB.05583-11 [30] A Sathya, R Vijayabharathi, and S Gopalakrishnan, “Plant growth-promoting actinobacteria: a new strategy for enhancing sustainable production and protection of grain legumes,” Biotech, vol 7, no 2, 2017, doi: 10.1007/s13205-017-0736-3 [31] B R Glick, “Using soil bacteria to facilitate phytoremediation,” Biotechnol Adv., vol 28, no 3, pp 367–374, 2010, doi: 10.1016/j.biotechadv.2010.02.001 [32] A K Passari, V K Mishra, V K Gupta, R Saikia, and B P Singh, “Distribution and identification of endophytic Streptomyces species from Schima wallichii as potential biocontrol agents against fungal plant pathogens,” Polish J Microbiol., vol 65, no 3, pp 319–329, 2016, doi: 10.5604/17331331.1215611 [33] M Wang, J Xue, J Ma, X Feng, H Ying, and H Xu, “Streptomyces lydicus M01 Regulates Soil Microbial Community and Alleviates Foliar Disease Caused by Alternaria alternata on Cucumbers,” Front Microbiol., vol 11, no May, pp 1–13, 2020, doi: 10.3389/fmicb.2020.00942 [34] A Sellstedt and K H Richau, “Aspects of nitrogen-fixing actinobacteria, in particular free-living and symbiotic frankia,” FEMS Microbiol Lett., vol 342, no 2, pp 179–186, 2013, doi: 10.1111/1574-6968.12116 [35] M Sreevidya, S Gopalakrishnan, H Kudapa, and R K Varshney, “Exploring plant growth-promotion actinomycetes from vermicompost and rhizosphere soil for yield enhancement in chickpea,” Brazilian J Microbiol., vol 47, no 1, pp 85–95, 2016, doi: 10.1016/j.bjm.2015.11.030 [36] A K Passari, V K Mishra, V K Gupta, M K Yadav, R Saikia, and B P Singh, “In vitro and in vivo plant growth promoting activities and DNA fingerprinting of antagonistic endophytic actinomycetes associates with medicinal plants,” PLoS One, vol 10, no 9, pp 1–18, 2015, doi: 10.1371/journal.pone.0139468 113 [37] S Gopalakrishnan et al., “Evaluation of Streptomyces strains isolated from herbal vermicompost for their plant growth-promotion traits in rice,” Microbiol Res., vol 169, no 1, pp 40–48, 2014, doi: 10.1016/j.micres.2013.09.008 [38] G J Joo, “Production of an anti-fungal substance for biological control of Phytophthora capsici causing phytophthora blight in red-peppers by Streptomyces halstedii,” Biotechnol Lett., vol 27, no 3, pp 201–205, 2005, doi: 10.1007/s10529-0047879-0 [39] R Errakhi, F Bouteau, A Lebrihi, and M Barakate, “Evidences of biological control capacities of Streptomyces spp against Sclerotium rolfsii responsible for dampingoff disease in sugar beet (Beta vulgaris L.),” World J Microbiol Biotechnol., vol 23, no 11, pp 1503–1509, 2007, doi: 10.1007/s11274-007-9394-7 [40] G E Aktuganov, A I Melent’ev, N F Galimzyanova, and A V Shirokov, “The study of mycolytic properties of aerobic spore-forming bacteria producing extracellular chitinases,” Microbiology, vol 77, no 6, pp 700–709, 2008, doi: 10.1134/S0026261708060088 [41] S A Palaniyandi, S H Yang, and J W Suh, “Extracellular proteases from Streptomyces phaeopurpureus ExPro138 inhibit spore adhesion, germination and appressorium formation in Colletotrichum coccodes,” J Appl Microbiol., vol 115, no 1, pp 207–217, 2013, doi: 10.1111/jam.12212 [42] A K Singh and H S Chhatpar, “Purification, characterization and thermodynamics of antifungal protease from Streptomyces sp A6,” J Basic Microbiol., vol 51, no 4, pp 424–432, 2011, doi: 10.1002/jobm.201000310 [43] S Sabaratnam and J A Traquair, “Mechanism of antagonism by Streptomyces griseocarneus (strain Di944) against fungal pathogens of greenhouse-grown tomato transplants,” Can J Plant Pathol., vol 37, no 2, pp 197–211, 2015, doi: 10.1080/07060661.2015.1039062 [44] S Mohandas et al., “Guava (Psidium guajava L.) rhizosphere Glomus mosseae spores harbor actinomycetes with growth promoting and antifungal attributes,” Sci Hortic (Amsterdam)., vol 150, pp 371–376, 2013, doi: 10.1016/j.scienta.2012.11.019 114 [45] “Biological control of vanilla anthracnose using Emericella nidulans,” Biol Control, vol 6, no 1, pp 47–55, 2010 [46] “Pilidium concavum,” 2021 https://www.cabi.org/isc/datasheet/41249 [47] N Ayoubi, M J Soleimani, and R Zare, “Pilidium Concavum, causing tan-brown rot on strawberry in Iran,” J Plant Pathol., vol 98, no 3, pp 667–669, 2016, doi: 10.4454/JPP.V98I3.063 [48] C Lazzizera, S Frisullo, A Alves, and A J L Phillips, “Morphology, phylogeny and pathogenicity of Botryosphaeria and Neofusicoccum species associated with drupe rot of olives in southern Italy,” Plant Pathol., vol 57, no 5, pp 948–956, 2008, doi: 10.1111/j.1365-3059.2008.01842.x [49] J Moral, R De Oliveira, and A Trapero, “Elucidation of the disease cycle of olive anthracnose caused by Colletotrichum acutatum,” Phytopathology, vol 99, no 5, pp 548– 556, 2009, doi: 10.1094/PHYTO-99-5-0548 [50] D Fernández-Ortuño, P K Bryson, and G Schnabel, “First report of Pilidium concavum causing Tan-brown Rot on strawberry nursery stock in South Carolina,” Plant Dis., vol 98, no 7, p 1010, 2014, doi: 10.1094/PDIS-01-14-0048-PDN [51] M Arzanlou, M Torbati, and H Jafary, “Fruit rot on olive caused by Pilidium concavum in Iran,” Australas Plant Dis Notes, vol 8, no 1, pp 117–121, 2013, doi: 10.1007/s13314-013-0111-0 [52] T Raman and G Muthukathan, “Field suppression of Fusarium wilt disease in banana by the combined application of native endophytic and rhizospheric bacterial isolates possessing multiple functions,” Phytopathol Mediterr., vol 54, no 2, pp 241–252, 2015, doi: 10.14601/Phytopathol [53] M Torbati, M Arzanlou, F Abed-Ashtiani, and H Golmohammadi, “Occurrence of fruit rot on cornelian cherry caused by Pilidium lythri in Iran,” Crop Prot., vol 125, no March, p 104884, 2019, doi: 10.1016/j.cropro.2019.104884 115 [54] L Wagner et al., “A new species concept for the clinically relevant Mucor circinelloides complex,” Persoonia Mol Phylogeny Evol Fungi, vol 44, pp 67–97, 2020, doi: 10.3767/persoonia.2020.44.03 [55] A D Pitt, J I., & Hocking, Fungi and food spoilage: J.I Pitt and A.D Hocking Gaithersburg: Aspen publication, 1999 [56] and I P KARIMI, Kaivan, Mahdi ARZANLOU, Asadollah BABAI-AHARI, “Biological and molecular characterisation of Pilidium lythri, an emerging strawberry pathogen in Iran,” Phytopathol Mediterr 55, vol 55(3), pp 366–379, 2016, [Online] Available: http://www.jstor.org/stable/44809315 [57] G D Roberts, “Medical Mycology: The Pathogenic Fungi and the Pathogenic Actinomycetes,” Mayo Clin Proc., vol 63, no 10, pp 1061–1062, 1988, doi: 10.1016/s0025-6196(12)64931-3 [58] “Efficacy and Mechanism of Thymol_KGM_LG Edible Coating Solution on Inhibition of Mucor circinelloides Isolated From Okra _ Enhanced Reader.pdf.” [59] S Y Lee et al., “Biocontrol of anthracnose in pepper using chitinase, β-1,3 glucanase, and 2-furancarboxaldehyde produced by Streptomyces cavourensis SY224,” J Microbiol Biotechnol., vol 22, no 10, pp 1359–1366, 2012, doi: 10.4014/jmb.1203.02056 [60] E M Hata, K Sijam, Z A M Ahmad, M T Yusof, and N A Azman N.A., “In vitro antimicrobial assay of actinomycetes in rice against Xanthomonas oryzae pv oryzicola and as potential plant growth promoter,” Brazilian Arch Biol Technol., vol 58, no 6, pp 821–832, 2015, doi: 10.1590/S1516-89132015060263 [61] S Boukaew, W Petlamul, W Suyotha, and P Prasertsan, “Simultaneous fermentative chitinase and β-1,3 glucanase production from Streptomyces philanthi RM-11-38 and their antifungal activity against rice sheath blight disease,” Biotechnologia, vol 97, no 4, pp 271–284, 2016, doi: 10.5114/bta.2016.64544 [62] T Kaur, A Kaur, V Sharma, and R K Manhas, “Purification and characterization of a new antifungal compound 10-(2,2-dimethyl-cyclohexyl)-6,9-dihydroxy-4,9-dimethyldec-2-enoic Acid Methyl Ester from Streptomyces hydrogenans Strain DH16,” Front Microbiol., vol 7, no JUN, 2016, doi: 10.3389/fmicb.2016.01004 116 [63] C de A Dalitz, M V Porsani, I C Figel, I C Pimentel, and P R Dalzoto, “Potential for biocontrol of melanized fungi by actinobacteria isolated from intertidal region of Ilha Do Mel, Paraná, Brazil,” Brazilian J Microbiol., vol 48, no 1, pp 32–36, 2017, doi: 10.1016/j.bjm.2016.09.010 [64] R Das, W Romi, R Das, H K Sharma, and D Thakur, “Antimicrobial potentiality of actinobacteria isolated from two microbiologically unexplored forest ecosystems of Northeast India,” BMC Microbiol., vol 18, no 1, pp 1–16, 2018, doi: 10.1186/s12866-0181215-7 [65] L S Singh, H Sharma, and D Sahoo, “Actinomycetes from Soil of Lachung, a Pristine High Altitude Region of Sikkim Himalaya, Their Antimicrobial Potentiality and Production of Industrially Important Enzymes,” Adv Microbiol., vol 09, no 08, pp 750– 773, 2019, doi: 10.4236/aim.2019.98046 [66] C H Nguyen, “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn nội sinh Trinh nữ hoàng cung ( Crinum latifolium ),” no November, 2019 [67] T T Trinh, T T Huế, and C Đ Hà, “Khảo sát số đặc tính sinh học chủng xạ khuẩn biển có khả kháng vi khuẩn gây bệnh,” vol 60, no 10, pp 13–17, 2018 [68] P Hồng Hiển et al., “Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Viện Bảo vệ thực vật Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm phytophthora gây bệnh số loại ăn quả,” Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam-Số, vol 12, no 109, p 2019, 2019 [69] T Thị Hoa, N Thị Hồng Hà, L Văn Hào, P Bích Ngọc, C Hồng Hà, and Đ Tiến Phát, “Công Nghệ Vi Sinh Và Lên Men Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Của Một Số Chủng Vi Sinh Vật Có Hoạt Tính Kháng Nấm Phân Lập Từ Cây Sâm Ngọc Linh,” pp 364– 370, 2014 [70] Bao Tram Tran, Thi Hien Nguyen1, Binh Minh Chan, et al., “Studying on the antifungal activityof the actinomycete XK1 isolatedfrom growing orange’s soil against pathogenic fungi causing disease in citrus,” Minist Sci Technol Vietnam, vol 63, no 5, pp 41–45, 2021, doi: 10.31276/vjst.63(5).41-45 117 [71] Đ A Hòa, N T Ánh Nguyệt, L T M Châm, T T Trang, T T Phấn, and H T Loan, “Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn tỉnh Lâm Đồng có hoạt tính kháng Pythium vexans gây bệnh thối rễ rau ăn họ thập tự,” Tạp Chí Khoa Học Đại Học Mở Thành Phớ Hồ Chí Minh - Kỹ Thuật Và Công Nghệ, vol 16, no 1, pp 79–101, 2021, doi: 10.46223/hcmcoujs.tech.vi.16.1.1727.2021 [72] M Ursan, O Alina, B Sicuia, and C Voaides, “the Potential of New Streptomyces Isolates,” 2018 PHỤ LỤC ANOVA Table for Ty le uc che by Nhiet Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 6038.58 862.655 Within groups 127.608 16 7.97553 Total (Corr.) 6166.19 23 108.16 0.0000 Table of Means for Ty le uc che by Nhiet with 95.0 percent LSD intervals Stnd error Nhiet Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 100 0.0 1.63049 -2.44411 2.44411 121 0.0 1.63049 -2.44411 2.44411 50 35.0877 1.63049 32.6436 37.5318 60 35.0877 1.63049 32.6436 37.5318 70 28.2456 1.63049 25.8015 30.6897 80 24.2105 1.63049 21.7664 26.6546 90 1.63049 -2.44411 2.44411 DC 36.4912 1.63049 34.0471 38.9353 Total 24 19.8904 0.0 Multiple Range Tests for Ty le uc che by Nhiet Method: 95.0 percent LSD 118 Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 90 0.0 X 121 0.0 X 100 0.0 X 80 24.2105 X 70 28.2456 X 50 35.0877 X 60 35.0877 X DC 36.4912 X Contrast Sig Difference +/- Limits 100 - 121 0.0 4.88823 100 - 50 * -35.0877 4.88823 100 - 60 * -35.0877 4.88823 100 - 70 * -28.2456 4.88823 100 - 80 * -24.2105 4.88823 0.0 4.88823 100 - DC * -36.4912 4.88823 121 - 50 * -35.0877 4.88823 121 - 60 * -35.0877 4.88823 121 - 70 * -28.2456 4.88823 121 - 80 * -24.2105 4.88823 0.0 4.88823 -36.4912 4.88823 0.0 4.88823 100 - 90 121 - 90 121 - DC * 50 - 60 50 - 70 * 6.84211 4.88823 50 - 80 * 10.8772 4.88823 50 - 90 * 35.0877 4.88823 119 50 - DC -1.40351 4.88823 60 - 70 * 6.84211 4.88823 60 - 80 * 10.8772 4.88823 60 - 90 * 35.0877 4.88823 60 - DC -1.40351 4.88823 70 - 80 4.03509 4.88823 70 - 90 * 28.2456 4.88823 70 - DC * -8.24561 4.88823 80 - 90 * 24.2105 4.88823 80 - DC * -12.2807 4.88823 90 - DC * -36.4912 4.88823 pH ANOVA Table for Ty le uc che by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4381.99 10 438.199 Within groups 431.122 22 19.5964 Total (Corr.) 4813.11 32 22.36 0.0000 Multiple Range Tests for Ty le uc che by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups pH 3.0 1.875 X pH 4.0 3.125 X pH 12.0 21.4583 X pH 5.0 22.9167 X pH 11.0 26.6667 XX pH 10.0 28.8889 XXX pH 6.0 32.2222 XX 120 pH 9.0 33.3333 XX pH 8.0 33.9583 XX pH 7.0 35.1111 X DC 35.4167 X Contrast Sig Difference +/- Limits DC - pH 10.0 6.52778 7.49594 DC - pH 11.0 * 8.75 7.49594 DC - pH 12.0 * 13.9583 7.49594 DC - pH 3.0 * 33.5417 7.49594 DC - pH 4.0 * 32.2917 7.49594 DC - pH 5.0 * 12.5 7.49594 DC - pH 6.0 3.19444 7.49594 DC - pH 7.0 0.305556 7.49594 DC - pH 8.0 1.45833 7.49594 DC - pH 9.0 2.08333 7.49594 pH 10.0 - pH 11.0 2.22222 7.49594 pH 10.0 - pH 12.0 7.43056 7.49594 pH 10.0 - pH 3.0 * 27.0139 7.49594 pH 10.0 - pH 4.0 * 25.7639 7.49594 pH 10.0 - pH 5.0 5.97222 7.49594 pH 10.0 - pH 6.0 -3.33333 7.49594 pH 10.0 - pH 7.0 -6.22222 7.49594 pH 10.0 - pH 8.0 -5.06944 7.49594 pH 10.0 - pH 9.0 -4.44444 7.49594 pH 11.0 - pH 12.0 5.20833 7.49594 pH 11.0 - pH 3.0 * 24.7917 7.49594 pH 11.0 - pH 4.0 * 23.5417 7.49594 121 pH 11.0 - pH 5.0 3.75 7.49594 pH 11.0 - pH 6.0 -5.55556 7.49594 -8.44444 7.49594 pH 11.0 - pH 8.0 -7.29167 7.49594 pH 11.0 - pH 9.0 -6.66667 7.49594 pH 11.0 - pH 7.0 * pH 12.0 - pH 3.0 * 19.5833 7.49594 pH 12.0 - pH 4.0 * 18.3333 7.49594 -1.45833 7.49594 pH 12.0 - pH 5.0 pH 12.0 - pH 6.0 * -10.7639 7.49594 pH 12.0 - pH 7.0 * -13.6528 7.49594 pH 12.0 - pH 8.0 * -12.5 7.49594 pH 12.0 - pH 9.0 * -11.875 7.49594 -1.25 7.49594 pH 3.0 - pH 4.0 pH 3.0 - pH 5.0 * -21.0417 7.49594 pH 3.0 - pH 6.0 * -30.3472 7.49594 pH 3.0 - pH 7.0 * -33.2361 7.49594 pH 3.0 - pH 8.0 * -32.0833 7.49594 pH 3.0 - pH 9.0 * -31.4583 7.49594 pH 4.0 - pH 5.0 * -19.7917 7.49594 pH 4.0 - pH 6.0 * -29.0972 7.49594 pH 4.0 - pH 7.0 * -31.9861 7.49594 pH 4.0 - pH 8.0 * -30.8333 7.49594 pH 4.0 - pH 9.0 * -30.2083 7.49594 pH 5.0 - pH 6.0 * -9.30556 7.49594 pH 5.0 - pH 7.0 * -12.1944 7.49594 pH 5.0 - pH 8.0 * -11.0417 7.49594 pH 5.0 - pH 9.0 * -10.4167 7.49594 -2.88889 7.49594 pH 6.0 - pH 7.0 122 pH 6.0 - pH 8.0 -1.73611 7.49594 pH 6.0 - pH 9.0 -1.11111 7.49594 pH 7.0 - pH 8.0 1.15278 7.49594 pH 7.0 - pH 9.0 1.77778 7.49594 pH 8.0 - pH 9.0 0.625 7.49594 MÔI TRƯỜNG Analysis of Variance for Ty le uc che - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Moi truong 4907.41 1226.85 46.38 0.0000 B:Ngay 6900.19 1150.03 43.47 0.0000 RESIDUAL 2486.69 94 26.4541 TOTAL (CORRECTED) 14294.3 104 Multiple Range Tests for Ty le uc che by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups Gause II 21 9.30692 1.12237 X Emerson 21 12.6268 1.12237 X Gause I 21 13.3112 1.12237 X ISP4 21 18.601 1.12237 X SNB 21 28.8438 1.12237 X Contrast Sig Difference +/- Limits Emerson - Gause I -0.684329 3.15158 Emerson - Gause II * 3.31991 3.15158 Emerson - ISP4 * -5.97417 3.15158 Emerson - SNB * -16.2169 3.15158 Gause I - Gause II * 4.00424 3.15158 123 Gause I - ISP4 * -5.28984 3.15158 Gause I - SNB * -15.5326 3.15158 Gause II - ISP4 * -9.29408 3.15158 Gause II - SNB * -19.5368 3.15158 ISP4 - SNB * -10.2428 3.15158 Multiple Range Tests for Ty le uc che by Ngay Method: 95.0 percent LSD Ngay Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 15 3.29929 1.32801 X 15 10.7108 1.32801 X 15 12.1171 1.32801 X 15 16.8802 1.32801 X 15 19.3491 1.32801 X 15 23.8312 1.32801 X 15 29.5779 1.32801 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1-2 * -7.41149 3.729 1-3 * -13.5809 3.729 1-4 * -16.0498 3.729 1-5 * -26.2786 3.729 1-6 * -20.5319 3.729 1-7 * -8.81781 3.729 2-3 * -6.16939 3.729 2-4 * -8.63834 3.729 2-5 * -18.8671 3.729 2-6 * -13.1204 3.729 -1.40632 3.729 2-7 124 3-4 -2.46895 3.729 3-5 * -12.6977 3.729 3-6 * -6.95098 3.729 3-7 * 4.76307 3.729 4-5 * -10.2288 3.729 4-6 * -4.48203 3.729 4-7 * 7.23203 3.729 5-6 * 5.74673 3.729 5-7 * 17.4608 3.729 6-7 * 11.7141 3.729 125 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mô hình .) 126