Báo cáo thực hành môn sinh học phân tử kỹ thuật di truyền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHOA CNSH &CNTP  BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ KỸ - THUẬT DI TRUYỀN Giảng viên: ThS Dương Hữu Lộc Sinh viên: Đỗ Thị Hào Lớp: CNSH43 Thái Nguyên, 2013 Bài TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM 1.1 Mục đích Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA khỏi cấu trúc bao bọc tế bào, để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử Điều quan tâm thu nhận phân tử DNA trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy 1.2 Đối tượng : Lá đậu tương II VẬT TƯ – HÓA CHẤT TT Tên dụng cụ, hóa chất Số lượng Ghi Cồn tuyệt đối lít Dụng cụ dạng thìa nhựa mm 10 Ống fancol 10 Bộ micropipet Ống eppendorp loại ml 30 Ghi sẵn thứ tự theo số mẫu Ống eppendorp loại 1,5 ml 30 Ghi sẵn thứ tự theo số mẫu Máy ổn nhiệt máy Máy lắc (votex) máy Máy ly tâm máy 10 Máy spindown máy 11 Tris HCl 1M, pH = ml 12 NaCl 5M 5,6 ml 13 EDTA 0,5 M, pH = 1,2 ml 14 CTAB 4% 0,8 gam Kèm 30 đầu côn loại 15 NaH 2PO4 0,16 gam 16 Sorbitol 2M ml 17 Isoamyl 0,75 ml 18 Cloroform 18 ml 19 Isopropannol 100% 15 ml 20 Nước cất lít 21 Nước cất khử ion ml Cách pha hóa chất 1) Đệm CTAB 100 ml gồm: - CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam - β - Mercapto ethanol : 250 µl - EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml - NaCl 5M : 30 ml - Tris HCl (pH= 8,0) : 15 ml - H2O : 55 ml - Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng DNA - EDTA có tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá vỡ liên kết hóa trị II làm giảm tính bền vững lớp màng tế bào vi khuẩn 2) Đệm TE (Tris - EDTA) pH=8,0 gồm: - Tris HCl (pH=8,0) :10 mM - EDTA (pH=8,0) : 1mM 3) Enzyme RNase : 10 µg/ml 4) Cồn tuyệt đối lạnh : 50 ml 5) NaCl 5M : 20 ml 6) Dung dịch chloroform:isoamylalcohol (24:1) - Chloroform không tan nước, bổ sung vào dịch ni tế bào làm cho dịch phân thành lớp( pha) Hỗn hợp ly tâm mạnh để phân tách lớp Protein bị kết tủa nằm pha - Isoamylancohol ancohol với có mặt cation hóa trị I ( Na+, K +, NH 4+) có tác dụng làm kết tủa DNA 7) Dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) 8) Dung dịch rửa mẫu ethanol 70%: - Sử dụng cồn tuyệt đối để loại bỏ số muối lẫn tạp dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA III CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nguyên tắc Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào động vật, thực vật vi khuẩn Tuỳ loại mẫu phẩm sinh học, tuỳ mục đích nghiên cứu điều kiện phịng thí nghiệm sử dụng kỹ thuật tách chiết với loại hoá chất dung môi khác Các phương pháp tách chiết DNA thường dùng gồm: Phương pháp CTAB Phương pháp PVP Phương pháp phenol/chloroform Phương pháp Silica Phương pháp Guanidine-chloroform Trong phạm vi giảng thực hành giới thiệu cách tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) phương pháp Do tác giả Gawel cộng đưa năm 1991 có cải tiến Nguyên tắc phương pháp dựa sở sử dụng kết hợp học nghiền hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng ống Ependorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, hóa chất loại bỏ thành phần không mong muốn, từ thu nhận DNA 3.2 Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước) - Bước 1: Tiến hành thu mẫu (mẫu lá), gói giấy bạc để vào nitơ lỏng đến tách chiết DNA - Bước 2: Nghiền 0,2 - 0,3 gam đậu tương trong nitơ lỏng tành bột mịn - Bước 3: Chuyển bột mịn vào ống eppendof ml Thêm 1ml đệm CTAB ủ 65 C 10 phút - Bước 4: Ủ ống mẫu 650C 90 phút, trình ủ tiến hành đảo nhẹ 20 phút/ lần - Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút, 40C Hút phần dịch phía sang ống Thêm 0,8 ml dung dịch chloroform:isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ 10 phút Tiến hành ly tâm 10 phút, tốc độ 10.000 vòng/phút 0C (lặp lại lần) - Bước 6: Hút lớp dịch sang ống eppendof mới, bổ sung (25:24:1) theo tỉ lệ 1:1 lắc nhẹ 10 phút Tiến hành ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút, 40C - Bước 7: Hút lớp dịch sang ống bổ sung isopropanol vào theo tỉ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm µl NaCl 5M Đảo 5-7 phút Để mẫu tủ 200C qua đêm - Bước 8: Ly tâm 13.000 vòng/phút 15 phút để thu tủa - Bước 9: Rửa tủa với ehanol 70% Sau ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút (lặp lại lần) - Bước 10: Tiến hành loại bỏ dịch lỏng, thu lấy tủa DNA Làm khô máy ly tâm chân không 20 phút 300C - Bước 11: Bổ sung 20 µl H2O với µl Rnase để hòa tan tủa DNA Ủ mẫu DNA tủ 370C 30 phút Đem cất giữ -200C IV Kết quả: Kết điện di sản phẩm tách chiết: Hình 1.3 Kết điện di tách chiết DNA tổng số từ đậu tương Nhận xét: Tách chiết DNA tổng số tương đối thành công, chấp nhận , có DNA bị đứt gãy, nhiên lượng DNA thu nên vạch khơng sáng rõ, cịn mờ, ngồi tạp chất protein, bị lẫn RNA nhiều Hầu hết mẫu có DNA, mẫu 8,9, 10 tách thành công, mẫu số DNA không q trình thao tác làm DNA tra mẫu điện di - Giếng số 1: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, có DNA bị đứt gãy Lẫn tạp protein RNA nhiều - Giếng số 2: Tách chiết DNA tổng số thành công, nhiên mẫu bị lẫn tạp protein, lượng DNA thu ít, RNA lẫn tạp nhiều - Giếng số 3: Bị lẫn tạp protein, lượng DNA thu hơn, có đứt gãy - Giếng số 4: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng vir ) RNA - Giếng số 5: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, nhiên lẫn tạp protein cịn dính miệng giếng RNA cuối đường điện di - Giếng số : Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, nhiên lẫn tạp protein cịn dính miệng giếng RNA cuối đường điện di - Giếng số 8: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng vir ) RNA - Giếng số 9: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng vir ) RNA - Giếng số 10: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, nhiên lẫn tạp protein cịn dính miệng giếng RNA cuối đường điện di V Giải thích: Nguyên lí trình tách chiết phá vỡ tế bào đậu tương : - Phá vỡ tế bào , màng tế bào mô - Loại bỏ tạp chất DNA ( Protein, lipid, đường…) - Phá vỡ tế bào cách xử lí nhiệt, dung lực mạnh để phá vỡ liên kết, lực học đảo trộn máy vortex - CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào Màng tế bào lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hịa tan Trong dung dịch đệm có thành phần: - Tris- HCl: ổn định pH - EDTA: Có lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca+ , Mg+ canh tranh với enzyme làm enzyme không hoạt động - Khi bổ sung CTAB ủ 65ºC 1h 10 phút đảo trộn lần - CTAB hoạt động mạnh hiệu nhiệt độ khoảng 60- 70ºC, mạnh có lực học tác động vào ( CTAB hoạt động trường hợp có NaCl) - CIAA bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ protein thành phần khác không mong muốn, chloroform không kết tủa DNA, có tác dụng biến tính CTAB, kết tủa CTAB - Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả tạo bọt, đồng thời giúp tăng cường hỗ trợ khả kết tủa protein, hỗ trợ phân pha Sau bổ sung CIAA ly tâm có tượng phân pha ( pha) + Pha : Là DNA + Pha giữa: Chứa protein + Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào dung dịch chloroform - CH COONa 3M pH 5.5 : ion Na+ vào trung hòa DNA triệt tiêu khả hòa tan DNA, bổ sung isopropanol kết tủa DNA, phân tách thu DNA ( CH3 COONa, CH COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn) - Rửa tủa cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa tủa DNA bị hịa tan nước khơng hịa tan cồn Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan cồn 70%, cồn 100% muối không tan, cồn kết tủa protein cậy rửa tủa cồn xong hút hết hết cồn làm bay hết cồn Nếu cịn cồn làm biến tính enzyme không thực phản ứng sinh học phân tử - Hòa tan DNA TE 1X nước khử ion, nước khử ion TE 1X hịa tan tủa DNA sử dụng nước khử ion rửa tủa TE 1X hiệu bảo quản lâu, TE bảo quản tốt có chứa EDTA lực với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme giúp bảo quản lâu Hạn chế TE có có mặt EDTA ức chế enzyme phản ứng sinh học phân tử sau Cho nên sử dụng TE nồng độ lỗng, khơng ức chế phản ứng sinh học sau Sử dụng TE 1X Bài ĐIỆN DI TRONG GEL AGAROSE I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Điện di DNA gel agarose kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng hàm lượng DNA Kỹ thuật dựa nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc axít nucleic đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường chúng di chuyển cực dương điện trường II THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 2.1 Thiết bị, dụng cụ - Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), giá bể điện di, lược tạo giếng điện di, khay thăng nhờ giọt nước đổ gel - Cân điện tử - Bình chịu nhiệt để đun agarose - Lị vi sóng - Ống eppendorp loại ml - Khay nhựa có nắp kín kích thước (10 x 20 x 30 cm) để nhuộm gel - Máy lắc - Máy soi gen - Máy chụp ảnh (nếu có) 2.2 Hóa chất cách pha hóa chất - Agarose - TAE 1X TAE 1X pha từ TAE 50X stock bao gồm: + 242 gam Tris base (FW = 121) + 57,1 ml glacial actic axit (axit axetic băng) + 100 ml EDTA (pH = 8) + Bổ sung nước cất lên thể tích 1lít Khi pha 1X cần ml dung dịch 50X stock + ml nước cất - Ethydium Bromide Solution nhuộm nồng độ 0,5% (0,5 μl/ml) - Dye 6X Dye 6X pha loãng từ Dye 10X Trong 10X sample buffer stock bao gồm: 50% glycerol, 0,25% bromophenol, 0,25% xylene cyanole FF pha x TAE buffer Ví dụ: Để pha 10 ml Dye 10X cần: + 5ml glycerol + 0,25% x 10 gam bromophenol + 0,25% x 10 gam xylene + Còn lại x TAE 10 ml Dye 6X pha từ ml Dye 10 X + ml nước cất III NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 3.1 Nguyên lý Dựa vào đặc tính cấu trúc axít nucleic đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường chúng di chuyển cực dương điện trường 3.2 Các bước tiến hành - Bước 1: Pha 0,8 gam agarose 100 ml TAE 1X, đun sơi lị vi sóng Lưu ý đun bình chịu nhiệt có nắp khơng đậy nắp kín, đun cốc thủy tinh nên đổ khoảng phần thể tích cốc nhằm tránh tràn sôi Đun sôi để nguội đến 60oC (khi dùng tai cầm bình đựng agarose được) tiến hành đổ gel - Bước 2: Trước đổ gel cần lau giá đổ giấy thấm mềm dễ hút nước sau cài lược Lược tạo giếng đặt phía cực âm bể điện di Tiến hành cân mặt phẳng giá bể giọt nước giá Đổ gel, gel thực hành có kích thước dài 10 cm, rộng 6,5 cm cao 0,4 cm Mỗi giếng sâu 0,3 cm, thể tích giếng chứa 0,8 μl mẫu Do gel cần đổ 50 ml Đợi khoảng cho khô tháo lược - Bước 3: Đổ khoảng 150 ml dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE linh động thay đổi để phù hợp đặt gel bể - Bước 4: Đặt gel vào bể điện di, lưu ý thêm hay bớt dung dịch TAE 1X, để gel ngập 0,1 cm (1mm) so với bề mặt dung dịch điện di - Bước 5: Lấy 10 μl mẫu DNA tách chiết trộn với 2μl Dye 6X ống eppendorp (đã ghi thứ tự), vẩy nhẹ tay để mẫu DNA trộn với Dye 6X Cho cẩn thận hỗn hợp 8μl ống vào giếng điện di micropipet Ghi chép lại thứ tự ống mẫu tương ứng với thứ tự giếng Mỗi ống mẫu 10 dùng đầu côn hút riêng Khi tra mẫu vào giếng, tay tỳ lên thành giá điện di làm điểm dựa, tay đưa micropipet cho đầu côn vừa sát miệng giếng bơm từ micropipet Cần lưu ý thao tác không cẩn thận làm tràn giếng vỡ miệng giếng Chạy điện di điện 100V 30 phút Lúc quan sát mắt thường thấy hỗn hợp mẫu giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương - Bước 7: Lấy gel từ bể điện di nhuộm ethydium bromid 0,5μl/ml 10 phút, thao tác nhuộm thực máy lắc, tốc độ chậm, khoảng 50-70 vòng/phút Lưu ý mang gel nhuộm cần cẩn thận ethydium bromid độc hại với người mơi trường Do đó, để giảm thiểu việc tiếp xúc trực tiếp, cần dùng thìa to, dạng bản, có cán dài (hình 13) để đưa gel vào khay nhuộm, lấy khỏi khay, mang rửa lại nước sạch, đến đưa gel lên máy soi - Bước 8: Soi gel máy tia tử ngoại, axít nucleic gel agarose hình tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ ethydium bromid Chất có khả xen gắn vào bazơ axít nucleic làm chúng phát sáng dạng vạch màu đỏ cam, dễ quan sát chụp ảnh Hình 4.9 Ảnh gel agarose 11 IV Nhận xét: - Điện di xác định độ tinh sạch, nguyên vẹn DNA định tính ( có hay khơng, nhiều hay ít, sáng hay mờ) Băng sáng nhiều, băng mờ - Xác định độ tinh sạch: Lẫn tạp protein, RNA, protein điện tích khơng rõ ràng thường bám vào DNA - Độ ngun vẹn hồn tồn khơng có nghĩa toàn đoạn DNA mà dải đứt gãy lớn đảm bảo nguyên vẹn ( băng sáng) 12 Bài KỸ THUẬT PCR I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích PCR (Polymerase Chain Reaction) lần Karl Mulis mô tả năm 1984 Phản ứng chuỗi polymerase kỹ thuật đơn giản cho phép nhân nhanh trình tự DNA lên nhiều lần vài PCR thực có khn, Taq-polymerase, mồi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxy-ribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm ion Mg2+ PCR công cụ hữu hiệu cho việc phân tích gen, có khả tạo lượng lớn trình tự DNA đặc hiệu từ thể II DỤNG CỤ HĨA CHẤT 2.1 Dụng cụ - Lị vi sóng - Cân điện tử - Bình chịu nhiệt 500 ml - Ống PCR - Máy ly tâm - Máy lắc - Máy PCR - Bộ điện di - Máy soi gen 2.1 Hóa chất thành phần phản ứng PCR - Enzyme Taq polymerase - Buffer PCR - MgCl2 PCR - Nước cất khử ion - Đoạn DNA làm mồi (primer) gồm: Hai đoạn mồi chuyên biệt mồi xuôi “sens primer” hay “forward primer” mồi ngược “antinsens primer” hay 13 “reverse primer”, chúng đoạn DNA mạch đơn ngắn (olgonucleotide) có khả bắt cặp bổ sung với đầu 3’ theo chiều phiên mã gen - dNTP gồm loại: dATP, dTTP, dCTP dGTP - Ethydium bromid III CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nguyên lý Phản ứng chuỗi polymerase kỹ thuật đơn giản cho phép nhân nhanh trình tự DNA lên nhiều lần vài PCR thực có khn, Taq-polymerase, mồi chun biệt gồm, bốn loại deoxyribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm ion Mg2+ 3.2 Các bước thực Bước 1: Làm tan băng hóa chất cho phản ứng PCR - Các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR bảo quản -200C, trước thực phản ứng cần phải làm tan băng loại hóa chất cách đưa ống hóa chất mơi trường ngồi Để tan từ từ nhiệt độ phịng tồn khối hóa chất trạng thái dung dịch - Đảo trộn hóa chất máy vortex sau spindown để dung dịch bám thành nắp ống di chuyển xuống phần ống Bước 2: Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR - Mỗi mẫu chuẩn bị eppendorf 0,1-0,2ml mới, vô trùng - Sử dụng bút CD đánh dấu tên mẫu lên nắp ống thân ống - Sử dụng micropipette phù hợp để lấy hóa chất cho phản ứng PCA với thành phần bảng - Trộn thành phần nêu ống eppedorp loại 1,5ml đưa vào ống PCR với thể tích 25μl đến 50μl, cho vào máy ly tâm tốc độ nhẹ (spin) 3000 vòng/phút Bước nhằm để thành phần nêu lắng xuống đáy ống PCR Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR dương tính sau: TT Thành phần phản ứng Hàm lượng (µl) 10x Buffer 2,5 25 mM MgCl2 1,5 14 Primer F 1,0 Primer R 1,0 100 µM dNTPs 1,5 5U DNA taq polymerase 0,2 DNA khuôn 2,0 H2O khử ion 15,3 Tổng 25 Bước 3: Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sau khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu từ đậu tương sử dụng cặp mồi Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sau: - Biến tính ban đầu: 94oC phút - Khuếch đại: 35 chu kỳ gồm bước: + Biến tính: 94oC 30 giây + Gắn mồi: 55oC 30 giây + Kéo dài: 72oC 45 giây - Kéo dài cuối cùng: 72oC phút - Ủ bảo quản: 4oC ∞ - Bước 3: Kiểm tra sản phẩm nhân gen phương pháp điện di agarose 1% 40 phút - Bước 4: Nhuộm gel ethydium bromid 10 phút - Bước 5: Soi chụp ảnh 15 IV KẾT QUẢ Hình 2: Hình ảnh sản phẩm chạy PCR Nhận xét: - Phản ứng PCP thực tốt, khơng có tượng nhiễm chéo - Xuất băng rõ nét đường chạy (giếng số 5, số 6) mẫu số PCR thành công, đặc hiệu - Mẫu số 2, số 14 có sản phẩm PCR khơng đặc hiệu - Các mẫu cịn lại khơng có sản phẩm Có nhiều ngun nhân ví dụ khơng có DNA khuôn hay DNA khuôn không nguyên vẹn bị đứt gãy nhiều, thao tác thí nghiệm… 16 Mục lục Bài 1: Tách chiết DNA tổng số Trang Bài 2: Điện di Trang Bài 3: Kĩ thuật PCR Trang 13 17