Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu vi nấm trong nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá lóc (Channa striata) thâm canh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỤY MAI THY NGHIÊN CỨU VI NẤM TRONG NI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ LĨC (Channa striata) THÂM CANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Mã ngành 62620301 Cần Thơ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỤY MAI THY NGHIÊN CỨU VI NẤM TRONG NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ LÓC (Channa striata) THÂM CANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Mã ngành 62620301 Cán hƣớng dẫn: PGS TS PHẠM MINH ĐỨC PGS TS TRẦN THỊ TUYẾT HOA Cần Thơ, 2017 LỜI CẢM TẠ Kính gởi lời chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, Ban lãnh đạo Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Sau Đại học phòng ban khác Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình đào tạo tiến sĩ Hơn nữa, xin cám ơn Bộ Giáo dục Đào tạo hỗ trợ nguồn kinh phí giúp tơi hồn thành chương trình nghiên cứu Với tất lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn PGS TS Phạm Minh Đức dành thời gian q báu, hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận án tốt nghiệp Đặc biệt, xin trân trọng cảm ơn PGS TS Trần Thị Tuyết Hoa sẵn sàng hướng dẫn, hỗ trợ tơi q trình học tập nghiên cứu khoa học Xin chân thành cảm ơn tập thể Quý Thầy Cô em thuộc Bộ môn Bệnh học Thủy sản giúp đỡ, chia khó khăn, khuyến khích động viên Và xin cảm ơn tất bạn nghiên cứu sinh em sinh viên đại học hỗ trợ thời gian thực đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn sâu sắc gia đình người thân dành cho tơi tất tình u khuyến khích, ủng hộ để tơi có đủ nghị lực hồn thành luận án nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn tất NCS ĐẶNG THỤY MAI THY TÓM TẮT Vi nấm tác nhân gây bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) cá lóc (Channa striata) ni ao thâm canh năm gần Nghiên cứu thực nhằm xác định đặc điểm bệnh học, sinh học vi nấm gây bệnh cá tra cá lóc, hóa chất thảo dược sử dụng phòng trị bệnh vi nấm làm sở đề xuất biện pháp phòng trị bệnh vi nấm Tổng số 60 mẫu nước, 153 mẫu cá tra 197 mẫu cá lóc thu định kỳ ao cá tra cá lóc An Giang Cần Thơ tháng chu kỳ nuôi Cá tra giống (116 mẫu) cá tra giai đoạn nuôi thương phẩm (207 mẫu) bệnh trương bóng thu tỉnh An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long Đồng Tháp Cá lóc bệnh (242 mẫu) thu tỉnh An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Vĩnh Long Trà Vinh Kết nghiên cứu xác định được: (i) chín (09) giống vi nấm gồm Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Aspergillus, Fusarium Tricoderma xuất môi trường nước ao nuôi cá tra cá lóc; (ii) Năm (05) giống vi nấm gồm Achlya, Saprolegnia, Mucor, Aspergillus Fusarium phân lập từ cá tra bệnh Cá tra bị trương bóng có tỉ lệ nhiễm Fusarium đến 94,8%; (iii) Năm (05) giống vi nấm gồm Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Aspergillus Fusarium phân lập từ cá lóc bệnh Nghiên cứu xác định đặc điểm bệnh học vi nấm gây bệnh cá tra cho thấy Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) tác nhân gây bệnh trương bóng cá tra chủng F1509 có khả gây bệnh cao Mơ bóng cá tra bệnh bị biến đổi cấu trúc tế bào biểu mô, mô sợi mô liên kết bị thối hóa hoại tử Đặc biệt, bên xoang bóng có diện dày đặc sợi nấm Đặc điểm hình thái chủng vi nấm gây bệnh giống Kết nghiên cứu xác định chủng Achlya bisexualis có khả gây bệnh cá lóc chủng ĐT0232 có độc lực cao Cá lóc mẫn cảm với vi nấm A bisexualis cá tra Nghiên cứu mô bệnh học ghi nhận nhiều sợi nấm xuất vết thương da, tế bào biểu mô bị hoại tử Hiện tượng thối hóa ghi nhận lớp biểu bì, lớp bì Sợi nấm nhiễm vào lớp biểu bì đến với xuất vài u hạt xung quanh sợi nấm Đặc điểm sinh học FIESC A bisexualis giống Nhiệt độ thích hợp cho hai lồi phát triển từ 28-33C, pH 6-8, độ mặn 0-0,5% Vi nấm sử dụng carbohydrate chủ yếu glucose sucrose Trong môi trường có NO2 nồng độ 5mM FIESC A bisexualis tồn phát triển Bronopol iodne ức ii chế FIESC nồng độ ≥400 mg/L CuSO4 ≥200 mg/L A bisexualis bị ức chế nồng độ bronopol CuSO4 ≥100 mg/L, iodine ≥200 mg/L Cỏ mực ức chế phát triển A bisexualis Fusarium incarnatum-equiseti complex tốt diệp hạ châu Sử dụng thức ăn bổ sung 10 g cỏ mực/kg thức ăn có hiệu hạn chế nhiễm vi nấm cá lóc cá tra Từ khóa: Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc (Channa striata), Achlya bisexualis, Fusarium incarnatum-equiseti complex, bệnh nấm iii ABSTRACT Fungi have been one of the pathogen causing diseases on striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) and snakehead fish (Channa striata) cultured in intensive ponds in recent years The aim of present study is to investigate pathogenic and biological characteristics of some disease-causing fungi on striped catfish and snakehead and to evaluate effects of chemicals and herbal extracts on the prevention and treatment of fungal diseases as the basis for the management of these diseases A total of 60 water samples, 153 striped catfish samples and 197 snakehead fish samples were collected in ponds in An Giang and Can Tho over a period of 5-month production cycle Catfish fingerlings (116 samples) and swollen swim bladder fish aldults (207 samples) were collected in provinces (An Giang, Can Tho, Vinh Long and Dong Thap) Snakehead fish diseases (242 samples) were also collected from provinces (An Giang, Can Tho, Dong Thap, Hau Giang, Vinh Long and Tra Vinh) Results showed that (i) nine fungal genera Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Aspergillus, Fusarium and Tricoderma were identified from the water samples; (ii) five fungal genera Fusarium, Aspergillus, Achlya, Saprolegnia and Mucor were identified from striped catfish Fusarium was detected as the causative agent of swollen swim bladder in striped catfish with a high infection rate of 94.8% (iii) five fungal genera Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Aspergillus Fusarium were identified from snakehead This study showed that Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) caused swollen swim bladder in striped catfish and the F1509 strain had the highest virulence Histopathology of swim bladder was changed and the epithelial cell, fibrio and connective tissue showed degeneration and necrosis A dense presence of fungal hyphae was found in the sinus of the swim bladder Morphological characteristics of the strains were similar Another result was that the five strains of Achlya bisexualis were the causative agents in snakehead, of which the ĐT0232 strain had the highest virulence Snakehead was sensitive to fungal diseases more than striped catfish A histopathological examination of the snakehead skin showed degeneration in the epidermis, dermis and underlying muscle The hyphae were observed to penetrate into the epidermis to the musculature with some granulomatous response surrounding the hyphae iv Biological characteristics of Achlya bisexualis and Fusarium incarnatumequiseti complex were the same The optimal temperature of FIESC ranged from 28oC to 33oC, pH level was 6-8 and salinity was 0-0,5% The strains could use glucose and sucrose FIESC and A bisexualis could survive and grow in the media supplied with nitrite (5mM) Bronopol and iodne inhibited FIESC, which were at the concentration of ≥400 ppm and CuSO4 at ≥200 ppm Similarly, Achlya bisexualis was inhibited with concentrations of bronopol and CuSO4 at ≥100 ppm, and iodine at ≥200 ppm False daisy (Eclipta prostrata) showed better inhibition than chamber bitter (Phyllanthus niruri) extracts in the hyphal growth of A bisexualis and Fusarium incarnatum-equiseti complex Using false daisy with the concentration of 10g/kg was effective with fungal diseases on both P hypophthalmus and C striata Keyword: Striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus), snakehead fish (Channa striata), Achlya bisexualis, Fusarium incarnatum-equiseti species complex, fungal diseases v Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác Cần thơ, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh ĐẶNG THỤY MAI THY vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii ABSTRACT iv LỜI CAM KẾT vi MỤC LỤC vii DANH SÁCH BẢNG xi DANH SÁCH HÌNH xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xv Chƣơng 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa luận án 1.6 Điểm luận án CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm vi nấm 2.1.1 Cấu tạo vi nấm 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm sinh sản vi nấm 2.2 Một số nghiên cứu vi nấm môi trường nước 10 2.3 Nghiên cứu vi nấm gây bệnh động vật thủy sản 12 2.3.1 Bệnh vi nấm Saprolegniasis 12 2.3.2 Bệnh vi nấm Fusarium 17 2.3.3 Bệnh vi nấm khác 20 2.3.4 Bệnh vi nấm cá Việt Nam 21 2.4 Nghiên cứu hóa chất phịng trị bệnh vi nấm động vật thủy sản 22 2.4.1 Bronopol 22 2.4.2 Iodine 23 2.4.3 Đồng sunfat 24 2.5 Một số nghiên cứu thảo dược phòng trị bệnh động vật thủy sản 25 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Đối tượng nghiên cứu 28 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 vii 3.3 Vật liệu nghiên cứu 28 3.3.1 Môi trường nuôi cấy vi nấm, thuốc kháng sinh, 28 3.3.2 Dụng cụ thiết bị 28 3.4 Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1 Xác định thành phần giống lồi vi nấm mơi trường ao ni 30 3.4.1.1 Phương pháp thu mẫu 30 3.4.1.2 Phương pháp phân tích mẫu nước 30 3.4.1.3 Phương pháp định danh vi nấm 30 3.4.2 Xác định thành phần giống loài vi nấm nhiễm cá tra cá lóc 31 3.4.2.1 Phương pháp thu mẫu 31 3.4.2.2 Phương pháp phân lập vi nấm 33 3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học vi nấm gây bệnh cá tra cá lóc 33 3.4.3.1 Nguồn cá tra cá lóc khỏe sử dụng thí nghiệm cảm nhiễm 33 3.4.3.2 Phương pháp nuôi cấy sinh bào tử vi nấm 34 3.4.3.3 Thí nghiệm cảm nhiễm cá tra: 34 3.4.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm cá tra: 35 3.4.3.5 Thí nghiệm cảm nhiễm cá tra: 36 3.4.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễm cá lóc: 37 3.4.3.7 Thí nghiệm cảm nhiễm cá lóc: 38 3.4.3.8 Thí nghiệm cảm nhiễm cá tra cá lóc: 39 3.4.4 Phương pháp định danh vi nấm 40 3.4.4.1 Phương pháp định danh truyền thống 40 3.4.4.2 Phương pháp sinh học phân tử định danh vi nấm 40 3.4.5 Phương pháp mô học 42 3.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi nấm gây bệnh cá tra cá lóc 42 3.4.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển vi nấm 42 3.4.6.2 Ảnh hưởng pH đến khả phát triển vi nấm 43 3.4.6.3 Ảnh hưởng độ mặn đến khả phát triển vi nấm 43 3.4.6.4 Khả sử dụng carbohydrat vi nấm 43 3.4.6.5 Khả sử dụng nitrite vi nấm 44 3.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng hóa chất thảo dược đến vi nấm điều kiện phịng thí nghiệm 44 3.4.8 Thí nghiệm sử dụng cỏ mực phịng bệnh vi nấm điều kiện phịng thí nghiệm 46 3.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 47 viii KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH THỐNG KÊ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN SỢI NẤM Achlya bisexualis ĐT0105 Anova: Single Factor ANOVA Source of Variation SS df MS F Between Groups 12819.82 4273.272 961.7447 Within Groups 71.092 16 4.44325 Total 12890.91 19 P-value F crit 2.8496E-18 3.238872 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN BÀO TỬ Achlya bisexualis AG0205 Anova: Single Factor ANOVA Source of Variation SS df MS F Between Groups 2171476 723825.3 172.5962 Within Groups 67100 16 4193.75 Total 2238576 19 173 P-value F crit 2.1463E-12 3.238872 KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH THỐNG KÊ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN BÀO TỬ Achlya bisexualis Anova: Single Factor ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total CT0109 SS 1561911 63949.6 1625861 df MS 16 19 520637.1 3996.85 F 130.2619 ĐT0332 Anova: Single Factor ANOVA Source of Variation SS df MS F Between Groups 1890007 630002.2 106.4831 Within Groups 94663.2 16 5916.45 Total 1984670 19 174 P-value 1.8787E-11 F crit 3.238872 P-value F crit 8.7515E-11 3.238872 KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH THỐNG KÊ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN BÀO TỬ Achlya bisexualis CT0403 Anova: Single Factor ANOVA Source of SS df MS F Variation Between Groups 1868223 622740.9 275.1898 Within Groups 36207.2 16 2262.95 Total 1904430 19 ĐT0105 Anova: Single Factor ANOVA Source of Variation SS df MS F Between Groups 2115469 705156.5 168.2941 Within Groups 67040.4 16 4190.025 Total 2182510 19 175 P-value F crit 5.6505E-14 3.238872 P-value F crit 2.6096E-12 3.238872 PHỤ LỤC G - THÍ NGHIỆM BRONOPOL VÀ Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC) Nồng độ (ppm) 50 100 200 300 400 SỢI NẤM FVN1301 71 73 68 67 69 38 45 42 39 35 15 16 16 17 19 12 9 11 0 0 0 0 0 BÀO TỬ F1401 F1402 F1503 F1509 76 76 77 71 72 45 36 45 41 39 16 21 17 19 16 5 10 0 0 0 0 0 74 75 72 68 70 51 46 41 37 46 18 17 15 21 21 16 11 0 0 0 0 0 77 74 78 70 70 50 49 45 42 56 18 29 22 22 25 11 5 12 0 0 0 0 0 176 78 76 81 73 70 43 46 34 36 41 19 20 18 20 20 0 0 0 0 0 FVN1301 1340 1160 1020 1280 1360 795 706 807 785 692 420 425 427 422 429 150 161 163 254 168 53 55 37 60 63 0 0 F1401 F1402 F1503 F1509 1100 1230 1250 1190 1260 794 797 799 696 695 488 392 392 484 387 146 155 160 136 146 14 16 58 20 21 0 0 1250 1130 1060 1180 1200 694 703 704 683 801 457 460 562 562 470 237 253 255 226 241 21 31 35 43 54 0 0 1350 1160 1200 1120 1110 946 855 760 836 746 595 606 607 585 592 320 225 227 322 229 70 58 51 56 56 0 0 1220 1250 1140 1130 1240 843 746 834 736 841 519 420 418 520 420 257 260 262 262 270 31 32 25 37 37 0 0 PHỤ LỤC G - KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH THỐNG KÊ THÍ NGHIỆM BRONOPOL VÀ VI NẤM Fusarium incarnatum-equiseti complex Anova: Single Factor ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Anova: Single Factor ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total SS df 62066.03 1511.68 96 63577.71 99 SS 21008598 507062.1 21515660 MS F P-value F crit 20688.68 1313.84 8.8E-78 2.69939 15.74667 df MS 5252150 120 4225.517 124 177 F 1242.96 P-value F crit 1.3E-96 2.44724 PHỤ LỤC G - THÍ NGHIỆM BRONOPOL VÀ Achlya bisexualis Nồng độ (ppm) 50 100 200 300 400 SỢI NẤM BÀO TỬ AG0205 ĐT0232 ĐT0105 CT0109 CT0403 AG0205 ĐT0232 ĐT0105 CT0109 CT0403 71 73 68 67 69 32 31 32 39 33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 76 76 77 71 72 40 42 45 36 39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 74 75 72 68 70 31 33 33 37 39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 77 74 78 70 70 41 39 35 35 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 78 76 81 73 70 33 36 34 36 41 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 178 1340 1160 1020 1280 1360 696 606 570 585 592 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1100 1230 1250 1190 1260 794 732 711 682 672 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1250 1130 1060 1180 1200 590 603 623 651 679 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1350 1160 1200 1120 1110 646 655 634 636 611 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1220 1250 1140 1130 1240 644 654 638 636 655 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 PHỤ LỤC G - KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH THỐNG KÊ THÍ NGHIỆM BRONOPOL VÀ VI NẤM Achlya bisexualis t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances mg/L Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T