Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (peg và pluronic) ứng dụng mang thuốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC) ỨNG DỤNG MANG THUỐC Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử tổ hợp Mã số: 62.44.01.25 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU TP Hồ Chí Minh - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC) ỨNG DỤNG MANG THUỐC Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử tổ hợp Mã số: 62.44.01.25 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN CỬU KHOA TS TRẦN NGỌC QUYỂN TP Hồ Chí Minh - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Cơng trình thực phịng Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thành phố Hồ Chí Minh; phịng thí nghiệm Hóa Hữu trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh - Cơ sở Quảng Ngãi Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn khoa học PGS TS Nguyễn Cửu Khoa TS Trần Ngọc Quyển Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực, hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác Tác giả luận án Nguyễn Thị Trâm Châu ii LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa TS Trần Ngọc Quyển, người Thầy dành cho động viên giúp đỡ tận tình định hướng khoa học hiệu suốt trình thực luận án Tôi xin cảm ơn giúp đỡ khích lệ cán bộ, đồng nghiệp khác trường Đại học Công Nghiệp TP HCM Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Viện Khoa học vật liệu q trình thực luận án Tơi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trường Đại học Công Nghiệp TP HCM trình thực luận án Luận án hỗ trợ kinh phí đề tài nghiên cứu Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 106.YS.99-2013.29 Sau cùng, xin cảm ơn thực quên giúp đỡ tận tình thầy cơ, bạn bè, anh em xa gần động viên, tạo điều kiện người thân gia đình suốt q trình tơi hồn thành luận án Tp HCM, tháng 10 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Trâm Châu iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 DENDRIMER 1.1.1 Giới thiệu dendrimer 1.1.2 Tính chất dendrimer 1.1.3 Yếu tố ảnh hưởng lên dendrimer 10 1.1.4 Phương pháp tổng hợp dendrimer 14 1.2 DENDRIMER POLYAMIDOAMINE 16 1.2.1 Khái niệm dendrimer polyamidoamine 16 1.2.2 Phương pháp nang hóa thuốc dendrimer PAMAM 20 1.3 Ý NGHĨA CỦA VIỆC BIẾN TÍNH CHẤT MANG NANO DENDRIMER PAMAM LÀM CHẤT MANG THUỐC 21 1.4 CÁC CHẤT BIẾN TÍNH NHĨM AMINE TRÊN BỀ MẶT CỦA DENDRIMER PAMAM 23 1.4.1 Polyethylene glycol 23 1.4.2 Pluronic 24 1.5 Ý NGHĨA ỨNG DỤNG DENDRIMER PAMAM LÀM CHẤT MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ 27 1.5.1 Dendrimer phân phối thuốc tới đích thụ động 28 1.5.2 Dendrimer phân phối thuốc tới đích chủ động 29 1.5.3 Thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) 29 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC HỆ NANO DENDRIMER MANG THUỐC 31 1.6.1 Các nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM nhằm giảm độc tính 31 1.6.2 Các nghiên cứu tăng cường hiệu mang giải phóng thuốc hệ dendrimer PAMAM biến tính với PEG Pluronic 34 iv 1.6.3 Các nghiên cứu dendrimer PAMAM biến tính với polymer khác 41 Chương NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 44 2.1 HÓA CHẤT .44 2.2 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 45 2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 46 2.3.1 Tổng hợp dendrimer PAMAM đến hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine (EDA) 46 2.3.2 Biến tính dendrimer PAMAM hệ G2.0, G3.0, G4.0 G5.0 PEG4K, PEG6K, PEG10K PEG12K 51 2.3.3 Biến tính dendrimer PAMAM hệ G2.0, G3.0, G4.0 G5.0 Pluronic P123, F68, F127 F108 55 2.3.4 Tổng hợp chất mang nano PAMAM G4.0-F127 với tỷ lệ mol PAMAM G4.0 : F127 khác 59 2.3.5 Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên loại dendrimer PAMAM-PEG 60 2.3.6 Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên loại dendrimer PAMAMPluronic .61 2.3.7 Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU PAMAM G4.0-PEG/5-FU in vitro đệm PBS .63 2.3.8 Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU PAMAM G4.0-Pluronic/5-FU in vitro đệm PBS 64 2.3.9 Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro đệm PBS 65 2.3.10 Phương pháp xác định độc tính tế bào chất mang nano 65 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70 3.1 TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0 70 3.1.1 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS 70 3.1.2 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR 72 3.2 TỔNG HỢP PAMAM-PEG .78 v 3.2.1 Kết phân tích 1H-NMR sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPCPEG-TA, PAMAM PAMAM-PEG 78 3.2.2 Kết phân tích FTIR PAMAM PAMAM-PEG 83 3.2.3 Kết GPC PAMAM-PEG 84 3.2.4 Kết TEM PAMAM PAMAM-PEG 89 3.3 TỔNG HỢP PAMAM-PLURONIC 89 3.3.1 Kết phân tích 1H-NMR sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPCPlu-TA, PAMAM PAMAM-Pluronic 90 Để tổng hợp PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với Pluronic cần phải hoạt hóa nhóm -OH đầu cuối mạch Pluronic pnitrophenyl chloroformate (NPC) tạo sản phẩm NPC-Plu-NPC theo phản ứng sau: 90 3.3.2 Kết phân tích FTIR PAMAM PAMAM-Pluronic 94 3.3.3 Kết GPC PAMAM-Pluronic 95 d Kết GPC PAMAM-F108 .100 3.3.4 Kết TEM PAMAM PAMAM-Pluronic 101 3.4 SO SÁNH KHẢ NĂNG BIẾN TÍNH CỦA DENDRIMER PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 BẰNG CÁC BIOPOLYMER (PEG VÀ PLURONIC) .102 3.4.1 Kết biến tính dendrimer PAMAM với PEG 102 3.4.2 Kết biến tính dendrimer PAMAM với Pluronic 103 3.5 TỔNG HỢP CHẤT MANG NANO PAMAM G4.0-F127 VỚI CÁC TỶ LỆ MOL KHÁC NHAU .105 3.6 NANG HÓA THUỐC CHỐNG UNG THƯ 5-FLUOROURACIL TRONG CÁC CHẤT MANG NANO 106 3.6.1 Nang hóa thuốc chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0 G5.0 108 3.6.2 Nang hóa thuốc 5-FU polymer PEG Pluronic 110 3.6.3 Nang hóa thuốc 5-FU chất mang dendrimer PAMAM-PEG 111 3.6.4 Nang hóa thuốc 5-FU chất mang dendrimer PAMAM-Pluronic 118 vi 3.6.5 So sánh hiệu nang hóa thuốc 5-FU chất mang nano dendrimer PAMAM-PEG 124 3.6.6 So sánh hiệu nang hóa thuốc 5-FU chất mang nano dendrimer PAMAM-Pluronic 126 3.7 KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA PAMAM G4.0-PEG/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI TRƯỜNG ĐỆM PBS (pH=7.4) 129 3.8 KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA PAMAM G4.0-PLURONIC/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI TRƯỜNG ĐỆM PBS (pH=7.4) 129 3.9 KẾT QUẢ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA HỆ CHẤT MANG NANO DẪN TRUYỀN 5-FU .130 3.9.1 Kết gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 hệ chất mang nano dẫn truyền 5-FU 130 3.9.2 Kết gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) hệ chất mang nano dẫn truyền 5-FU .132 KẾT LUẬN .136 KIẾN NGHỊ 138 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .139 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 33,101C + 27,857 PL1 Phụ lục Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 17346C – 26,26 PL2 Phụ lục Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 14732C + 45,44 PL3 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-PEG-NPC PL4 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-PEG-TA PL5 Phụ lục Phổ 1H-NMR PAMAM-PEG PL6 Phụ lục Phổ FTIR PAMAM PAMAM-PEG PL7 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-Plu-NPC PL8 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-Plu-TA PL10 vii Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR PAMAM-Pluronic PL11 Phụ lục 11 Bảng thống kê kết giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng PL12 Phụ lục 12 Bảng thống kê kết giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0PEG6K/5-FU PL13 Phụ lục 13 Bảng thống kê kết giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0P123/5-FU PL14 Phụ lục 14 Bảng thống kê kết giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0F127/5-FU PL15 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Thông số đặc trưng Polyethylene glycol 24 Bảng 1.2 Thông số đặc trưng Pluronic .26 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 44 Bảng 2.2 Bảng số liệu dendrimer PAMAM hệ lẻ 47 Bảng 2.3 Bảng số liệu dendrimer PAMAM hệ chẵn 47 Bảng 2.4 Thành phần khối lượng chất tham gia phản ứng tổng hợp PAMAM-PEG 53 Bảng 2.5 Thành phần khối lượng chất tham gia phản ứng tổng hợp PAMAM-Pluronic .57 Bảng 2.6 Thành phần khối lượng chất tham gia phản ứng tổng hợp PAMAM-F127 với tỷ lệ mol khác 59 Bảng 3.1 Khối lượng phân tử dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS .71 Bảng 3.2 Khối lượng phân tử dựa 1H-NMR PAMAM G-0.5 đến G5.0 77 Bảng 3.3 Khối lượng phân tử độ biến tính PAMAM-PEG4K (PAMAM G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K PAMAM G5.0PEG4K) .85 Bảng 3.4 Khối lượng phân tử độ biến tính PAMAM-PEG6K (PAMAM G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K G5.0-PEG6K) 86 Bảng 3.5 Khối lượng phân tử độ biến tính PAMAM-PEG10K (PAMAM G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K PAMAM G5.0-PEG10K) 87 Bảng 3.6 Khối lượng phân tử độ biến tính PAMAM-PEG12K (PAMAM G2.0-PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, PAMAM G4.0-PEG12K PAMAM G5.0-PEG12K) 88 Bảng 3.7 Khối lượng phân tử độ biến tính PAMAM-P123 (PAMAM G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 PAMAM G5.0-P123) 96 122 Zhu S, Hong M, Zhang L, Tang G, Jiang Y, Pei Y, (2010), PEGylated PAMAM dendrimer-doxorubicin conjugates: in vitro evaluation and in vivo tumor accumulation, 27(1):161-74 doi: 10.1007/s11095-009-9992-1 Epub 2009 Oct 28; 123 Zhu S, Qian L, Hong M, Zhang L, Pei Y, Jiang Y, (2011), RGD- modified PEG-PAMAM-DOX conjugate: in vitro and in vivo targeting to both tumor neovascular endothelial cells and tumor cells Adv Mater; 23(12): H84-9, doi: 10.1002/adma.201003944 Epub 2011 Mar 1; 124 Zhuojun Gu, Meng Wang, Qiongyan Fang, Huaiyu Zheng , Feiyue Wu, Dai Lin, Ying Xu, and Yi Jin (2014), Preparation and in vitro characterization of Pluronic-attached polyamidoamine dendrimers for drug delivery, Drug Dev Ind Pharm, ISSN: 0363-9045 (print), 1520-5762 (electronic), DOI: 10.3109/03639045.2014.908899; PL1 Phụ lục Xây dựng phương trình đường chuẩn sau: A = 33,101C + 27,857 (đường chuẩn độ hấp thu A nồng độ 5-FU) Mẫu nước thẩm tách bơm vào vial để tiêm mẫu tự động Lượng mẫu tiêm (Inj Volume) 20 μL, dung môi chạy cột ACN:H2O tỷ lệ 1:9, tốc độ bơm mL/phút Tiến hành đo độ hấp thu A bước sóng 260nm ta có độ hấp thu dung dịch 5-Fluorouracil chuẩn sau: Bảng P.1: Độ hấp thu dung dịch 5-FU chuẩn bước sóng 260 nm STT Nồng độ dung dịch chuẩn C (ppm) Độ hấp thu A 0 20 744,8 40 1352,2 60 1976,2 80 2670 100 1605.171 Qua ta dựng đồ thị đường chuẩn sau: 4000 y = 33,101x + 27,857 R² = 0,9993 Area (mAU*s) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ 5-FU(µg/ml) Hình P.1: Đồ thị đường chuẩn 5-FU Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn sau: A = 33,101C + 27,857 PL2 Phụ lục Xây dựng phương trình đường chuẩn sau: A = 17346C – 26,26 (đường chuẩn độ hấp thu A nồng độ 5-FU) Mẫu nước thẩm tách bơm vào vial để tiêm mẫu tự động Lượng mẫu tiêm (Inj Volume) 10 μL, dung môi chạy cột ACN:H2O tỷ lệ 1:9, tốc độ bơm mL/phút Tiến hành đo độ hấp thu A bước sóng 260nm ta có độ hấp thu dung dịch 5-Fluorouracil chuẩn sau: Bảng P.2: Độ hấp thu dung dịch 5-FU chuẩn bước sóng 260nm STT Nồng độ dung dịch chuẩn C (ppm) Độ hấp thu A 0 0,005 44,3 0,01 130 0,05 902,7 0,1 1680 Area [mAU*s] Qua ta dựng đồ thị đường chuẩn sau: 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 y = 17346x - 26,26 R² = 0,9971 0,02 0,04 0,06 0,08 Nồng độ [mg/mL] 0,1 0,12 Hình P.2: Đồ thị đường chuẩn 5-FU Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn sau: A = 17346C – 26,26 PL3 Phụ lục Xây dựng phương trình đường chuẩn sau: A = 14732C + 45,44 (đường chuẩn độ hấp thu A nồng độ 5-FU) Mẫu nước thẩm tách bơm vào vial để tiêm mẫu tự động Lượng mẫu tiêm (Inj Volume) 10 μL, dung môi chạy cột ACN:H2O tỷ lệ 1:9, tốc độ bơm mL/phút Tiến hành đo độ hấp thu A bước sóng 260nm ta có độ hấp thu dung dịch 5-Fluorouracil chuẩn sau: Bảng P.3: Độ hấp thu dung dịch 5-FU chuẩn bước sóng 260nm STT Nồng độ dung dịch chuẩn C (mg/ml) Độ hấp thu A 0.00125 29.189 0.0025 51.429 0.005 97.886 0.01 201.425 0.05 782.057 0.1 1605.171 Độ hấp thu (A) Từ ta dựng đồ thị đường chuẩn sau: 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 y = 14732x + 45.44 R² = 0.9999 0,02 0,04 0,06 0,08 Nồng độ C (mg/ml) 0,1 0,12 Hình P.3: Đồ thị đường chuẩn 5-FU Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn sau: A = 14732C + 45,44 PL4 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-PEG-NPC (1) Phổ 1H-NMR NPC-PEG6K-NPC (2) Phổ 1H-NMR NPC-PEG12K-NPC PL5 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-PEG-TA (1) Phổ 1H-NMR NPC-PEG6K-TA (2) Phổ 1H-NMR NPC-PEG10K-TA PL6 Phụ lục Phổ 1H-NMR PAMAM-PEG (1) Phổ 1H-NMR PAMAM G4.0-PEG6K (2) Phổ 1H-NMR PAMAM G4.0-PEG10K PL7 Phụ lục Phổ FTIR PAMAM PAMAM-PEG (1) Kết phổ FTIR PAMAM-PEG4K (2) Kết phổ FTIR PAMAM-PEG6K PL8 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-Plu-NPC (1) Phổ 1H-NMR NPC-F68-NPC (2) Phổ 1H-NMR NPC-F127-NPC PL9 (3) Phổ 1H-NMR NPC-F108-NPC PL10 Phụ lục Phổ 1H-NMR NPC-Plu-TA (1) Phổ 1H-NMR NPC-F68-TA (2) Phổ 1H-NMR NPC-F108-TA PL11 Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR PAMAM-Pluronic Phổ 1H-NMR PAMAM G4.0-F68 PL12 Phụ lục 11 Bảng thống kê kết giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng (được thực lần) 5-FU (A= 14732C +45,442) Thời Mẫu Mẫu Mẫu STT gian (giờ) Area 5-FU Area 5-FU Area 5-FU Trung bình Độ lệch chuẩn % 1 1268.9 0.9966 1196.1 0.9373 989.13 0.7687 0.9008 0.1182 90.08 79.38 1.0242 93.87 1.0637 81.384 0.9891 84.793 0.8208 0.9579 0.1244 95.79 12 54.188 1.0708 46.559 0.99 42.167 0.8182 0.9596 0.1290 95.96 24 60.847 1.0833 41.839 0.987 43.948 0.817 0.9624 0.1348 96.24 48 80.875 1.1122 70.466 1.0074 76.232 0.842 0.9872 0.1362 98.72 72 63.139 1.1266 41.089 1.0039 48.128 0.8442 0.9916 0.1416 99.16 96 65.204 1.1427 40.396 0.9998 45.987 0.8447 0.9957 0.1490 99.57 73.09 0.9598 70.101 0.7888 0.9243 0.1217 92.43 PL13 Phụ lục 12 Bảng thống kê kết giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU (được thực lần) G4.0-PEG6K/5-FU (A = 17346C - 26,26) Thời Mẫu Mẫu Mẫu STT gian Trung bình Độ lệch chuẩn % (giờ) Area 5-FU Area 5-FU Area 5-FU 1 16.3 0.0294 16.4 0.0295 24.3 0.035 0.0313 0.0032 3.13 12.8 0.0565 13.7 0.0572 17.3 0.0651 0.0596 0.0048 5.96 11.3 0.0824 12.7 0.0841 12.9 0.0922 0.0863 0.0052 8.63 12 11.3 0.1084 11.5 0.1102 12.9 0.1193 0.1127 0.0058 11.27 24 12.5 0.1352 13 0.1374 14.1 0.1472 48 9.4 0.1599 12.6 0.1643 14.9 0.1757 0.1666 0.0082 16.66 72 13.6 0.1875 13.7 0.1919 15 0.2042 0.1945 0.0087 19.45 96 13.7 0.2151 13.7 0.2196 15.8 0.2333 0.2227 0.0095 22.27 0.14 0.0064 14.00 PL14 Phụ lục 13 Bảng thống kê kết giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-P123/5-FU (được thực lần) G4.0-P123/5-FU (A = 17346C - 26,26) Thời Mẫu Mẫu Mẫu STT gian Trung bình Độ lệch chuẩn % (giờ) Area 5-FU Area 5-FU Area 5-FU 1 16.9 0.0299 14.7 0.0283 18.5 0.0310 0.0297 0.0014 2.97 11.6 0.0560 12.2 0.0549 16.4 0.0605 0.0572 0.0030 5.72 11.1 0.0819 11.5 0.0811 12.1 0.0870 0.0833 0.0032 8.33 12 10.8 0.1075 11.9 0.1075 12.2 0.1136 0.1095 0.0035 10.95 24 12.5 0.1343 12.7 0.1344 15.3 0.1424 0.1370 0.0046 13.70 48 10.7 0.1599 12.4 0.1612 15.2 0.1711 0.1640 0.0061 16.40 72 12.9 0.1870 16.2 0.1905 15.9 0.2002 0.1926 0.0068 19.26 96 13.6 0.2146 12.7 0.2175 14.9 0.2287 0.2203 0.0074 22.03