Nghiên cứu sản xuất và nâng cao hoạt độ enzyme cellulase từ nấm mốc aspergillius oryzae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ NÂNG CAO HOẠT ĐỘ ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE GVHD: ThS NGUYỄN QUANG DUY SVTH: DƯƠNG THỊ QUỲNH NHƯ NGUYỄN HỒNG VĨNH PHƯỚC SKL009132 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7/2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022-18116195 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ NÂNG CAO HOẠT ĐỘ ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE GVHD: ThS NGUYỄN QUANG DUY SVTH: DƯƠNG THỊ QUỲNH NHƯ MSSV: 18116195 SVTH: NGUYỄN HOÀNG VĨNH PHƯỚC MSSV: 18116198 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 07/202 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2022-18116195 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ NÂNG CAO HOẠT ĐỘ ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE GVHD: ThS NGUYỄN QUANG DUY SVTH: DƯƠNG THỊ QUỲNH NHƯ MSSV: 18116195 SVTH: NGUYỄN HOÀNG VĨNH PHƯỚC MSSV: 18116198 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 07/2022 ii NHIỆM VỤ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP iii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy Cô môn Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh Cảm ơn q Thầy Cơ ln tận tâm giảng dạy cho từ kiến thức tảng, đến kiến thức chuyên ngành suốt năm Đại học Không thế, suốt tháng miệt mài nghiên cứu thí nghiệm, Thầy Cơ ln sẵn sàng hỗ trợ tạo điều kiện trang thiết bị, hóa chất, vật liệu để chúng tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Những kiến thức mà học từ quý Thầy Cơ, ln hành trang q giá, góp phần thắp sáng cho đường công việc chúng tơi sau này! Thật thiếu sót chúng tơi khơng bày tỏ biết ơn sâu sắc đến Thầy ThS Nguyễn Quang Duy Cảm ơn Thầy nhiều, người đặt “nền móng” cho đề tài “Nghiên cứu sản xuất nâng cao hoạt độ enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus oryzae” Hơn thế, Thầy người cho lời hướng dẫn, giải pháp đáng giá, hiệu gặp bế tắc lúc thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè thân thiết ln bên động viên để cố gắng hồn thành khóa luận Bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp tránh khỏi vài thiếu sót mặt kiến thức, chúng tơi mong nhận lời góp ý đánh giá từ q Thầy Cơ để chúng tơi hồn thiện tốt không phần kiến thức khóa luận nói riêng, mà cịn kiến thức quý giá lĩnh vực khoa học thực phẩm nói chung Chúng tơi xin chân thành cảm ơn! iv LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn nội dung trình bày khóa luận tốt nghiệp tơi thực Tơi xin cam đoan nội dung tham khảo khóa luận tốt nghiệp trích dẫn xác đầy đủ theo qui định Ngày tháng năm 2022 Ký tên Dương Thị Quỳnh Như Nguyễn Hoàng Vĩnh Phước v PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN vi vii PHIẾU ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA NGƯỜI PHẢN BIỆN viii ix CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau trình nghiên cứu, rút kết luận sau:  Điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp enzyme cellulase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae nồng độ chất khơ hịa tan 7oBrix, pH= 5,5, nồng độ CMC 0,75%, thời gian lên men 72 nhiệt độ 35℃ với hoạt độ enzyme cellulase 8,69 ± 0,19 (U/ml)  Theo kết nghiên cứu, dung môi ethanol cho kết tinh thu hồi enzyme cellulase cao so với tinh muối ammonium sulphate cụ thể hoạt độ enzyme thu đạt 11,10 ± 0,22 (U/ml), hoạt độ riêng 2,06 (U/mg), hiệu suất thu hồi đạt 53,82% hệ số tinh 1,69 lần 5.2 Kiến nghị Đề tài hoàn thành khối lượng cơng việc, song cịn số vấn đề cần nghiên cứu thêm:  Khảo sát thời gian bảo quản enzyme  Nâng cao hoạt độ enzyme phương pháp sắc ký lọc gel  Sử dụng chế phẩm enzyme tinh lên xử lý cà phê nhân, so sánh hiệu xử lý với chế phẩm enzyme chưa tinh 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Sulyman, A.O., Igunnu, A., Malomo, S.O (2020) Isolation, purification and characterization of cellulase produced by Aspergillus niger cultured on Arachis hypogaea shells, pp 1-10 Adeleke, A J., Odunfa, S A., Olanbiwonninu, A., Owoseni, M C (2012) Production of cellulase and pectinase from orange peels by fungi Nature and Science, 10(5), pp 107 – 112 Andrew, S.M; Titus, J.A; Zumstein, L (2002).Dialysis and concentration of protein solutions, pp 1-5 Boshagh, F (2021) Measurement methods of carbohydrates in dark fermentative hydrogen production- A review International Journal of Hydrogen Energy, pp 24028-24050 Brigham, C., (2018) Green Chemistry: An Inclusive Approach Science Direct, pp 1025-1044 Devanathan A., Shanmugan T., Balasubramanian, Manivannan, S (2007) Cellulase production by Aspergillus niger isolated from coastal mangrove debris Trends Appl Sci Res, pp 23–27 Dutt, D., and Kumar, A (2012) Optimization of cellulase production under solid-state fermentation by Aspergillus flavus (AT-2) and Aspergillus niger (AT-3) and its impact on stickies and ink particle size of sorted office paper Cellulose Chemistry and Technology 48(3), pp 285-298 Nguyen, D Q., Huynh, H D N., Le, P H (2016) Production of cellulase and Pectinase by Using Aspergillus Oryzae in Molasses and Their Application for the Extraction of Soluble Solid Content from Coffee International Journal Of Modern Engineering Research Vol | Iss 11, pp 41-45 Ejaz, U., Sohail, M., Ghanemi, A (2021) Cellulases: From Bioactivity to a Variety of Industrial Applications Biomimetics, pp 44 Ghose, T K (1987) Measurement of cellulase activities Pure Appl.Chem 59(2) pp 257-268 Golunski, S., Astolfi, V., Carniel, N., Oliveira, D., Luccio, M., Mazutti, M.A., HelenTreichel, H (2011) Ethanol precipitation and ultrafiltration of inulinases from Kluyveromyces marxianus Separation and Purification Technology, pp 261-265 Nguyễn, T H., Nguyễn, V T (2010) Công nghệ sản xuất Chè, Cà phê, Cacao Nhà xuất Lao động Hà Nội, trang 109-118 Harcum, S (2008) Biologically Inspired Textiles Purification of protein solutions, pp 26-43 Jayasekara, S., and Ratnayake, R (2019) Microbial cellulases: An Overview and Applications, pp 1-21 Gomi, K (2014) Encyclopedia of Food Microbiology, Volume Academic Press, pp 1-3248 Kassim, E A (1982) Cellulase Enzyme from Aspergillus niger Microbiol Immunol Vol 26 (6), pp 449-454 Lê, H P (2012) Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase, cellulase ứng dụng sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men, pp 1-312 Lê, V V M., Lại, Q Đ., Nguyễn, T H., Tôn, N M N., Trần, T T H (2006) Công nghệ chế biến Thực phẩm Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM, trang 764-779 Lê, V V M., Trần, Q H (2007) Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa, trang 1-10 Lương, Đ P (1998) Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Nơng nghiệp, trang 132 Lương, Đ P (2010) Giáo trình Công nghệ lên men Nhà Xuất Giáo Dục Việt Nam, trang 27 – 28 Holtzapple, M T (2003) Encyclopedia of Food Science and Nutrition (Second Edition), Elsevier Science Ltd Ma, N B., Nguyen, D Q., Le, P H (2017) Study on Culture Conditions for A Cellulase Production From As Pergillus Unguis International Journal of Modern Engineering Research, pp 34 Mrudula, S., Murugammal, R (2011) Production of cellulose by Aspergillus niger under submerged and solid state fermentation using coir waste as a substrate Braz J Microbiol, pp 1119–1127 Mukherjee, G., and Banerjee, R., (2006) Effects of temperature, pH and additives on the activity of tannase produced by a co-culture of R oryzae and A foetidus, pp 207-212 Nguyễn, Đ L (2002) Công nghệ vi sinh tập 2, NXB Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, pp 206 Nguyễn, Đ L (2002) Công nghệ vi sinh vật (Tập 2: Vi sinh vật học công nghiệp) Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Quang Duy (2022) Thí nghiệm phân tích thực phẩm Nguyễn, T D., Nguyễn, Đ M D., Đỗ, T K L., Mai, T H A., Đặng, T N D (2020) Nghiên cứu thu hồi hoàn thiện sản phẩm lên men NXB Đại học Quốc gia, trang 1-362 Patel, A.K., Singhania, R.R., Sim, S.J., Pandey, A (2019) Thermostable cellulases: Current status and perspectives Bioresour Technol, pp 385–392 Righetti, P.G., Boschetti, E (2013) Chapter - Detailed Methodologies and Protocols LowAbundance Proteome Discovery, pp 263-319 Garg, S K., Neelakantan, S (1981) Effect of cultural factors on cellulase activity and protein production by Aspergillus terreus Biotechnology and Bioengineering, Vol XXIII, pp 1653-1659 Saini, A., Aggarwal, N.K., Sharma, A., and Yadav, A (2019) Actinomycetes: A Source of Lignocellulolytic Enzymes, pp 1-15 Shahriarinour, M., Wahab, M.N.A., Mohamad R., Mustafa S., Ariff A.B (2011) Effect of medium composition and cultural condition on cellulase production by Aspergillus terreus African Journal of Biotechnology Vol 10(38), pp 7459-7467 Soares, P.A.G., Vaz, A.F.M., Correia, M.T.S., Pessoa Jr, A., Cunha, M.G.C (2012) Separation and Purification Technology Purification of bromelain from pineapple wastes by ethanol precipitation, pp 389-395 Srivastava, N., Srivastava, M., Ramteke, P.W., Mishra, P.K (2019) New and Future Developments in Microbial Biotechnology and Bioengineering Chapter 14: Synthetic Biology Strategy for Microbial Cellulases: An Overview, pp 229-238 Kobayashi, T., Dedem, G V., Moo-Young, M (1973) Oxygen Transfer into Mycelial Pellets Biotechnology and bioengineering, Vol XV, pp 27-45 Trịnh, K S (2021) Thí nghiệm cơng nghệ lên men Trịnh, T T T., Nguyễn, T T T., Nguyễn, T L Đ., Hoàng, T N (2018) Tinh xác định đặc tính cellulase thu nhận từ Bacillus sp M5 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, pp 838-846 Yang, W., Hartwieg, E A., Fang, A., Demain, A L (2003) Effects of Carboxymethylcellulose and Carboxypolymethylene on Morphology of Aspergillus fumigatus NRRL 2346 and Fumagillin Production Current microbiology, Vol 46,pp 24–27 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Dựng đường chuẩn glucose PHỤ LỤC A.1 Nồng độ glucose độ hấp thụ dung dịch chuẩn bước sóng 540 nm Ống Nồng độ Glucose (mg/ml) Độ hấp thụ 0,1 0,072 0,2 0,214 0,3 0,369 0,4 0,519 0,5 0,751 0,6 0,813 0,7 0,945 0,8 1,111 PHỤ LỤC A.2 Đường chuẩn glucose PHỤ LỤC B Dựng đường chuẩn huyết bò PHỤ LỤC B.1 Nồng độ BSA độ hấp thu dung dịch chuẩn bước sóng 540 nm Ống Nồng độ BSA (mg/ml) 10 PHỤ LỤC B.2 Đường chuẩn huyết bò Độ hấp thụ 0,000 0,060 0,100 0,150 0,171 0,204 PHỤ LỤC C Kết xử lý thống kê SPSS thí nghiệm khảo sát điều kiện sinh tổng hợp enzyme cellulase PHỤ LỤC C.1 Kết xử lý thống kê SPSS biến hoạt độ enzyme hàm lượng chất khơ hịa tan Hoạt độ enzyme Subset for alpha = 0,05 Duncana Hàm lượng chất khơ hịa tan N 10 3,95133 4,09500 Sig 2,14233 2,73000 4,47500 5,10267 1,000 1,000 0,100 1,000 1,000 PHỤ LỤC C.2 Hoạt độ enzyme hàm lượng chất khơ hịa tan 5, 6, 7, 8, 9, 10 Brix Hàm lượng chất khơ hịa tan ( Brix) Hoạt độ enzyme (U/ml) 2,14 ± 0,07a 3,95 ± 0,17c 5,10 ± 0,12e 4,48 ± 0,09d 4,10 ± 0,03c 10 2,74 ± 0,05b *Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình độ lệch chuẩn (n = 3) *Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) PHỤ LỤC C.3 Kết xử lý thống kê SPSS biến hoạt độ enzyme nồng độ CMC Hoạt độ enzyme Nồng độ CMC (%) Duncana Subset for alpha = 0,05 N 1.5 1.91867 0.25 1.93033 1.25 0.5 3.29333 3.40600 0.75 Sig 2.48167 6.07900 0.962 1.000 0.645 1.000 PHỤ LỤC C.4 Hoạt độ enzyme nồng độ CMC 0,25% ; 0,5% ; 0,75% ; 1% ; 1,25% ; 1,5% Nồng độ CMC (%) Hoạt độ enzyme (U/ml) 0,25 1,91 ± 0,13a 0,5 3,29 ± 0,38c 0,75 6,08 ± 0,25d 3,41 ± 0,37c 1,25 2,48 ± 0,34b 1,5 1,92 ± 0,16a *Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình độ lệch chuẩn (n = 3) *Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) PHỤ LỤC C.5 Kết xử lý thống kê SPSS biến hoạt độ enzyme độ pH Hoạt độ enzyme Subset for alpha = 0,05 Duncana pH N 7,5 3,85333 4,28333 6,5 5,5 Sig 1,24333 2,05000 5,10333 6,40333 1,000 1,000 0,256 1,000 1,000 7,92333 1,000 PHỤ LỤC C.6 Hoạt độ enzyme độ pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; pH Hoạt độ enzyme (U/ml) 4,28 ± 0,22c 5,5 7,92 ± 0,18f 7,09 ± 0,12e 6,5 5,11 ± 0,32d 3,85 ± 0,17c 7,5 2,05 ± 0,07b 1,24 ± 0,08a *Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình độ lệch chuẩn (n = 3) *Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) PHỤ LỤC C.7 Kết xử lý thống kê SPSS biến hoạt độ enzyme thời gian lên men Hoạt độ enzyme Subset for alpha = 0,05 Duncana Thời gian (giờ) N 36 48 96 5,63333 60 5,91333 84 72 Sig 3,77667 4,84000 7,23333 8,80000 1,000 1,000 0,271 1,000 1,000 PHỤ LỤC C.8 Hoạt độ enzyme thời gian lên men 36; 48; 60; 72; 84; 96 Thời gian (giờ) Hoạt độ enzyme (U/ml) 36 3,78 ± 0,32a 48 4,84 ± 0,24b 60 5,91 ± 0,29c 72 8,80 ± 0,27e 84 7,23 ± 0,24d 96 5,63 ± 0,39c *Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình độ lệch chuẩn (n = 3) *Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) PHỤ LỤC C.9 Kết xử lý thống kê SPSS biến hoạt độ enzyme nhiệt độ lên men Hoạt độ enzyme Subset for alpha = 0,05 Duncana Nhiệt độ (℃) N 50 45 40 30 35 Sig 4,53333 6,17667 7,11333 7,83000 8,69333 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 PHỤ LỤC C.10 Hoạt độ enzyme nhiệt độ lên men 30℃ , 35℃, 40℃, 45℃, 50℃ Nhiệt độ (℃) Hoạt độ enzyme (U/ml) 30 7,83 ± 0,23d 35 8,69 ± 0,19e 40 7,11 ± 0,21c 45 6,18 ± 0,31b 50 4,53 ± 0,15a *Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình độ lệch chuẩn (n = 3) *Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) PHỤ LỤC D Kết xử lý thống kê SPSS nâng cao hoạt độ chế phẩm enzyme cellulase PHỤ LỤC D.1 Kết xử lý thống kê SPSS biến hoạt độ enzyme nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa Hoạt độ enzyme Nồng độ muối Subset for alpha = 0,05 N (NH4)2SO4 Duncana 60 90 70 80 Sig 9,0600 9,4567 10,0267 11,0967 1,000 1,000 1,000 1,000 PHỤ LỤC D.2 Hoạt độ enzyme nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa Nồng độ muối (NH4)2SO4 Hoạt độ enzyme (U/ml) 60 9,06 ± 0,11a 70 10,03 ± 0,09c 80 11,10 ± 0,22d 90 9,46 ± 0,18b *Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình độ lệch chuẩn (n = 3) *Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) PHỤ LỤC D.3 Kết xử lý thống kê SPSS biến hoạt độ enzyme tỉ lệ V dịch thô/ V ethanol Hoạt độ enzyme Tỉ lệ Vdịch thô / V ethanol Duncana Subset for alpha = 0,05 N 1:2 1:3 1:5 1:4 Sig 9,0367 9,3500 9,8733 11,888 1,000 1,000 1,000 1,000 PHỤ LỤC D.4 Hoạt độ enzyme tỉ lệ Vdịch thô/ Vethanol Tỉ lệ Vdịch thô/ Vethanol Hoạt độ enzyme (U/ml) 1:2 9,04 ± 0,12a 1:3 9,35 ± 0,07b 1:4 11,88 ± 0,19d 1:5 9,87 ± 0,22c *Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình độ lệch chuẩn (n = 3) *Các chữ in thường cột biểu khác biệt trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) S K L 0