Nghiên cứu tác động ức chế của hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ cây ardisia gigantifolia lên tế bào ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀM QUỐC ĐẠT NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT TRITERPENOID SAPONIN PHÂN LẬP TỪ CÂY ARDISIA GIGANTIFOLIA LÊN TẾ BÀO UNG THƢ DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN, 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀM QUỐC ĐẠT NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT TRITERPENOID SAPONIN PHÂN LẬP TỪ CÂY ARDISIA GIGANTIFOLIA LÊN TẾ BÀO UNG THƢ DẠ DÀY Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Bảo Ngọc THÁI NGUYÊN, 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu tôi, số liệu kết trình bày luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cá nhân tập thể đƣợc ghi nhận lời cảm ơn Thái Nguyên, ngày 05 tháng 01 năm 2022 Học viên ii LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo: PGS.TS Trần Bảo Ngọc (ĐH Y Dƣợc - ĐH Thái Nguyên) tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Phú Hùng Trƣởng khoa Công nghệ Sinh thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, phận sau Đại học - trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ suốt q trình học tập trƣờng Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, lãnh đạo Phịng Sở Y tế tỉnh Thái Ngun nơi tơi công tác tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Trong trình thực luận văn cịn hạn chế mặt thời gian, kinh phí nhƣ trình độ chun mơn nên khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc ý kiến quý báu thầy cô giáo, nhà khoa học, bạn bè, đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Thái Nguyên, ngày 05 tháng 01 năm 2022 Học viên Đàm Quốc Đạt iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Lá khôi 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Thành phần hóa học Lá khôi 1.1.3 Tác dụng y học Lá khôi 1.2 Khái quát triterpenoid triterpenoid saponin 1.2.1 Giới thiệu chung triterpenoid saponin 1.2.2 Vai trò triterpenoid saponin ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ 1.2.3 Triterpenoid saponin ức chế xâm lấn di điều hòa giảm số lƣợng tế bào gốc ung thƣ 1.3 Ung thƣ dày 10 1.4 Tế bào gốc ung thƣ 12 1.4.1 Tổng quan tế bào gốc ung thƣ 12 1.4.2 Các marker tế bào gốc ung thƣ 13 1.5 Quá trình apoptosis 14 1.5.1 Hình thái tế bào apoptosis 15 1.5.2 Cơ chế trình apoptosis 16 1.5.3 Thay đổi apoptosis ung thƣ 18 1.6 Lão hóa tế bào 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 22 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 iv 2.4.1 Phƣơng pháp nuôi cấy thử hoạt tính hợp chất triterpenoid saponin 23 2.4.2 Phƣơng pháp phân tích tăng sinh tế bào 23 2.4.3 Phƣơng pháp tách chiết tinh ARN tổng số 23 2.4.4 Phƣơng pháp phân tích biểu gen Realtime PCR 24 2.4.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin H3 từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thƣ dày AGS 25 3.2 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khôi lên khả sống sót tế bào AGS mơi trƣờng nuôi cấy 26 3.3 Kết tác động tripterenoid saponin saponin H3 từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thƣ dày CD44 27 3.4 Kết tác động triterpenoid saponin H3 từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thƣ 28 3.5 Kết tác động triterpenoid saponin saponin từ Lá khơi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thƣ dày AGS 29 3.6 Kết tác động tripterenoid saponin từ Lá khôi lên lão hóa tế bào tế bào ung thƣ dày AGS môi trƣờng nuôi cấy 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 Kết luận 33 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các kiểu cấu trúc phổ biến triterpenoid Hình 1.2 Các marker tế bào gốc ung thƣ biểu số bệnh ung thƣ ngƣời 14 Hình 1.3 Tế bào apoptotic kính hiển vi quang học 15 Hình 1.4 Con đƣờng apoptosis tế bào 16 Hình 1.5 Các đặc điểm kiểu hình lão hóa 20 Hình 3.1 Tế bào AGS dƣới kính hiển vi soi ngƣợc nồng độ triterpenoid saponin H3 khác (Thang đo 50 µm) 25 Hình 3.2 Tỷ lệ phần trăm tế bào AGS sống sót xử lý với H3 nồng độ khác so với đối chứng (100%),* p ≤ 0,05; n = 26 Hình 3.3 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu marker tế bào gốc ung thƣ CD44 tế bào AGS mơ hình ni cấy 2D 28 Hình 3.4 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu gen tế bào gốc ung thƣ 29 Hình 3.5 Tác động triterpenoid Saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên tumorsphere điều kiện nuôi cấy 3D nồng độ khác 29 Hình 3.6A Hình ảnh tế bào AGS dƣới kính hiển vi soi ngƣợc nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc với tripterenoid saponin H3 (Thang đo 50 µm) 31 Hình 3.6B Tỷ lệ tế bào AGS lão hóa xử lý với triterpenoid saponin H3 nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc 31 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ung thƣ dày nguyên nhân gây chết thứ loại ung thƣ toàn giới Các liệu pháp chống ung thƣ thƣờng tiêu diệt không chọn lọc tế bào ung thƣ Thêm vào đó, tái phát ung thƣ nhƣ tƣợng kháng thuốc điều trị trở thành thách thức lớn điều trị ung thƣ dày nói riêng ung thƣ nói chung Một trọng tâm việc phát triển liệu pháp nhắm đích tìm kiếm hợp chất có khả tiêu diệt hiệu tế bào ung thƣ nhƣng hạn chế tác dụng phụ nhƣ khả tái phát sau điều trị Chính vậy, việc tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên mà trọng tâm từ thảo dƣợc tự nhiên đƣợc đặc biệt trọng nhiều quốc gia khác Việt Nam quốc gia có nguồn thực vật phong phú đa dạng với hàng ngàn thuốc đƣợc ghi nhận vốn tri thức địa đồng bào dân tộc khác Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia) phân bố nhiều nơi khác khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam, đƣợc sử dụng phổ biến dân gian nhƣ thuốc hữu hiệu điều trị số bệnh dày Triterpenoid saponin hợp chất chuyển hóa thứ cấp Trong năm gần đây, quan tâm đến Triterpenoid saponin tác dụng chúng tế bào khối u ngày tăng Đã có nghiên cứu chứng minh rằng, triterpenoid saponin có hoạt tính chống ung thƣ phổ rộng, ức chế tăng sinh gây trình apoptosis khối u tế bào, giảm hoạt động xâm lấn tế bào ung thƣ; số dạng triterpenoid saponin thể tác dụng chống viêm Một số hợp chất triterpenoid saponin Ardisia gigantifolia đƣợc phân lập công bố vài tác giả khác nhiên, nghiên cứu khả ức chế ung thƣ dày chúng hạn chế Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác động ức chế hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ Ardisia gigantifolia lên tế bào ung thư dày’’ Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá tác động ức chế hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ Lá khôi (Ardisia gigantifolia) lên kiểu hình, sinh trƣởng, biểu số gen tế bào gốc, apoptosis trình lão hóa tế bào ung thƣ dày mơ hình ni cấy in vitro Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thƣ dày AGS Nội dung 2: Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi lên khả sống sót tế bào AGS môi trƣờng nuôi cấy Nội dung 3: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thƣ dày CD44 Nội dung 4: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thƣ Nội dung 5: Đánh giá tác động triterpenoid saponin từ Lá khơi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thƣ dày AGS Nội dung 6: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khơi lên lão hóa tế bào tế bào ung thƣ dày AGS môi trƣờng nuôi cấy CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Lá khôi 1.1.1 Đặc điểm chung Cây Lá khơi thuộc chi Ardisia có tên khoa học Ardisia gigantifolia Stapf Cây Lá khôi dạng bụi lớn nửa bụi, cao khoảng từ 1-3 m, có thân rễ bị dày, thƣờng khơng phân cành, khơng có lơng Lá thƣờng tập trung đầu thân, mép khía cƣa nhỏ nhọn dày đặc, hai mặt khơng có lơng có lơng mềm nhỏ thƣa gân mặt dƣới, có điểm tuyến lồi thƣa thớt, nhiều gần mép lá; gân bên khoảng 15-20 đôi, hƣớng lên, cuống dài 2-4cm Hoa màu hồng trắng Cánh hoa hình trứng dài 4-5 mm, có điểm tuyến Nhị dài 2/3 cánh hoa, bao phấn hình trứng Bầu hình cầu, nhẵn có lơng nhỏ, vịi nhụy dài gần cánh hoa; nỗn nhiều, vịng Quả hình cầu đƣờng kính khoảng mm, màu hồng có gân tuyến điểm tuyến Theo tác giả Võ Văn Chi, nhiều loài Ardisia Việt Nam đƣợc dân gian sử dụng làm thuốc đƣợc phân bố Sơn La, Bắc Giang, Hà Nội (Ba Vì), Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, Kon Tum Cây hoa tháng 3-6, có tháng 11-12 Mọc rừng thƣa, rừng rậm, sƣờn đồi, thung lung, khe núi, bờ suối nơi ẩm có bóng râm [1] 1.1.2 Thành phần hóa học Lá khôi N.H Anh cộng nghiên cứu thành phần hóa học hai lồi Ardisia silvestris Ardisia gigantifolia vào năm 1996, cơng bố tìm thấy hai dẫn xuất resocinol 2-methyl-5-(Z-nonadec-14enyl)resorcinol 5-(Z-nonadec14-enyl)resorcinol Ngoài ra, từ loài A silvestris, số sterol nhƣ 38 stigmasterol, spinasterol hàm lƣợng chính, cịn có 24-methylenecholesterol, stigmast-22-en-3β-ol, 22-dihydrospinasterol số hợp chất tritecpen khác lanost-8-en-3β-ol, taraxerol, lanosterol, β-amyrin, 24-methylenelanost-8-en3β-ol 24-methylenecycloartanol đƣợc tìm thấy [2] Bằng phản ứng hóa học đặc trƣng xác định đƣợc 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào Ni cấy thử hoạt tính hợp chất triterpenoid dòng tế bào ung thƣ dày AGS: 10.000 tế bào đƣợc đƣa vào giếng đĩa 96 giếng, giếng đƣợc bổ sung 100 µl môi trƣờng nuôi cấy RMPI 1640 chứa 10% huyết bị 1% penicillin streptomycin Đĩa ni cấy đƣợc đƣa vào tủ nuôi cấy CO2 nuôi cấy nhiệt độ 37oC, 5% CO2 Sau 48h nuôi cấy, môi trƣờng cũ đƣợc thay môi trƣờng Quan sát thay đổi hình dạng phân tích số lƣợng tế bào kính hiển vi soi ngƣợc NIKON Ts2 kiểu nhân tế bào (nhuộm DAPI) kính hiển vi huỳnh quang NIKON T2U sau 24h, 48h ngày 2.4.2 Phương pháp phân tích tăng sinh tế bào Thử nghiệm khả ức chế tăng sinh tế bào đƣợc tiến hành dải gồm nồng độ khác thời gian ủ khác hợp chất triterpenoid Phƣơng pháp tiến hành đƣợc dựa nghiên cứu công bố trƣớc có thay đổi cho phù hợp với nghiên cứu [27] Tế bào đƣợc nuôi đĩa 96 giếng (100μl/giếng) với mật độ 5x103 tế bào/cm2 Các tế bào đƣợc xử lý với nồng độ khác dịch chiết Lá khôi 24h 48h Tiếp theo giếng ni cấy đƣợc bổ sung 10µl MTT (nồng độ 5mg/ml) ủ đĩa 37oC 4h, sau bổ sung 100 µl DMSO Đo mật độ quang bƣớc sóng 570nm máy quang phổ (Multiskan Sky Thermo) Các thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần, độ có n = (5 giếng cho nồng độ) % Tế bào sống so với đối chứng = Mật độ quang giếng xử lý Mật độ quang giếng đối chứng 2.4.3 Phương pháp tách chiết tinh ARN tổng số Bƣớc 1: * 100 24 Bƣớc 2: Bƣớc 3: Bƣớc 4: Bƣớc 5: Bƣớc 6: Bƣớc 7: Bƣớc 8: 2.4.4 Phương pháp phân tích biểu gen Realtime PCR Trình tự mồi gen phân tích đƣợc trình bày bảng Bảng 1: Trình tự mồi gen đƣợc sử dụng nghiên cứu Klf4 Mồi xuôi Mồi ngƣợc Nanog Mồi xuôi Mồi ngƣợc Oct4 Mồi xuôi Mồi ngƣợc ARN đƣợc sử dụng để thực phản ứng tạo cDNA Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (cung cấp Qiagen) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu đƣợc từ thực nghiệm đƣợc xử lý phầm mềm chuyên dụng GraphPad Prism 5.0, tiến hành theo phƣơng pháp phân tích Mann-Whitney Sự khác biệt có ý nghĩa với giá trị P < 0,05 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin H3 từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thƣ dày AGS Để đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin H3 tách chiết từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thƣ dày AGS điều kiên nuôi cấy in vitro, tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 vào môi trƣờng nuôi với nồng độ khác nhau: 1- 2.5- 5- 10 20 µg/ml Kết đánh giá thay đổi hình thái tế bào đƣợc so sánh với đối chứng môi trƣờng nuôi cấy AGS không bổ sung triterpenoid saponin H3 (nồng độ triterpenoid saponin H3 0µg/ml) Sau 48 giờ, tế bào đƣợc xử lý quan sát dƣới kính hiển vi soi ngƣợc Kết quan sát đƣợc ghi lại hình 3.1 Hình 3.1 Tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ triterpenoid saponin H3 khác (Thang đo 50 µm) Quan sát kết hình 3.1 thấy, mơi trƣờng đối chứng (không bổ sung triterpenoid saponin H3), tế bào AGS phát triển đồng môi trƣờng nuôi cấy Các tế bào ni cấy AGS có hình ovan thoi dài điển hình, tế bào chất bắt màu đồng với chất nhuộm, không quan sát đƣợc tế bào có bất thƣờng hình dạng hay tế bào chất Nhƣ vậy, môi trƣờng sử dụng nuôi cấy phù hợp với phát triển sinh trƣởng tế bào ung thƣ dày AGS, môi trƣờng chứa chất gây ức chế hay ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển bình thƣờng tế bào Sự tác động làm thay đổi hình thái tế bào ức chế tồn tế bào ung thƣ môi trƣờng nuôi cấy tiêu chí đƣợc sử dụng phổ biến đánh giá tính độc hợp chất tế bào ung thƣ Mu cộng quan sát thấy tác động hợp chất triterpenoid saponin chiết xuất từ Lá khơi đến kiểu hình sinh trƣởng dòng tế bào ung thƣ Triterpenoid saponin AG8 ức chế khả nhiều dòng tế 26 bào ung thƣ khác nhƣ MDA-MB-231, BT-549 MDA-MB-157 phụ thuộc vào nồng độ hợp chất môi trƣờng nuôi cấy [41] Dịch chiết từ loài thực vật nhƣ Artemisia annua, Coptis chinensis, Curcuma longa, Fagonia indica, Garcinia oblongifolia, Garcinia indica, Hedyotis diffusa, Loranthus parasiticus, Morus alba, đƣợc ghi nhận có khả ức chế sinh trƣởng tồn nhiều dòng tế bào ung thƣ khác [42] 3.2 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khôi lên khả sống sót tế bào AGS mơi trƣờng ni cấy Để xác định xác khả ức chế triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên khả tồn tế bào ung thƣ dày AGS môi trƣờng nuôi cấy, tiến hành xác định số lƣợng tế bào tồn môi trƣơng sau mốc thời gian 24 tiếp xúc 48 tiếp xúc nồng độ xử lý khác bao gồm 0.5-1-2.5-5-10 20 µg/ml Số lƣợng tế bào đƣợc so sánh với mốc 100% mơi trƣờng đối chứng khơng có bổ sung triterpenoid saponin H3 Tác động triterpenoid saponin H3 nồng độ khác khoảng thời gian khác có thay đổi đáng ý Kết xác định tỷ lệ tế bào môi trƣờng ni cấy đƣợc biểu diễn hình 3.2 Hình 3.2 Tỷ lệ phần trăm tế bào AGS sống sót xử lý với H3 nồng độ khác so với đối chứng (100%),* P < 0,05; n = Ở môi trƣờng nuôi cấy tế bào AGS có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi với nồng độ µg/ml, mốc thời gian 24 tiếp xúc, tỷ lệ tế bào nuôi cấy AGS sống đƣợc xác định 50% so với đối chứng, nhiên, sau 48 nuôi cấy, tỷ lệ phần trăm tế bào sống đƣợc xác định khoảng 85%, tƣơng đƣơng môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ triterpenoid saponin H3 0,5 µg/ml thời gian tiếp xúc 48 Từ kết thấy sau thời gian dài tiếp xúc, tác động ức chế sinh trƣởng triterpenoid 27 saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có xu hƣớng giảm sút Điều đƣợc giải thích đặc tính hợp chất tự nhiên dễ chịu tác động từ yếu tố mơi trƣờng dẫn đến phân hủy hợp chất làm hoạt tính Từ kết thấy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi hợp chất không bền, thời gian dài tồn môi trƣờng ni cấy bị phân hủy dẫn đến phần hoạt tính Cùng với đó, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả kích thích nhẹ q trình tăng sinh tế bào ung thƣ AGS thời gian ngắn tiếp xúc nồng độ thấp, sau có khả ức chế tăng sinh tồn tế bào AGS Khả ức chế tăng sinh tồn tế bào ung thƣ AGS triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi phụ thuộc vào nồng độ hợp chất cịn tồn mơi trƣờng ni cấy thời gian tiếp xúc với hợp chất Một hợp chất triterpenoid saponin khác từ Lá khôi A8 đƣợc Mu cộng chiết xuất xác định khả ức chế tồn nhiều dòng tế bào ung thƣ khác điều kiện in vitro Kết nghiên cứu cho thấy sau 24 ni cấy, dịng tế bào ung thƣ vú MDA-MB-231 giá trị IC50 3.80 µM, dịng tế bào BT-549 MDA-MB-157 giá trị IC50 đƣợc xác định lần lƣợt 0.73 1.38 µM Khả ức chế tăng sinh tế bào A8 dòng tế bào ung thƣ vú đƣợc xác định phụ thuộc vào nồng độ hợp chất môi trƣờng nuôi cấy [41] 3.3 Kết tác động tripterenoid saponin saponin H3 từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thƣ dày CD44 CD44 dấu ấn sinh học biểu nhiều dạng ung thƣ khác Biểu CD44 có liên quan đến tăng sinh, tự làm di tế bào ung thƣ Trong ung thƣ dày, CD44 đƣợc định nhƣ dấu ấn sinh học cho phƣơng pháp tiếp cận chẩn đoán, điều trị tiên lƣợng tăng cƣờng biểu CD44 có liên quan đến tiên lƣợng xấu 28 bệnh nhân với việc gia tăng biểu đặc tính tế bào gốc ung thƣ thúc đẩy hình thành khối u [43] Đồng thời, ức chế CD44 làm giảm đáng kể hình thành tumorsphere giảm phát triển khối u [44] Hình 3.3 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu marker tế bào gốc ung thư CD44 tế bào AGS mơ hình ni cấy 2D Nhƣ vậy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi có khả ức chế biểu marker CD44 tế bào ung thƣ dày AGS môi trƣờng nuôi cấy, tỉ lệ tế bào nuôi cấy AGS có biểu CD44 giảm mạnh theo tăng lên nồng độ triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có mặt mơi trƣờng Thơng qua ức chế biểu CD44, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu đặc tính quan trọng tế bào gốc ung thƣ dày AGS, từ ức chế tăng sinh, tồn di tế bào ung thƣ 3.4 Kết tác động triterpenoid saponin H3 từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thƣ Sự biểu gen đặc trƣng tế bào gốc tế bào gốc ung thƣ có ảnh hƣởng lớn đến trình sinh trƣởng, phát triển, khả di đặc tính đặc trƣng tế bào gốc Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định ảnh hƣởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên biểu ba gen đặc trƣng cho “tính gốc” tế bào gốc ung thƣ dày AGS Oct4, Nanog Klf4 nồng độ IC50 (1 µg/ml) sau 24 tiếp xúc Kết phân tích biểu gen đƣợc so sánh với mức độ biểu gen tế bào AGS nuôi cấy môi trƣờng đối chứng Kết phân tích biểu gen đƣợc thể hình 3.4 29 Hình 3.4 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu gen tế bào gốc ung thư Sự kết hợp biểu gen oct4, nanog klf4 có vai trị quan trong q trình tự làm (self-renewal) biệt hóa tế bào gốc Sự ức chế hoạt động oct4, nanog klf4 tế bào gốc dẫn đến ức chế trình tự làm tế bào, đồng thời cảm ứng trình biệt hóa tế bào dẫn đến làm ức chế “tính gốc” tế bào gốc [45], [46] Nhƣ vậy, nghiên cứu này, xác định đƣợc triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi có khả ức chế, làm giảm khả tự làm (selfrenewal) thức đẩy biệt hóa tế bào gốc ung thƣ thông qua giảm mức độ biểu gen liên quan đến đặc tính quan trọng tế bào gốc ung thƣ oct4, nanog klf4 3.5 Kết tác động triterpenoid saponin saponin từ Lá khơi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thƣ dày AGS Tumorsphere dạng sinh trƣởng tế bào điều kiện ni cấy 3D, có tƣơng đồng cao mơ hình khối u thể sống (in vivo) Trong nghiên cứu này, để nghiên cứu tác động triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi lên hình thành tumorsphere từ tế bào ung thƣ dày AGS, tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi với nồng độ nồng độ 0.5 µg/ml vào mơi trƣờng ni cấy AGS hình thành tumorsphere ngày nuôi cấy thứ Sau 48 tiếp xúc với triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi, thay đổi hình thái tumorsphere đƣợc ghi lại ảnh chụp dƣới kính hiển vi độ phóng đại 200 lần (Hình 3.4) Hình 3.5 Tác động triterpenoid Saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên tumorsphere điều kiện nuôi cấy 3D nồng độ khác 30 Hiện nay, mơ hình thử thuốc điều kiện nuôi cấy 3D đƣợc đặc biệt quan tâm ƣu điểm bật nhƣ tƣơng đồng với hình thành phát triển tế bào ung thƣ điều kiện in vivo Trong nghiên cứu này, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi đƣợc xác định có khả ức ức chế tiêu diệt khối tế bào in vitro (tumorsphere) cách hiệu quả, mở tiềm ứng dụng hợp chất điều trị ung thƣ 31 3.6 Kết tác động tripterenoid saponin từ Lá khôi lên lão hóa tế bào tế bào ung thƣ dày AGS môi trƣờng nuôi cấy Trong nội dung nghiên cứu, để xác định tác động triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên lão hóa tế bào, chúng tơi tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 vào môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ µg/ml (IC50) Sau 24 tiếp xúc, tế bào đƣợc xử lý với X-gal để xác định enzyme β-galactosidase đặc trƣng cho tế bào lão hóa Kết quan sát biến đổi kiểu hình lão hóa dƣới kính vi đƣợc ghi lại hình 3.6A Kết phân tích xác định tỉ lệ tế bào lão hóa mơi trƣờng ni cấy đƣợc ghi lại hình 3.6B Hình 3.6A Hình ảnh tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc với tripterenoid saponin H3 (Thang đo 50 µm) Trong mơi trƣờng ni cấy bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ µg/ml, sau 24 tiếp xúc, quan sát thấy số tế bào AGS môi trƣờng ni cấy có xuất màu xanh đặc trƣng chuyển hóa chất X-gal dƣới tác động enzyme β-galactosidase đặc trƣng cho tế bào lão hóa Nhƣ thấy đƣợc, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ thấp có khả gây q trình lão hóa tế bào ung thƣ dày AGS điều kiện ni cấy Hình 3.6B Tỷ lệ tế bào AGS lão hóa xử lý với triterpenoid saponin H3 nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc Nhƣ trình bày trên, q trình lão hóa tế bào với đặc trƣng ngƣng trệ chu kỳ tế bào ức chế q trình apoptosis, có vai trò ức chế phát triển tế bào ung thƣ Trong nghiên cứu này, xác 32 định đƣợc triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả gây q trình lão hóa cho tế bào ung thƣ dày AGS, từ dẫn đến khả ức chế sinh trƣởng phát triển té bào AGS môi trƣờng nuôi cấy 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xác định đƣợc triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có tác động lên kiểu hình tế bào ung thƣ dày AGS điều kiện nuôi cấy Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế khả sống sót tế bào ung thƣ dày AGS với IC50 Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi làm giảm biểu marker tế bào gốc CD44 tế bào AGS nuôi cấy Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu gen liên quan đến tính gốc tế bào AGS oct4, nanog klf4 Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế phát triển gây chết tumorsphere tế bào AGS hình thành điều kiện ni cấy 3D Trong điều kiện nuôi cấy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả thúc đẩy lão hóa tế bào ung thƣ dày AGS Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi lên phát triển dịng tế bào ung thƣ dày mức độ protein 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chi, V.V., Từ điển thuốc Việt Nam, tập 1–2, Nxb Y học, Hà Nội, 2012 Anh, N.H., et al., Resorcinol derivatives from two Ardisia species Planta medica, 1996 62(05): p 479-480 Wen, P., et al., Four new triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia Stapf and their cytotoxic activity 2008 Mu, L.-H., J.-Q Feng, and P Liu, A new bergenin derivative from the rhizome of Ardisia gigantifolia Natural product research, 2013 27(14): p 1242-1245 Lê, T.T.H., Nghiên cứu tính đa dạng nguồn thuốc sử dụng cộng đồng dân tộc thiểu số tỉnh Thái Nguyên nhằm bảo tồn phát triển bền vững 2015 Yarnell, E., Plant Chemistry in Veterinary Medicine: Medicinal Constituents Veterinary Herbal Medicine, 2006: p 159 Podolak, I., A Galanty, and D Sobolewska, Saponins as cytotoxic agents: a review Phytochemistry Reviews, 2010 9(3): p 425-474 Chun, J., M Kang, and Y.S Kim, A triterpenoid saponin from Adenophora triphylla var japonica suppresses the growth of human gastric cancer cells via regulation of apoptosis and autophagy Tumor Biology, 2014 35(12): p 12021-12030 Mu, L.-H., N.-Y Wei, and P Liu, Cytotoxic triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia Planta medica, 2012 78(06): p 617-621 10 Du, J.-R., F.-Y Long, and C Chen, Research progress on natural triterpenoid saponins in the chemoprevention and chemotherapy of cancer The enzymes, 2014 36: p 95-130 11 Hwang, Y.S., K.-K Park, and W.-Y Chung, Kalopanaxsaponin A inhibits the invasion of human oral squamous cell carcinoma by reducing metalloproteinase-9 mRNA stability and protein trafficking Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2012 35(3): p 289-300 35 12 Kong, Y., et al., Platycodin D, a metabolite of Platycodin grandiflorum, inhibits highly metastatic MDA-MB-231 breast cancer growth in vitro and in vivo by targeting the MDM2 oncogene Oncology reports, 2016 36(3): p 1447-1456 13 Koczurkiewicz, P., et al., Multidirectional effects of triterpene saponins on cancer cells-mini-review of in vitro studies Acta Biochimica Polonica, 2015 62(3) 14 Rawla, P and A Barsouk, Epidemiology of gastric cancer: global trends, risk factors and prevention Przeglad gastroenterologiczny, 2019 14(1): p 26 15 Thu, T., et al., Gastric and colo-rectal cancer mortality in Viet Nam in the years 2005-2006 Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2008 9: p 299-302 16 Truong, B.X., et al., Diverse characteristics of the CagA gene of Helicobacter pylori strains collected from patients from southern vietnam with gastric cancer and peptic ulcer Journal of clinical microbiology, 2009 47(12): p 4021-4028 17 Binh, T.T., et al., Advanced non-cardia gastric cancer and Helicobacter pylori infection in Vietnam Gut pathogens, 2017 9(1): p 1-9 18 Machlowska, J., et al., Gastric cancer: epidemiology, risk factors, classification, genomic characteristics and treatment strategies International journal of molecular sciences, 2020 21(11): p 4012 19 Lahmidani N, M.E.Y., Nourdine Aqodad1, Dafr Allah Benajah1, , Update on Gastric Cancer Epidemiology and Risk Factors Journal of Cancer Therapy 2018 9: p 242-254 20 Dzobo, K., et al., Advances in therapeutic targeting of cancer stem cells within the tumor microenvironment: An updated review Cells, 2020 9(8): p 1896 21 Hoffmann, W., Stem cells, self-renewal and cancer of the gastric epithelium Current medicinal chemistry, 2012 19(35): p 5975-5983 36 22 Amey, C.L and A.E Karnoub, Targeting Cancer Stem Cells—A Renewed Therapeutic Paradigm Oncology & hematology review, 2017 13(1): p 45 23 Singh, S.R., Gastric cancer stem cells: a novel therapeutic target Cancer letters, 2013 338(1): p 110-119 24 MacDonagh, L., et al., Lung cancer stem cells: The root of resistance Cancer letters, 2016 372(2): p 147-156 25 Dzobo, K., et al., Three-dimensional organoids in Cancer research: the search for the holy grail of preclinical Cancer modeling Omics: a journal of integrative biology, 2018 22(12): p 733-748 26 Bjerknes, M and H Cheng, Multipotential stem cells in adult mouse gastric epithelium American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2002 283(3): p G767-G777 27 Nguyen, P.H., et al., All-trans retinoic acid targets gastric cancer stem cells and inhibits patient-derived gastric carcinoma tumor growth Oncogene, 2016 35(43): p 5619-5628 28 Elmore, S., Apoptosis: a review of programmed cell death Toxicologic pathology, 2007 35(4): p 495-516 29 Liu, H., et al., Improvement of pharmacokinetic profile of TRAIL via trimer-tag enhances its antitumor activity in vivo Scientific reports, 2017 7(1): p 1-11 30 Hassan, M., et al., Apoptosis and molecular targeting therapy in cancer BioMed research international, 2014 2014 31 Adams, J.M and S Cory, The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival Science, 1998 281(5381): p 1322-1326 32 Yip, K and J Reed, Bcl-2 family proteins and cancer Oncogene, 2008 27(50): p 6398-6406 33 Elkholi, R., et al., Putting the pieces together: How is the mitochondrial pathway of apoptosis regulated in cancer and chemotherapy? Cancer & metabolism, 2014 2(1): p 1-15 34 Pfeffer, C.M and A.T Singh, Apoptosis: a target for anticancer therapy International journal of molecular sciences, 2018 19(2): p 448 37 35 Ranjan, A., et al., Role of phytochemicals in cancer prevention International journal of molecular sciences, 2019 20(20): p 4981 36 Gorgoulis, V., et al., Cellular senescence: defining a path forward Cell, 2019 179(4): p 813-827 37 Matjusaitis, M., et al., Biomarkers to identify and isolate senescent cells Ageing research reviews, 2016 29: p 1-12 38 Coppé, J.-P., et al., The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 2010 5: p 99-118 39 Wyld, L., et al., Senescence and cancer: A review of clinical implications of senescence and senotherapies Cancers, 2020 12(8): p 2134 40 Rao, X., et al., An improvement of the 2ˆ (–delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis Biostatistics, bioinformatics and biomathematics, 2013 3(3): p 71 41 Mu, L.-H., et al., Triterpenoid saponin AG8 from Ardisia gigantifolia stapf induces triple negative breast cancer cells apoptosis through oxidative stress pathway Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020 2020 42 Khan, T., et al., Anticancer plants: A review of the active phytochemicals, applications in animal models, and regulatory aspects Biomolecules, 2020 10(1): p 47 43 Lau, W.M., et al., CD44v8-10 is a cancer-specific marker for gastric cancer stem cells Cancer research, 2014 74(9): p 2630-2641 44 Takaishi, S., et al., Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44 Stem cells, 2009 27(5): p 1006-1020 45 Takahashi, K and S Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors cell, 2006 126(4): p 663-676 46 Xiang, Y., et al., The progress and prospects of putative biomarkers for liver cancer stem cells in hepatocellular carcinoma Stem cells international, 2016