Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu này cho thấy, Ach đóng vai trò như một nhân tố thúc đẩy sự phát sinh ung thư dạ dày ở thể ruột và việc sử dụng các chất ức chế đặc hiệu các thụ thể của Ach có thể mở ra hướng tiếp cận tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp nhắm đích ung thư dạ dày.
TNU Journal of Science and Technology 226(10): 255 - 260 ACETYLCHOLINE STIMULATES THE CELL PROLIFERATION AND INCREASES THE EXPRESSION OF CANCER STEM CELL MARKERS IN THE GASTRIC CANCER CELL LINE MKN74 Nguyen Phu Hung*, Le Thi Thanh Huong TNU - University of Sciences ARTICLE INFO Received: 30/5/2021 Revised: 15/7/2021 Published: 16/7/2021 KEYWORDS Acetylcholine Gastric cancer Gastric cancer stem cells Tumorsphere Cancer stem cell marker ABSTRACT Gastric cancer is a malignant cancer form with the mortality rate second only to liver cancer and lung cancer According to Loren's classification system, gastric cancer is divided into two main types: diffuse and intestinal In this study, we used different methods to screen for cell proliferation (MTT), 3D tumorsphere formation and evaluate the expression level of gastric cancer stem cell markers in intestinal type The results showed that Acetycholine (Ach) has the ability to stimulate the proliferation of MKN74 gastric cancer cells The tumorsphere formation rate in Ach-treated cells (1 µM) increased by times compared to the control Further, cells Ach-induced cells increased transcriptional level of genes encoding the gastric cancer stem cell markers CD44 and ALDH Inhibition of the activity of Ach receptor reduced the effect of Ach on the properties of gastric cancer cells This study suggests that Ach plays a role as a factor of intestinal gastric carcinogenesis and that the use of specific Ach receptor inhibitors could be a potential approach for targeted therapies for gastric cancer ACETYLCHOLIN KÍCH THÍCH SỰ PHÂN CHIA VÀ TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN CÁC MARKER TẾ BÀO GỐC UNG THƯ Ở DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY MKN74 Nguyễn Phú Hùng*, Lê Thị Thanh Hương Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên THÔNG TIN BÀI BÁO Ngày nhận bài: 30/5/2021 Ngày hồn thiện: 15/7/2021 Ngày đăng: 16/7/2021 TỪ KHĨA Acetylcholine Ung thư dày Tế bào gốc ung thư dày Tumorsphere Marker tế bào gốc ung thư TÓM TẮT Ung thư dày dạng ung thư ác tính có tỷ lệ chết đứng sau ung thư gan ung thư phổi Theo hệ thống phân loại Loren, ung thư dày chia làm hai thể thể phân tán thể ruột Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp khác để sàng lọc tăng sinh tế bào (MTT), hình thành tumorsphere 3D đánh giá mức độ biểu marker tế bào gốc ung thư dày Kết cho thấy rằng, Acetycholine (Ach) có khả kích thích tăng sinh tế bào ung thư dày thể ruột dòng MKN74 Tỷ lệ hình thành tumorsphere tế bào xử lý với µM Ach tăng lần so với đối chứng Xa nữa, tế bào bị cảm ứng Ach có biểu tăng mức độ phiên mã gene mã hóa cho marker tế bào gốc ung thư dày CD44 ALDH Ức chế hoạt động thụ thể Ach làm giảm tác động Ach lên đặc tính tế bào ung thư dày Nghiên cứu cho thấy, Ach đóng vai trị nhân tố thúc đẩy phát sinh ung thư dày thể ruột việc sử dụng chất ức chế đặc hiệu thụ thể Ach mở hướng tiếp cận tiềm việc phát triển liệu pháp nhắm đích ung thư dày DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.4564 * Corresponding author Email: hungnguyenphu@tnus.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 255 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 255 - 260 Giới thiệu Ung thư dày dạng ung thư ác tính đứng hàng thứ ba tỷ lệ tử vong sau ung thư gan ung thư phổi tỷ lệ sống sót năm 25% [1] Theo hệ thống phân loại Loren, ung thư dày chia làm hai thể thể phân tán (diffuse type) thể ruột (intestinal type) Hai thể ung thư có khác biệt hình thái học tế bào mức độ tăng sinh tế bào khối u Các liệu pháp điều trị ung thư dày gặp nhiều khó khăn khả kháng thuốc điều trị, chế phát sinh ung thư dày chưa hiểu biết cách đầy đủ [2] Gần đây, vai trò hệ thần kinh ruột chế bệnh sinh ung thư dày Sử dụng mơ hình chuột cấy ghép ung thư dày, Zhao cộng rằng, Ach thụ thể Muscarinic (M3) tác động lên đặc tính tế bào gốc dày [3] Một nghiên cứu gần nhóm nghiên cứu chứng minh, Ach thúc đẩy trình biểu yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) biểu mức NGF khởi động trình phát sinh ung thư dày [4] Cùng với đó, Ach khởi động trình di trú, xâm lấn tế bào ung thư thông qua chế tương tác với thụ thể M3 [5] Trong nghiên cứu gần đây, sử dụng mơ hình nuôi cấy 3D, Acetylcholine tăng cường đặc tính tế bào gốc ung thư dày thể phân tán bao gồm tăng số lượng kích thước tumorsphere biểu marker tế bào gốc CD44 ALDH Xa nữa, Ach tác động lên hai thụ thể muscarinic nicotinic Sự ức chế hai thụ thể chất ức chế đặc hiệu làm ảnh hưởng Ach [6] Để bổ sung cho hiểu biết tác động Ach tế bào ung thư dày thể ruột, nghiên cứu tiến hành đánh giá tác động Ach lên đặc tính tế bào gốc ung thự dày dòng MKN74 Phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu, hóa chất Dịng tế bào ung thư dày MKN74 phịng thí nghiệm Inserm U1053, Viện Sức khỏe Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp cung cấp Acetylcholine (Ach), yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF) Sigma Aldrick (Pháp) cung cấp Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 DMEMF12 Invitrogen (Mỹ) cung cấp Các cặp mồi dùng cho phân tích Realtime PCR Qiagen cung cấp, tên gene mã số cặp mồi trình bày bảng 2.2 Phân tích tăng sinh tế bào sàng lọc MTT Nuôi cấy 5.103 tế bào MKN74 đĩa 96 giếng mơi trường RPMI1640 có bổ sung 10% huyết bào thai bò (FBS) Sau 48 ni cấy, tế bào bám dính hồn toàn bề mặt đĩa đạt khoảng 1/3 diện tích bề mặt tiến hành xử lý với Ach nồng độ 0,1; 1; 10 µM Ach Giếng đối chứng xử lý với lượng DMSO tương ứng Tế bào nuôi cấy 48 điều kiện 37oC, 5% CO2, độ ẩm 95% để đánh giá tác động Ach lên phân chia tế bào Tiếp theo, mơi trường ni cấy thay hồn tồn 100 µM mơi trường ni cấy chứa hóa chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Thermo Fisher, Mỹ) nồng độ mg/ml Tế bào tiếp tục ủ nhiệt độ 37oC để MTT chuyển hóa thành tinh thể màu tím Loại bỏ mơi trường chứa MTT sau ủ tiến hành bổ sung 100 µl DMSO để hịa tan tinh thể tạo từ q trình chuyển hóa MTT Mức độ tăng sinh tế bào xác định gián tiếp qua việc đo mật độ quang bước sóng 570 nm máy quang phổ đa (Multiskan Sky, Thermo Fisher) Tỉ lệ tăng sinh tế bào tính theo công thức: % tăng sinh = (OD mẫu xử lý/OD đối chứng)*100 http://jst.tnu.edu.vn 256 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 255 - 260 2.3 Nuôi cấy đánh giá tác động Ach lên tumorsphere 3D Quy trình ni cấy tiến hành theo nghiên cứu trước [7] Tóm tắt: Các tế bào ung thư dày MKN74 nuôi cấy với mật độ 2.000 tế bào/giếng ni cấy diện tích 3,8 cm2 bề mặt khơng bám dính để hình thành lên tumorsphere, mơi trường DMEMF12/Glutamax có bổ sung EGF 20 ng/ml, FGF 20 ng/ml, glucose 0,3%, insulin µg/ml 37oC, 5% CO2 Để đánh giá ảnh hưởng Ach lên số lượng tumorsphere hình thành, mơi trường ni cấy bổ sung Ach với nồng độ khác 0,1, 10 µM Mẫu đối chứng xử lý với lượng DMSO tương ứng Hexalium (Hex) µM xử lý phối hợp với Ach (1 µM) để đánh giá ảnh hưởng ức chế thụ thể Muscarinic Ach hình thành tumorsphere Sau ngày xử lý, số lượng tumorsphere quan sát chụp ảnh hệ thống kính hiển vi soi ngược Ts2 (NIKON, Nhật Bản) độ phóng đại 200 lần 2.4 Phân tích biểu gene Realtime PCR Các tumorsphere sau xử lý với Ach nồng độ µM thu nhận ly tâm 3.000 vòng/phút phút Tiếp theo, RNA tổng số tách chiết sử dụng phương pháp TRIzol Reagent Invitrogen cung cấp mRNA tổng hợp thành cDNA RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (mã số K1621) Thermo Fisher cung cấp Tách chiết RNA tổng hợp cDNA thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Phân tích Realtime PCR sử dụng chất phát quang Sybr green cho tất gene, quy trình thực mơ tả trước [8] 2.5 Phân tích thống kê Toàn liệu nghiên cứu phân tích phần mềm Graphpad Prism 5.0, sử dụng kiểm định Mann-Whitney, P < 0,05 Bảng Tên gene mã số cặp mồi sử dụng phân tích Realtime PCR Tên gene ALDH CD44 GAPDH Mã cặp mồi (primer) NM_000689 NM_000610 NM_002046 Kết bàn luận 3.1 Ảnh hưởng Ach nhân lên tế bào ung thư dày MKN74 Hình Ảnh hưởng Ach lên tăng sinh tế bào ung thư dày MKN74 Các tế bào xử lý với Ach nồng độ từ 0,1 – 10 µM Đối chứng (DC) xử lý thay lượng DMSO tương ứng, n = 5, * P < 0,05 Thang đo: 50 µm Tác động Ach gia tăng số lượng tế bào MKN74 trình bày hình Ở nồng độ thấp 0,1 µM Ach kích thích nhẹ tăng sinh tế bào (131 ± 7%) so với đối chứng Sự thay đổi rõ rệt mức độ tăng sinh tế bào quan sát giếng nuôi cấy xử lý với Ach nồng độ µM Tại nồng độ này, gia tăng số lượng tế bào đạt đến 223 ± 21% so với http://jst.tnu.edu.vn 257 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 255 - 260 đối chứng Tuy nhiên, gia tăng nồng độ lên 10 µM, tăng sinh tế bào giảm xuống mức 155 ± 17% Như thấy rằng, Ach tác động lên mức độ tăng sinh tế bào MKN74 tùy theo nồng độ xử lý Ach có khả hoạt hóa thụ thể Muscarinic (M3) để thúc đẩy hoạt động đường tín hiệu EGFR, cảm ứng phosphorin hóa protein ERK1/2 AKT, từ dẫn tới tăng sinh tế bào ung thư dày [9] Trong nghiên cứu này, rằng, Ach có khả thúc đẩy trình tăng sinh tế bào ung thư dày thể ruột dòng MKN74 nồng độ thử nghiệm µM có tác động mạnh lên tế bào ung thư dày MKN74 Do tiếp tục xử lý tế bào với nồng độ cho phân tích 3.2 Ảnh hưởng Ach lên hình thành tumorsphere điều kiện ni cấy 3D Đánh giá tác động thuốc mơ hình ni cấy 3D có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu ung thư, mơ hình có độ tương đồng định khối u thể Kết đánh tác động Ach lên khả tạo khối cầu tumorsphere 3D trình bày hình 2A 2B cho thấy rằng, nồng độ 0,1 µM Ach, mức độ hình thành tumorsphere tăng khoảng lần so với đối chứng Mức độ hình thành tumorsphere mạnh quan sát nồng độ µM Ach với mức độ tăng gấp khoảng lần so với đối chứng Sau đó, số lượng tumorsphere hình thành giảm nồng độ Ach 10 µM So sánh với mức độ tăng sinh tế bào điều kiện nuôi cấy 2D hình thấy rằng, tế bào nhạy cảm bị xử lý điều kiện nuôi cấy 3D Điều lý giải rằng, điều kiện nuôi cấy 3D, khối tế bào lơ lửng dịch ni cấy thuốc thành phần khác hịa tan mơi trường ni cấy tác động lên tế bào tồn bề mặt khơng gian chiều Chính vậy, việc xử lý với thuốc điều kiện nuôi cấy 3D trở thành mơ hình tốt việc phát triển thử nghiệm thuốc [10] Trong nghiên cứu trước đó, chúng tơi rằng, Ach làm tăng cường hình thành khối cầu ung thư ung thư dày thể phân tán dịng MKN45 Ở chúng tơi xác định Ach kích thích hình thành tumorsphere mạnh nồng độ µM với mức độ tăng gấp lần so với đối chứng [6] Hình Tác động Ach lên hình thành tumorsphere tế bào ung thư dày MKN74 DC = đối chứng; *P < 0,05, n = Thang đo: 200 µm 3.3 Ức chế đặc hiệu thụ thể Ach làm giảm ảnh hưởng Ach lên hình thành tumorsphere Chúng đặt giả thuyết rằng, Ach tác động lên số lượng tumorsphere thông qua hoạt hóa thụ thể Muscarinic Nicotinic Để kiểm tra giả thuyết này, chất ức http://jst.tnu.edu.vn 258 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 255 - 260 chế đặc hiệu cho thụ thể Muscarinic Nicotinic Hexanium (Hex) sử dụng Kết thử nghiệm trình bày hình 2C cho thấy rằng, bị xử lý với Hex, số lượng tumorsphere giảm so với đối chứng (DC) (*P < 0,05) Khi tế bào xử lý với đồng thời Hex Ach mức độ hình thành tumorsphere cao đáng kể so với đối chứng số lượng tumorsphere giảm mạnh, xấp xỉ 50% so với tế bào xử lý với Ach nồng độ µM ((#P < 0,05) Điều cho thấy rằng, ức chế thụ thể Ach giảm mạnh mức độ tác động Ach lên hình thành tumorsphere 3D tế bào ung thư dày thể ruột MKN74 Kết phù hợp với nghiên cứu mà nhận tiến hành đánh giá tác động Ach lên dòng tế bào ung thư dày thể phân tán MKN45 [6] Các nghiên cứu trước cho thấy rằng, ức chế thụ thể Ach giảm mạnh khả tăng sinh, di trú xâm lấn di tế bào ung thư dày mơ hình chuột cấy ghép khối u [11] Khả tạo khối cầu 3D hay tumorsphere đặc điểm quan trọng tế bào gốc ung thư Kết nghiên cứu phần cho thấy, Ach tác động lên tế bào gốc ung thư dày thông qua tác động lên thụ thể để gia tăng khả hình thành tumorsphere 3.4 Ach tăng cường phiên mã gene mã hóa cho marker tế bào gốc ung thư dày Từ kết thu được, Ach tăng cường hình thành tumorsphere điều kiện ni cấy 3D, đặt giả thuyết Ach làm tăng cường đặc tính tế bào gốc ung thư dày Để kiểm tra giả thuyết này, mức độ phiên mã gene mã hóa cho marker tế bào gốc ung thư dày CD44 ALDH phân tích Realtime PCR (Hình 3) Hình Tác động Ach lên phiên mã gene mã hóa cho marker tế bào gốc ung thư dày, CD44 ALDH DC = đối chứng; n = 5, *,#P < 0.05 Thang đo: 200 µm Kết cho thấy, mức độ biểu mRNA gene mã hóa marker CD44 ALDH tăng xấp xỉ lần tế bào xử lý tế bào với Ach (1 µM) so với đối chứng (*P < 0,05) Kết xử lý đồng thời với Hex Ach làm giảm đáng kể biểu ALDH so với tế bào xử lý với Ach (≠P < 0,05) Đáng ý, việc xử lý tế bào đồng thời với Ach Hex làm giảm mạnh mức độ biểu gene CD44 so với trường hợp xử lý với Ach khơng cịn khác biệt so với đối chứng (≠P < 0,05) Điều cho thấy rằng, ức chế thụ thể Muscarinic Ach chất ức chế đặc hiệu Hex dẫn tới ngăn cản mạnh mức độ tác động Ach lên http://jst.tnu.edu.vn 259 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 255 - 260 biểu marker ALDH CD44 Kết hoàn toàn phù hợp với kết tác động Ach Hex lên hình thành tumorsphere ALDH CD44 xác định marker đặc biệt quan trọng để nhận diện tế bào gốc ung thư dày, đồng thời marker liên quan chặt chẽ tới kháng thuốc tế bào ung thư dày [12] Trước đó, nghiên cứu ung thư dày thể phân tán nhận thấy việc ức chế thụ thể Ach chất ức chế đặc hiệu Atropin Hex giảm biểu gene mã hóa cho ALDH, CD44 số gene đường tín hiệu chuyển dịch biểu mơ trung mơ dịng tế bào MKN45 [6] Như thấy rằng, Ach đóng vai trị quan trọng việc tăng cường đặc tính tế bào gốc ung thư dòng tế bào ung thư dày thể ruột MKN74 Kết luận Trong nghiên cứu rằng, Ach có khả kích thích tăng sinh tế bào ung thư dày thể ruột Ach làm tăng đặc tính tế bào gốc ung thư dày hình thành tumorsphere tăng cường biểu marker tế bào gốc ung thư ALDH CD44 Ức chế thụ thể Ach chất ức chế đặc hiệu Hex dẫn tới ngăn cản hình thành tumorsphere giảm mạnh biểu gene mã hóa cho marker tế bào gốc ung thư dày Như thấy rằng, Ach đóng vai trị nhân tố thúc đẩy phát sinh ung thư dày thể ruột việc sử dụng chất ức chế đặc hiệu thụ thể Ach mở hướng tiếp cận việc phát triển liệu pháp nhắm đích ung thư dày TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] P Rawla and A Barsouk, “Epidemiology of gastric cancer: global trends, risk factors and prevention,” Prz Gastroenterol, vol 14, no 1, pp 26-38, 2019, doi: 10.5114/pg.2018.80001 [2] J L Leiting and T E Grotz, “Advancements and challenges in treating advanced gastric cancer in the West,” World J Gastrointest Oncol, vol 11, no 9, pp 652-664, Sep 2019, doi: 10.4251/wjgo.v11.i9.652 [3] C.-M Zhao et al., “Denervation suppresses gastric tumorigenesis,” Sci Transl Med, vol 6, no 250, Aug 2014, Art no 250ra115, doi: 10.1126/scitranslmed.3009569 [4] Y Hayakawa et al., “Nerve Growth Factor Promotes Gastric Tumorigenesis through Aberrant Cholinergic Signaling,” Cancer Cell, vol 31, no 1, pp 21-34, 2017, doi: 10.1016/j.ccell.2016.11.005 [5] T Yang et al., “MACC1 mediates acetylcholine-induced invasion and migration by human gastric cancer cells,” Oncotarget, vol 7, no 14, pp 18085-18094, Apr 2016, doi: 10.18632/oncotarget.7634 [6] P H Nguyen et al., “Acetylcholine induces stem cell properties of gastric cancer cells of diffuse type,” Tumour Biol., vol 40, no 9, Sep 2018, Art no 1010428318799028, doi: 10.1177/1010428318799028 [7] P H Nguyen et al., “All-trans retinoic acid targets gastric cancer stem cells and inhibits patientderived gastric carcinoma tumor growth,” Oncogene, vol 35, no 43, pp 5619-5628, Oct 2016, doi: 10.1038/onc.2016.87 [8] T H Ngo, T B Luu, T T H Le, V L Mai, D T Nguyen, and P H Nguyen, “All-trans Retinoic Acid Effect on the Apoptosis Gene Expression of Gastric Cancer Cell,” NST, vol 33, no 1S, pp 138143, Oct 2017, doi: 10.25073/2588-1140/vnunst.4540 [9] H Yu et al., “Acetylcholine acts through M3 muscarinic receptor to activate the EGFR signaling and promotes gastric cancer cell proliferation,” Sci Rep, vol 7, 2017, Art no 40802, doi: 10.1038/srep40802 [10] R Edmondson, J J Broglie, A F Adcock, and L Yang, “Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors,” Assay Drug Dev Technol, vol 12, no 4, pp 207-218, May 2014, doi: 10.1089/adt.2014.573 [11] T Yang et al., “MACC1 mediates acetylcholine-induced invasion and migration by human gastric cancer cells,” Oncotarget, vol 7, no 14, pp 18085-18094, Apr 2016, doi: 10.18632/oncotarget.7634 [12] P H Nguyen et al., “Characterization of Biomarkers of Tumorigenic and Chemoresistant Cancer Stem Cells in Human Gastric Carcinoma,” Clin Cancer Res., vol 23, no 6, pp 1586-1597, Mar 2017, doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-2157 http://jst.tnu.edu.vn 260 Email: jst@tnu.edu.vn ... tơi rằng, Ach có khả kích thích tăng sinh tế bào ung thư dày thể ruột Ach làm tăng đặc tính tế bào gốc ung thư dày hình thành tumorsphere tăng cường biểu marker tế bào gốc ung thư ALDH CD44 Ức chế... hiệu chuyển dịch biểu mơ trung mơ dịng tế bào MKN45 [6] Như thấy rằng, Ach đóng vai trị quan trọng việc tăng cường đặc tính tế bào gốc ung thư dòng tế bào ung thư dày thể ruột MKN74 Kết luận Trong... NM_000610 NM_002046 Kết bàn luận 3.1 Ảnh hưởng Ach nhân lên tế bào ung thư dày MKN74 Hình Ảnh hưởng Ach lên tăng sinh tế bào ung thư dày MKN74 Các tế bào xử lý với Ach nồng độ từ 0,1 – 10 µM Đối