Nghiên cứu tác động ức chế của hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ cây ardisia gigantifolia lên tế bào ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀM QUỐC ĐẠT NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT TRITERPENOID SAPONIN PHÂN LẬP TỪ CÂY ARDISIA GIGANTIFOLIA LÊN TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN, 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀM QUỐC ĐẠT NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT TRITERPENOID SAPONIN PHÂN LẬP TỪ CÂY ARDISIA GIGANTIFOLIA LÊN TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Bảo Ngọc THÁI NGUYÊN, 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu tôi, số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cá nhân tập thể ghi nhận lời cảm ơn Thái Nguyên, ngày 05 tháng 01 năm 2022 Học viên ii LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo: PGS.TS Trần Bảo Ngọc (ĐH Y Dược - ĐH Thái Nguyên) tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Phú Hùng Trưởng khoa Công nghệ Sinh thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, phận sau Đại học - trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ suốt q trình học tập trường Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, lãnh đạo Phịng Sở Y tế tỉnh Thái Ngun nơi tơi công tác tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Trong trình thực luận văn cịn hạn chế mặt thời gian, kinh phí trình độ chun mơn nên khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận ý kiến quý báu thầy cô giáo, nhà khoa học, bạn bè, đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Thái Nguyên, ngày 05 tháng 01 năm 2022 Học viên Đàm Quốc Đạt MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Lá khôi 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Thành phần hóa học Lá khôi 1.1.3 Tác dụng y học Lá khôi 1.2 Khái quát triterpenoid triterpenoid saponin 1.2.1 Giới thiệu chung triterpenoid saponin 1.2.2 Vai trò triterpenoid saponin ức chế tăng sinh tế bào ung thư 1.2.3 Triterpenoid saponin ức chế xâm lấn di điều hòa giảm số lượng tế bào gốc ung thư 1.3 Ung thư dày 10 1.4 Tế bào gốc ung thư 12 1.4.1 Tổng quan tế bào gốc ung thư 12 1.4.2 Các marker tế bào gốc ung thư 13 1.5 Quá trình apoptosis 14 1.5.1 Hình thái tế bào apoptosis 15 1.5.2 Cơ chế trình apoptosis 16 1.5.3 Thay đổi apoptosis ung thư 18 1.6 Lão hóa tế bào 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 22 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phương pháp ni cấy thử hoạt tính hợp chất triterpenoid saponin 23 2.4.2 Phương pháp phân tích tăng sinh tế bào 23 2.4.3 Phương pháp tách chiết tinh ARN tổng số 23 2.4.4 Phương pháp phân tích biểu gen Realtime PCR 24 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin H3 từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thư dày AGS 25 3.2 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khôi lên khả sống sót tế bào AGS mơi trường nuôi cấy 26 3.3 Kết tác động tripterenoid saponin saponin H3 từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thư dày CD44 27 3.4 Kết tác động triterpenoid saponin H3 từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thư 28 3.5 Kết tác động triterpenoid saponin saponin từ Lá khơi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thư dày AGS 29 3.6 Kết tác động tripterenoid saponin từ Lá khôi lên lão hóa tế bào tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 Kết luận 33 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các kiểu cấu trúc phổ biến triterpenoid Hình 1.2 Các marker tế bào gốc ung thư biểu số bệnh ung thư người 14 Hình 1.3 Tế bào apoptotic kính hiển vi quang học 15 Hình 1.4 Con đường apoptosis tế bào 16 Hình 1.5 Các đặc điểm kiểu hình lão hóa 20 Hình 3.1 Tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ triterpenoid saponin H3 khác (Thang đo 50 µm) 25 Hình 3.2 Tỷ lệ phần trăm tế bào AGS sống sót xử lý với H3 nồng độ khác so với đối chứng (100%),* p ≤ 0,05; n = 26 Hình 3.3 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu marker tế bào gốc ung thư CD44 tế bào AGS mơ hình ni cấy 2D 28 Hình 3.4 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu gen tế bào gốc ung thư 29 Hình 3.5 Tác động triterpenoid Saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên tumorsphere điều kiện nuôi cấy 3D nồng độ khác 29 Hình 3.6A Hình ảnh tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc với tripterenoid saponin H3 (Thang đo 50 µm) 31 Hình 3.6B Tỷ lệ tế bào AGS lão hóa xử lý với triterpenoid saponin H3 nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc 31 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ung thư dày nguyên nhân gây chết thứ loại ung thư toàn giới Các liệu pháp chống ung thư thường tiêu diệt không chọn lọc tế bào ung thư Thêm vào đó, tái phát ung thư tượng kháng thuốc điều trị trở thành thách thức lớn điều trị ung thư dày nói riêng ung thư nói chung Một trọng tâm việc phát triển liệu pháp nhắm đích tìm kiếm hợp chất có khả tiêu diệt hiệu tế bào ung thư hạn chế tác dụng phụ khả tái phát sau điều trị Chính vậy, việc tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên mà trọng tâm từ thảo dược tự nhiên đặc biệt trọng nhiều quốc gia khác Việt Nam quốc gia có nguồn thực vật phong phú đa dạng với hàng ngàn thuốc ghi nhận vốn tri thức địa đồng bào dân tộc khác Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia) phân bố nhiều nơi khác khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam, sử dụng phổ biến dân gian thuốc hữu hiệu điều trị số bệnh dày Triterpenoid saponin hợp chất chuyển hóa thứ cấp Trong năm gần đây, quan tâm đến Triterpenoid saponin tác dụng chúng tế bào khối u ngày tăng Đã có nghiên cứu chứng minh rằng, triterpenoid saponin có hoạt tính chống ung thư phổ rộng, ức chế tăng sinh gây trình apoptosis khối u tế bào, giảm hoạt động xâm lấn tế bào ung thư; số dạng triterpenoid saponin thể tác dụng chống viêm Một số hợp chất triterpenoid saponin Ardisia gigantifolia phân lập công bố vài tác giả khác nhiên, nghiên cứu khả ức chế ung thư dày chúng hạn chế Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác động ức chế hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ Ardisia gigantifolia lên tế bào ung thư dày’’ Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá tác động ức chế hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ Lá khôi (Ardisia gigantifolia) lên kiểu hình, sinh trưởng, biểu số gen tế bào gốc, apoptosis trình lão hóa tế bào ung thư dày mơ hình ni cấy in vitro Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thư dày AGS Nội dung 2: Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi lên khả sống sót tế bào AGS môi trường nuôi cấy Nội dung 3: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thư dày CD44 Nội dung 4: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thư Nội dung 5: Đánh giá tác động triterpenoid saponin từ Lá khơi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thư dày AGS Nội dung 6: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khơi lên lão hóa tế bào tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Lá khôi 1.1.1 Đặc điểm chung Cây Lá khơi thuộc chi Ardisia có tên khoa học Ardisia gigantifolia Stapf Cây Lá khôi dạng bụi lớn nửa bụi, cao khoảng từ 1-3 m, có thân rễ bị dày, thường khơng phân cành, khơng có lơng Lá thường tập trung đầu thân, mép khía cưa nhỏ nhọn dày đặc, hai mặt khơng có lơng có lơng mềm nhỏ thưa gân mặt dưới, có điểm tuyến lồi thưa thớt, nhiều gần mép lá; gân bên khoảng 15-20 đôi, hướng lên, cuống dài 2-4cm Hoa màu hồng trắng Cánh hoa hình trứng dài 4-5 mm, có điểm tuyến Nhị dài 2/3 cánh hoa, bao phấn hình trứng Bầu hình cầu, nhẵn có lơng nhỏ, vịi nhụy dài gần cánh hoa; nỗn nhiều, vịng Quả hình cầu đường kính khoảng mm, màu hồng có gân tuyến điểm tuyến Theo tác giả Võ Văn Chi, nhiều loài Ardisia Việt Nam dân gian sử dụng làm thuốc phân bố Sơn La, Bắc Giang, Hà Nội (Ba Vì), Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, Kon Tum Cây hoa tháng 3-6, có tháng 11-12 Mọc rừng thưa, rừng rậm, sườn đồi, thung lung, khe núi, bờ suối nơi ẩm có bóng râm [1] 1.1.2 Thành phần hóa học Lá khơi N.H Anh cộng nghiên cứu thành phần hóa học hai lồi Ardisia silvestris Ardisia gigantifolia vào năm 1996, cơng bố tìm thấy hai dẫn xuất resocinol 2-methyl-5-(Z-nonadec-14enyl)resorcinol 5-(Z-nonadec14-enyl)resorcinol Ngoài ra, từ loài A silvestris, số sterol 38 stigmasterol, spinasterol hàm lượng chính, cịn có 24-methylenecholesterol, stigmast-22-en-3β-ol, 22-dihydrospinasterol số hợp chất tritecpen khác lanost-8-en-3β-ol, taraxerol, lanosterol, β-amyrin, 24-methylenelanost-8-en3β-ol 24-methylenecycloartanol tìm thấy [2] Bằng phản ứng hóa học đặc trưng xác định 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào Nuôi cấy thử hoạt tính hợp chất triterpenoid dòng tế bào ung thư dày AGS: 10.000 tế bào đưa vào giếng đĩa 96 giếng, giếng bổ sung 100 µl môi trường nuôi cấy RMPI 1640 chứa 10% huyết bị 1% penicillin streptomycin Đĩa ni cấy o đưa vào tủ nuôi cấy CO2 nuôi cấy nhiệt độ 37 C, 5% CO2 Sau 48h nuôi cấy, môi trường cũ thay môi trường Quan sát thay đổi hình dạng phân tích số lượng tế bào kính hiển vi soi ngược NIKON Ts2 kiểu nhân tế bào (nhuộm DAPI) kính hiển vi huỳnh quang NIKON T2U sau 24h, 48h ngày 2.4.2 Phương pháp phân tích tăng sinh tế bào Thử nghiệm khả ức chế tăng sinh tế bào tiến hành dải gồm nồng độ khác thời gian ủ khác hợp chất triterpenoid Phương pháp tiến hành dựa nghiên cứu công bố trước có thay đổi cho phù hợp với nghiên cứu [27] Tế bào nuôi đĩa 96 giếng (100μl/giếng) với mật độ 5x10 tế bào/cm Các tế bào xử lý với nồng độ khác dịch chiết Lá khôi 24h 48h Tiếp theo giếng nuôi cấy bổ sung 10µl MTT o (nồng độ 5mg/ml) ủ đĩa 37 C 4h, sau bổ sung 100 µl DMSO Đo mật độ quang bước sóng 570nm máy quang phổ (Multiskan Sky Thermo) Các thí nghiệm lặp lại ba lần, độ có n = (5 giếng cho nồng độ) % Tế bào sống so với đối chứng = Mật độ quang giếng xử lý Mật độ quang giếng đối chứng 2.4.3 Phương pháp tách chiết tinh ARN tổng số Bước 1: * 100 Bước 2: Bước 3: Bước 4: Bước 5: Bước 6: Bước 7: Bước 8: 2.4.4 Phương pháp phân tích biểu gen Realtime PCR Trình tự mồi gen phân tích trình bày bảng Bảng 1: Trình tự mồi gen sử dụng nghiên cứu Klf4 Mồi xuôi Mồi ngược Nanog Mồi xuôi Mồi ngược Oct4 Mồi xuôi Mồi ngược ARN sử dụng để thực phản ứng tạo cDNA Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (cung cấp Qiagen) theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu từ thực nghiệm xử lý phầm mềm chuyên dụng GraphPad Prism 5.0, tiến hành theo phương pháp phân tích Mann-Whitney Sự khác biệt có ý nghĩa với giá trị P < 0,05 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin H3 từ Lá khôi lên hình thái tế bào ung thư dày AGS Để đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin H3 tách chiết từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thư dày AGS điều kiên nuôi cấy in vitro, tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 vào môi trường nuôi với nồng độ khác nhau: 1- 2.5- 5- 10 20 µg/ml Kết đánh giá thay đổi hình thái tế bào so sánh với đối chứng môi trường nuôi cấy AGS không bổ sung triterpenoid saponin H3 (nồng độ triterpenoid saponin H3 0µg/ml) Sau 48 giờ, tế bào xử lý quan sát kính hiển vi soi ngược Kết quan sát ghi lại hình 3.1 Hình 3.1 Tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ triterpenoid saponin H3 khác (Thang đo 50 µm) Quan sát kết hình 3.1 thấy, môi trường đối chứng (không bổ sung triterpenoid saponin H3), tế bào AGS phát triển đồng môi trường ni cấy Các tế bào ni cấy AGS có hình ovan thoi dài điển hình, tế bào chất bắt màu đồng với chất nhuộm, không quan sát tế bào có bất thường hình dạng hay tế bào chất Như vậy, môi trường sử dụng nuôi cấy phù hợp với phát triển sinh trưởng tế bào ung thư dày AGS, mơi trường khơng có chứa chất gây ức chế hay ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển bình thường tế bào Sự tác động làm thay đổi hình thái tế bào ức chế tồn tế bào ung thư môi trường ni cấy tiêu chí sử dụng phổ biến đánh giá tính độc hợp chất tế bào ung thư Mu cộng quan sát thấy tác động hợp chất triterpenoid saponin chiết xuất từ Lá khơi đến kiểu hình sinh trưởng dịng tế bào ung thư Triterpenoid saponin AG8 ức chế khả nhiều dòng tế bào ung thư khác MDA-MB-231, BT-549 MDA-MB-157 phụ thuộc vào nồng độ hợp chất môi trường nuôi cấy [41] Dịch chiết từ loài thực vật Artemisia annua, Coptis chinensis, Curcuma longa, Fagonia indica, Garcinia oblongifolia, Garcinia indica, Hedyotis diffusa, Loranthus parasiticus, Morus alba, ghi nhận có khả ức chế sinh trưởng tồn nhiều dòng tế bào ung thư khác [42] 3.2 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khôi lên khả sống sót tế bào AGS mơi trường ni cấy Để xác định xác khả ức chế triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên khả tồn tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy, tiến hành xác định số lượng tế bào cịn tồn mơi trương sau mốc thời gian 24 tiếp xúc 48 tiếp xúc nồng độ xử lý khác bao gồm 0.5-1-2.5-5-10 20 µg/ml Số lượng tế bào so sánh với mốc 100% môi trường đối chứng khơng có bổ sung triterpenoid saponin H3 Tác động triterpenoid saponin H3 nồng độ khác khoảng thời gian khác có thay đổi đáng ý Kết xác định tỷ lệ tế bào môi trường nuôi cấy biểu diễn hình 3.2 Hình 3.2 Tỷ lệ phần trăm tế bào AGS sống sót xử lý với H3 nồng độ khác so với đối chứng (100%),* P < 0,05; n = Ở môi trường nuôi cấy tế bào AGS có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi với nồng độ µg/ml, mốc thời gian 24 tiếp xúc, tỷ lệ tế bào nuôi cấy AGS sống xác định 50% so với đối chứng, nhiên, sau 48 ni cấy, tỷ lệ phần trăm tế bào cịn sống xác định khoảng 85%, tương đương môi trường ni cấy với nồng độ triterpenoid saponin H3 0,5 µg/ml thời gian tiếp xúc 48 Từ kết thấy sau thời gian dài tiếp xúc, tác động ức chế sinh trưởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có xu hướng giảm sút Điều giải thích đặc tính hợp chất tự nhiên dễ chịu tác động từ yếu tố mơi trường dẫn đến phân hủy hợp chất làm hoạt tính Từ kết thấy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi hợp chất không bền, thời gian dài tồn mơi trường ni cấy bị phân hủy dẫn đến phần hoạt tính Cùng với đó, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả kích thích nhẹ q trình tăng sinh tế bào ung thư AGS thời gian ngắn tiếp xúc nồng độ thấp, sau có khả ức chế tăng sinh tồn tế bào AGS Khả ức chế tăng sinh tồn tế bào ung thư AGS triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi phụ thuộc vào nồng độ hợp chất cịn tồn mơi trường nuôi cấy thời gian tiếp xúc với hợp chất Một hợp chất triterpenoid saponin khác từ Lá khôi A8 Mu cộng chiết xuất xác định khả ức chế tồn nhiều dòng tế bào ung thư khác điều kiện in vitro Kết nghiên cứu cho thấy sau 24 ni cấy, dịng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 giá trị IC50 3.80 µM, dòng tế bào BT-549 MDA-MB-157 giá trị IC50 xác định 0.73 1.38 µM Khả ức chế tăng sinh tế bào A8 dòng tế bào ung thư vú xác định phụ thuộc vào nồng độ hợp chất môi trường nuôi cấy [41] 3.3 Kết tác động tripterenoid saponin saponin H3 từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thư dày CD44 CD44 dấu ấn sinh học biểu nhiều dạng ung thư khác Biểu CD44 có liên quan đến tăng sinh, tự làm di tế bào ung thư Trong ung thư dày, CD44 định dấu ấn sinh học cho phương pháp tiếp cận chẩn đoán, điều trị tiên lượng tăng cường biểu CD44 có liên quan đến tiên lượng xấu bệnh nhân với việc gia tăng biểu đặc tính tế bào gốc ung thư thúc đẩy hình thành khối u [43] Đồng thời, ức chế CD44 làm giảm đáng kể hình thành tumorsphere giảm phát triển khối u [44] Hình 3.3 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu marker tế bào gốc ung thư CD44 tế bào AGS mơ hình ni cấy 2D Như vậy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu marker CD44 tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy, tỉ lệ tế bào nuôi cấy AGS có biểu CD44 giảm mạnh theo tăng lên nồng độ triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có mặt mơi trường Thơng qua ức chế biểu CD44, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu đặc tính quan trọng tế bào gốc ung thư dày AGS, từ ức chế tăng sinh, tồn di tế bào ung thư 3.4 Kết tác động triterpenoid saponin H3 từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thư Sự biểu gen đặc trưng tế bào gốc tế bào gốc ung thư có ảnh hưởng lớn đến q trình sinh trưởng, phát triển, khả di đặc tính đặc trưng tế bào gốc Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định ảnh hưởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên biểu ba gen đặc trưng cho “tính gốc” tế bào gốc ung thư dày AGS Oct4, Nanog Klf4 nồng độ IC50 (1 µg/ml) sau 24 tiếp xúc Kết phân tích biểu gen so sánh với mức độ biểu gen tế bào AGS nuôi cấy môi trường đối chứng Kết phân tích biểu gen thể hình 3.4 Hình 3.4 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu gen tế bào gốc ung thư Sự kết hợp biểu gen oct4, nanog klf4 có vai trị quan trong q trình tự làm (self-renewal) biệt hóa tế bào gốc Sự ức chế hoạt động oct4, nanog klf4 tế bào gốc dẫn đến ức chế trình tự làm tế bào, đồng thời cảm ứng trình biệt hóa tế bào dẫn đến làm ức chế “tính gốc” tế bào gốc [45], [46] Như vậy, nghiên cứu này, xác định triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi có khả ức chế, làm giảm khả tự làm (selfrenewal) thức đẩy biệt hóa tế bào gốc ung thư thông qua giảm mức độ biểu gen liên quan đến đặc tính quan trọng tế bào gốc ung thư oct4, nanog klf4 3.5 Kết tác động triterpenoid saponin saponin từ Lá khơi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thư dày AGS Tumorsphere dạng sinh trưởng tế bào điều kiện ni cấy 3D, có tương đồng cao mơ hình khối u thể sống (in vivo) Trong nghiên cứu này, để nghiên cứu tác động triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi lên hình thành tumorsphere từ tế bào ung thư dày AGS, tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi với nồng độ nồng độ 0.5 µg/ml vào mơi trường ni cấy AGS hình thành tumorsphere ngày nuôi cấy thứ Sau 48 tiếp xúc với triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi, thay đổi hình thái tumorsphere ghi lại ảnh chụp kính hiển vi độ phóng đại 200 lần (Hình 3.4) Hình 3.5 Tác động triterpenoid Saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên tumorsphere điều kiện nuôi cấy 3D nồng độ khác Hiện nay, mơ hình thử thuốc điều kiện nuôi cấy 3D đặc biệt quan tâm ưu điểm bật tương đồng với hình thành phát triển tế bào ung thư điều kiện in vivo Trong nghiên cứu này, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi xác định có khả ức ức chế tiêu diệt khối tế bào in vitro (tumorsphere) cách hiệu quả, mở tiềm ứng dụng hợp chất điều trị ung thư 3.6 Kết tác động tripterenoid saponin từ Lá khơi lên lão hóa tế bào tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy Trong nội dung nghiên cứu, để xác định tác động triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi lên lão hóa tế bào, tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 vào mơi trường ni cấy với nồng độ µg/ml (IC50) Sau 24 tiếp xúc, tế bào xử lý với X-gal để xác định enzyme β-galactosidase đặc trưng cho tế bào lão hóa Kết quan sát biến đổi kiểu hình lão hóa kính vi ghi lại hình 3.6A Kết phân tích xác định tỉ lệ tế bào lão hóa mơi trường ni cấy ghi lại hình 3.6B Hình 3.6A Hình ảnh tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc với tripterenoid saponin H3 (Thang đo 50 µm) Trong môi trường nuôi cấy bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi nồng độ µg/ml, sau 24 tiếp xúc, quan sát thấy số tế bào AGS môi trường nuôi cấy có xuất màu xanh đặc trưng chuyển hóa chất X-gal tác động enzyme β-galactosidase đặc trưng cho tế bào lão hóa Như thấy được, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi nồng độ thấp có khả gây q trình lão hóa tế bào ung thư dày AGS điều kiện nuôi cấy Hình 3.6B Tỷ lệ tế bào AGS lão hóa xử lý với triterpenoid saponin H3 nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc Như trình bày trên, q trình lão hóa tế bào với đặc trưng ngưng trệ chu kỳ tế bào ức chế q trình apoptosis, có vai trị ức chế phát triển tế bào ung thư Trong nghiên cứu này, xác định triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi có khả gây q trình lão hóa cho tế bào ung thư dày AGS, từ dẫn đến khả ức chế sinh trưởng phát triển té bào AGS môi trường nuôi cấy KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xác định triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có tác động lên kiểu hình tế bào ung thư dày AGS điều kiện nuôi cấy Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế khả sống sót tế bào ung thư dày AGS với IC50 Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi làm giảm biểu marker tế bào gốc CD44 tế bào AGS nuôi cấy Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu gen liên quan đến tính gốc tế bào AGS oct4, nanog klf4 Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế phát triển gây chết tumorsphere tế bào AGS hình thành điều kiện ni cấy 3D Trong điều kiện nuôi cấy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả thúc đẩy lão hóa tế bào ung thư dày AGS Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên phát triển dòng tế bào ung thư dày mức độ protein TÀI LIỆU THAM KHẢO Chi, V.V., Từ điển thuốc Việt Nam, tập 1–2, Nxb Y học, Hà Nội, 2012 Anh, N.H., et al., Resorcinol derivatives from two Ardisia species Planta medica, 1996 62(05): p 479-480 Wen, P., et al., Four new triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia Stapf and their cytotoxic activity 2008 Mu, L.-H., J.-Q Feng, and P Liu, A new bergenin derivative from the rhizome of Ardisia gigantifolia Natural product research, 2013 27(14): p 1242-1245 Lê, T.T.H., Nghiên cứu tính đa dạng nguồn thuốc sử dụng cộng đồng dân tộc thiểu số tỉnh Thái Nguyên nhằm bảo tồn phát triển bền vững 2015 Yarnell, E., Plant Chemistry in Veterinary Medicine: Medicinal Constituents Veterinary Herbal Medicine, 2006: p 159 Podolak, I., A Galanty, and D Sobolewska, Saponins as cytotoxic agents: a review Phytochemistry Reviews, 2010 9(3): p 425-474 Chun, J., M Kang, and Y.S Kim, A triterpenoid saponin from Adenophora triphylla var japonica suppresses the growth of human gastric cancer cells via regulation of apoptosis and autophagy Tumor Biology, 2014 35(12): p 12021-12030 Mu, L.-H., N.-Y Wei, and P Liu, Cytotoxic triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia Planta medica, 2012 78(06): p 617-621 10 Du, J.-R., F.-Y Long, and C Chen, Research progress on natural triterpenoid saponins in the chemoprevention and chemotherapy of cancer The enzymes, 2014 36: p 95-130 11 Hwang, Y.S., K.-K Park, and W.-Y Chung, Kalopanaxsaponin A inhibits the invasion of human oral squamous cell carcinoma by reducing metalloproteinase-9 mRNA stability and protein trafficking Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2012 35(3): p 289-300 12 Kong, Y., et al., Platycodin D, a metabolite of Platycodin grandiflorum, inhibits highly metastatic MDA-MB-231 breast cancer growth in vitro and in vivo by targeting the MDM2 oncogene Oncology reports, 2016 36(3): p 1447-1456 13 Koczurkiewicz, P., et al., Multidirectional effects of triterpene saponins on cancer cells-mini-review of in vitro studies Acta Biochimica Polonica, 2015 62(3) 14 Rawla, P and A Barsouk, Epidemiology of gastric cancer: global trends, risk factors and prevention Przeglad gastroenterologiczny, 2019 14(1): p 26 15 Thu, T., et al., Gastric and colo-rectal cancer mortality in Viet Nam in the years 2005-2006 Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2008 9: p 299-302 16 Truong, B.X., et al., Diverse characteristics of the CagA gene of Helicobacter pylori strains collected from patients from southern vietnam with gastric cancer and peptic ulcer Journal of clinical microbiology, 2009 47(12): p 4021-4028 17 Binh, T.T., et al., Advanced non-cardia gastric cancer and Helicobacter pylori infection in Vietnam Gut pathogens, 2017 9(1): p 1-9 18 Machlowska, J., et al., Gastric cancer: epidemiology, risk factors, classification, genomic characteristics and treatment strategies International journal of molecular sciences, 2020 21(11): p 4012 19 Lahmidani N, M.E.Y., Nourdine Aqodad1, Dafr Allah Benajah1, , Update on Gastric Cancer Epidemiology and Risk Factors Journal of Cancer Therapy 2018 9: p 242-254 20 Dzobo, K., et al., Advances in therapeutic targeting of cancer stem cells within the tumor microenvironment: An updated review Cells, 2020 9(8): p 1896 21 Hoffmann, W., Stem cells, self-renewal and cancer of the gastric epithelium Current medicinal chemistry, 2012 19(35): p 5975-5983 22 Amey, C.L and A.E Karnoub, Targeting Cancer Stem Cells—A Renewed Therapeutic Paradigm Oncology & hematology review, 2017 13(1): p 45 23 Singh, S.R., Gastric cancer stem cells: a novel therapeutic target Cancer letters, 2013 338(1): p 110-119 24 MacDonagh, L., et al., Lung cancer stem cells: The root of resistance Cancer letters, 2016 372(2): p 147-156 25 Dzobo, K., et al., Three-dimensional organoids in Cancer research: the search for the holy grail of preclinical Cancer modeling Omics: a journal of integrative biology, 2018 22(12): p 733-748 26 Bjerknes, M and H Cheng, Multipotential stem cells in adult mouse gastric epithelium American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2002 283(3): p G767-G777 27 Nguyen, P.H., et al., All-trans retinoic acid targets gastric cancer stem cells and inhibits patient-derived gastric carcinoma tumor growth Oncogene, 2016 35(43): p 5619-5628 28 Elmore, S., Apoptosis: a review of programmed cell death Toxicologic pathology, 2007 35(4): p 495-516 29 Liu, H., et al., Improvement of pharmacokinetic profile of TRAIL via trimer-tag enhances its antitumor activity in vivo Scientific reports, 2017 7(1): p 1-11 30 Hassan, M., et al., Apoptosis and molecular targeting therapy in cancer BioMed research international, 2014 2014 31 Adams, J.M and S Cory, The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival Science, 1998 281(5381): p 1322-1326 32 Yip, K and J Reed, Bcl-2 family proteins and cancer Oncogene, 2008 27(50): p 6398-6406 33 Elkholi, R., et al., Putting the pieces together: How is the mitochondrial pathway of apoptosis regulated in cancer and chemotherapy? Cancer & metabolism, 2014 2(1): p 1-15 34 Pfeffer, C.M and A.T Singh, Apoptosis: a target for anticancer therapy International journal of molecular sciences, 2018 19(2): p 448 35 Ranjan, A., et al., Role of phytochemicals in cancer prevention International journal of molecular sciences, 2019 20(20): p 4981 36 Gorgoulis, V., et al., Cellular senescence: defining a path forward Cell, 2019 179(4): p 813-827 37 Matjusaitis, M., et al., Biomarkers to identify and isolate senescent cells Ageing research reviews, 2016 29: p 1-12 38 Coppé, J.-P., et al., The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 2010 5: p 99-118 39 Wyld, L., et al., Senescence and cancer: A review of clinical implications of senescence and senotherapies Cancers, 2020 12(8): p 2134 40 Rao, X., et al., An improvement of the 2ˆ (–delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis Biostatistics, bioinformatics and biomathematics, 2013 3(3): p 71 41 Mu, L.-H., et al., Triterpenoid saponin AG8 from Ardisia gigantifolia stapf induces triple negative breast cancer cells apoptosis through oxidative stress pathway Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020 2020 42 Khan, T., et al., Anticancer plants: A review of the active phytochemicals, applications in animal models, and regulatory aspects Biomolecules, 2020 10(1): p 47 43 Lau, W.M., et al., CD44v8-10 is a cancer-specific marker for gastric cancer stem cells Cancer research, 2014 74(9): p 2630-2641 44 Takaishi, S., et al., Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44 Stem cells, 2009 27(5): p 1006-1020 45 Takahashi, K and S Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors cell, 2006 126(4): p 663-676 46 Xiang, Y., et al., The progress and prospects of putative biomarkers for liver cancer stem cells in hepatocellular carcinoma Stem cells international, 2016