Luận văn xác định mối quan hệ di truyền của cam bố hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 THÁI NGUYÊN, 2019 h ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 47 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN, 2019 h i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tơi nhận dẫn tận tình Thầy TS Nguyễn Văn Duy – Trưởng khoa CNSH-CNTP Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên phương pháp nghiên cứu, phân tích kết quả,…và tạo điều kiện thuận lợi trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy tận tình hướng dẫn, trực tiếp bảo kĩ làm việc giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài hồn thành khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Tiến Dũng cán phòng thí nghiệm Thực hành Sinh học phân tử thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm hướng dẫn kĩ làm việc, tận tình bảo, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè người ln bên cạnh động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực khố luận Trong q trình thực tập, trình làm báo cáo thực tập, khó tránh khỏi sai sót Đồng thời trình độ lí luận kinh nghiệm thực tiễn cịn hạn chế nên báo cáo tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy, để báo cáo hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng Sinh viên Nguyễn Thị Thái Thùy h năm 2019 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: lồi cam,qt có ý nghĩa thực tiễn Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007) Bảng 3: Diện tích, sản lượng cam Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017) Bảng 1: Kết thu thập mẫu 16 Bảng 2: Trình tự mồi ISSR sử dụng 17 Bảng 3: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 4: Danh mục loại hóa chất sử dụng đề tài 17 Bảng 1: Hệ số tương đồng di truyền cuả 32 mẫu cam nghiên cứu 37 h iii DANH MỤC HÌNH Hình 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn vị:nghìn tấn) Hình 1: Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình PCR -ISSR 20 Hình 1: kết điện di kiểm tra DNA tổng số mẫu cam 22 Hình 2: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T1 23 Hình 3: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T2 24 Hình 4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T3 25 Hình 5: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPT-01 26 Hình 6: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPM-13 27 Hình 7: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-17 28 Hình 8: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPQ-18 29 Hình 9: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-08 30 Hình 10: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPB-18 31 Hình 11: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-04 32 Hình 12: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPC-08 33 Hình 13: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPO-04 34 Hình 14: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-16 35 Hình 15 sơ đồ mơ tả quan hệ di truyền 32 mẫu cam nghiên cứu (coefficient: hệ số tương đồng di truyền) 38 h iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ cs Cộng CTAB Cetyl trimetyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FAO Food and Agriculture Organization ISSR Inter - simple sequence repeat NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SSR Simple sequence repeat TAE Tris - acetate - EDTA TE Tris – EDTA h v LỜI CẢM ƠN I DANH MỤC BẢNG II DANH MỤC HÌNH III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IV PHẦN MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài .2 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan cam, quýt .3 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc 2.1.1.2 Phân loại .3 2.1.2 Giá trị cam, quýt 2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ cam quýt giới 2.2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ cam, quýt giới .6 2.2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt Việt Nam 2.3 Các kĩ thuật sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1 kỹ thuật RAPD 2.3.1.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD .8 2.3.2 Kĩ thuật ISSR 2.3.2.1 Giới thiệu kĩ thuật ISSR 2.3.3 Một số kĩ thuật khác 10 2.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới nước 11 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 h vi 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 13 PHẦN 15 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .15 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu .16 3.2 Vật liệu, thiết bị hóa chất nghiên cứu 16 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu .16 3.2.2 Thiết bị nghiên cứu 17 3.2.3 Hóa chất .17 3.3 Nội dung nghiên cứu 18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA 18 3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh DNA tổng số 19 3.4.3 Phương pháp RAPD, ISSR 19 3.4.4 Phương pháp phân tích đa hình 20 3.5 Các phương pháp xử lý số liệu 21 PHẦN 22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ cam 22 4.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD, ISSR 22 4.2.1 Phân tích đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi 23 4.3 Xác định mối quan hệ di truyền giống camnghiên cứu dựa giản đồ phả hệ DNA 36 4.4 Xây dựng phát sinh chủng loài cam dựa giống nghiên cứu .38 PHẦN 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC I 47 h Phần MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề Cây cam (citrus sinensis (L.) Osbeck) thuộc họ Prtaceae loại ăn lâu năm có hương vị thơm ngon giá trị dinh dưỡng cao nhiều người ưa chuộng Trong thành phần cam chưa nhiều vitamin như: vitamin A, B1, C, B9; chất xơ, chất khoáng vi lượng; chứa chất chống oxy hóa có tác dụng lớn chống khối u, chống viêm [2] Một số nghiên cứu Bùi Huy Đáp (1960)[4], Trần Thế Tục năm 1977 [10], Nguyễn Minh Châu (2009)[2] cho thấy, Việt Nam có nguồn gen có múi đa dạng với nhiều vùng trồng cam nổi tiếng truyền thống Tuyên Quang (cam sành Hàm Yên), Bắc Giang (cam sành Bố Hạ), Hà Giang (cam sành), Hòa Bình (cam Cao Phong), Nghệ An (cam Vinh), Hà Tĩnh (cam Bù), Yên Bái (cam canh), Cam Bố Hạ từ lâu trở thành thương hiệu nổi tiếng người tiêu dung nước biết đến từng trở thành kinh tế mũi nhọn tỉnh Bắc Giang Tuy nhiên, qua thời gian vùng cam Bố Hạ với giống cam q đặc sản dần bị thối hóa bị nhiều nguyên nhân, Nông trường cam Bố Hạ bị giải thể Nhóm nghiên cứu đề tài “Bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, Bắc Giang” điều tra thu thập số cam Bố Hạ khu vực trồng cam Bố Hạ trước Việc đánh giá đa hình di truyền, xây dựng phát sinh chủng lồi cam Bố Hạ cần thiết nhằm cung cấp thông tin, ứng dụng công tác nghiên cứu bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen quý này, góp phần vào phát triển kinh tế, xã hội người dân tỉnh Bắc Giang Hiện nay, số phương pháp sử dụng phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền cam, quýt ISSR, SSR, RAPD… Đây sở khoa học thực tiễn để quan trọng để ứng dụng việc xác định mối quan hệ cam Bố Hạ với giống cam khác đề tài:”Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với giống cam khác thị phân tử” h 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ, Bắc Giang với giống cam khác bằng thị phân tử DNA 1.2.2 Mục tiêu cụ thể -Tách chiết DNA tổng số từ cam, quýt đủ điều kiện để thực phản ứng RAPD, ISSR - Phân tích phân đoạn DNA giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD ISSR -Phân tích mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với giống cam thu thập dựa triên sơ đồ phả hệ DNA 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Kết nghiên cứu đề tài sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học việc ứng dụng thị phân tử xây dựng phát sinh chủng loài cam - Kết nghiên cứu đề tài sẽ góp phần bở sung thêm tài liệu khoa học, phục vụ cho công tác giảng dạy nghiên cứu cam nước ta 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với giống cam khác sở để thực biện pháp bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, khôi phục lại thương hiệu cam nởi tiếng góp phần nâng cao đời sống kinh tế, xã hội cho người dân tỉnh Bắc Giang h 39 Cây phân loại hình 4.15 tạo phân tích 32 mẫu nghiên cứu với 10 mồi RAPD mồi ISSR cho thấy hệ số tương đồng di truyền mẫu cam nghiên cứu dao động khoảng từ 0,64 – 1,00; chứng tỏ rằng mẫu cam có đa hình cao mặt di truyền Sơ đồ cho thấy 32 mẫu cam chia làm nhóm chính: Nhóm I: mẫu đối chứng chấp (CH), mẫu nằm riêng biệt so với mẫu lại Khoảng cách di truyền với nhóm II 0,36 Nhóm II: gồm 31 mẫu Trong nhóm lại tiếp tục chia làm nhóm phụ, bao gồm: Nhóm phụ I: bao gồm 14 mẫu cam, quýt chia tiếp thành cụm (cụm cụm 2) Có sai khác di truyền 0,26 (hệ số tương đồng di truyền cụm 0,74) Cụm bao gồm cụm 1a cụm 1b Cụm 1a gồm cụm cụm 1a-1 cụm 1a-2 Trong : + Cụm 1a-1 gồm mẫu (QS,QO,QN), mẫu quýt Trong mẫu QS QO có hệ số tương đồng di truyền cao 0,94 Hệ số tương đồng QN với mẫu quýt 0,80 + Cụm 1a-2 bao gồm mẫu (C36,CS,V2,V2-1,CP,NA) Trong mẫu (V2,V21) có hệ số tương đồng di truyền cao 1,00 tỏ mẫu cam Mẫu cam C36 CS có hệ số tương đồng di truyền 0,93 Mẫu cam CP,NA có hệ số tương đồng di truyền 0,88 Cụm 1b gồm cụm 1b-1 cụm 1b-2, đó: + Cụm 1b-1 gồm mẫu cam (cam sành Hàm Yên So ) có hệ số tương đồng di truyền với cụm 1b-2 (cam sành Hàm Yên So ) 0,79 Cụm gồm mẫu (BH,Cr) hệ số tương đồng di truyền mẫu 0,85 Đây mẫu cam không hạt Mẫu cam BH mẫu cam chín sớm có hệ số tương đồng di truyền với mẫu cam CS C36 (CS C36 mẫu cam chín sớm) 0,845 Nhóm phụ II: bao gồm mẫu cam chia tiếp thành cụm (cụm cụm 4) có sai khác di truyền 0,27 (hệ số tương đồng di truyền nhóm phụ 0,73) h 40 Cụm bao gồm mẫu (A,B,C,CBH,CS1-1, CV,CC,C2) Trong đó, mẫu cam (A,B) mẫu (CV, CC) có hệ số tương đồng di truyền cao 0,90 CS1-1 có hệ số tương đồng di truyền với mẫu cam A,B 0,84 CBH có hệ số tương đồng di truyền với mẫu CV,CC 0,83 Cụm có mẫu C2 ( cam chanh) Từ kết cho thấy cam chanh Bố Hạ với cam sành Hàm Yên-Tuyên Quang thuộc hai nhánh phát sinh chủng loài khác nhau, lại có quan hệ gần gũi với ( hệ số tương đồng di truyền 0,75) Điều chứng tỏ cam sành Hàm Yên cam chanh Bố hạ có quan hệ gần gũi Cam Vinh cam Chanh trồng Thái Nguyên cam chanh Bố Hạ có hệ số tương đồng di truyền cao 0,83 ( tương ứng 83%) Kết cho thấy cam Vinh trồng Thái Nguyên có nguồn gốc xuất sứ gần họăc lai cam Bố Hạ với loại cam khác h 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tách chiết DNA tổng số từ mẫu cam thu thập, dung dịch DNA tách chiết có chất lượng tốt, hàm lượng cao, đủ điều kiện thực nghiên cứu sinh học phân tử Đã so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác bằng việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên RAPD mồi ISSR Kết cho thấy tính đa hình di truyền cao mẫu phân tích Đã đánh giá hệ số di truyền xây dựng phát sinh chủng lồi mẫu cam phân tích - Hệ số tương đồng di truyền mẫu cam dao động khoảng từ 0,64 – 1,00 Từ sơ đồ phân loại cho thấy 32 mẫu cam chia thành nhóm với hệ số sai khác di truyền Nhóm I: mẫu đối chứng chấp (CH), mẫu nằm riêng biệt so với mẫu cịn lại Khoảng cách di truyền với nhóm II 0,36 Nhóm II: gồm 31 mẫu Trong nhóm lại tiếp tục chia làm nhóm phụ, bao gồm: Nhóm phụ I: bao gồm 14 mẫu cam, quýt chia tiếp thành cụm (cụm cụm 2) Có sai khác di truyền 0,26 (hệ số tương đồng di truyền cụm 0,74) Cụm bao gồm cụm 1a cụm 1b Cụm 1a gồm cụm cụm 1a-1 cụm 1a-2 Trong : + Cụm 1a-1 gồm mẫu (QS,QO,QN), mẫu quýt Trong mẫu QS QO có hệ số tương đồng di truyền cao 0,94 Hệ số tương đồng QN với mẫu quýt 0,80 + Cụm 1a-2 bao gồm mẫu (C36,CS,V2,V2-1,CP,NA) Trong mẫu (V2,V21) có hệ số tương đồng di truyền cao 1,00 tỏ mẫu cam Mẫu h 42 cam C36 CS có hệ số tương đồng di truyền 0,93 Mẫu cam CP,NA có hệ số tương đồng di truyền 0,88 Cụm 1b gồm cụm 1b-1 cụm 1b-2, đó: + Cụm 1b-1 gồm mẫu cam (cam sành Hàm Yên So ) có hệ số tương đồng di truyền với cụm 1b-2 (cam sành Hàm Yên So ) 0,79 Cụm gồm mẫu (BH,Cr) hệ số tương đồng di truyền mẫu 0,85 Đây mẫu cam không hạt Nhóm phụ II: bao gồm mẫu cam chia tiếp thành cụm (cụm cụm 4) có sai khác di truyền 0,27 (hệ số tương đồng di truyền nhóm phụ 0,73) Cụm bao gồm mẫu (A,B,C,CS1-1,CBH,CV,CC,C2) Trong đó, mẫu cam (A,B) mẫu (CV, CC) có hệ số tương đồng di truyền cao 0,90 CS1-1 có hệ số tương đồng di truyền với mẫu cam A,B 0,84 CBH có hệ số tương đồng di truyền với mẫu CV,CC 0,83 Cụm có mẫu C2 ( cam chanh) 5.2 Kiến nghị Tiếp tục kết hợp số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác SSR, RFLP, để xác định mối quan hệ di truyền giống cam để nhằm đạt kết tin cậy cao h 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật RAPD Nguyễn Minh Châu (2009), Giới thiệu giống ăn phổ biến miền Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, NXB Lao động -xã hội Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn nhiệt đới, 1, Nxb Nông thôn Vũ Văn Hiếu, Nông Thị Huệ, Nguyễn Thị Oanh, Ninh Thị Thảo, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Phương Thảo (2015), “Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống cam sành Hà Giang bằng thị RAPD ISSR”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(6), 867 – 875 Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn, Nguyễn Văn Được (2004), “Đa dạng sinh học giống có múi huyện Gị Quao, tỉnh Kiên Giang”, TC Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, 1, 111 – 121 Nguyễn Đức Thành (2014), “Các kĩ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật”, Tạp chí sinh học, 36(3), 265 - 294 Vũ Huyền Trang, Hồng Đăng Hiếu, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2014), “Đánh giá đa dạng quần thể dó bầu (Aquilaria crassna Pierre) Việt Nam bằng thị phân tử ISSR”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 30(4), 58 – 65 Hoàng Ngọc Thuận (2004), Kỹ thuật chọn tạo trồng cam quýt, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 10 Trần Thế Tục (1967), Điều tra ăn quả, NXB Nông thôn 11 Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Đối Mục (Mugil Cephalus L.) Việt Nam bằng thị SSR 12 .http://www.hoinongdan.org.vn/ h 44 II Tiếng Anh 13 https://www.freshplaza.com/article/9054107/egypt-orange-exportscontinuing-to-expand/ 14 https://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=621&ItemID=18668 15 Asadi Abkenar, and Isshiki S (2003), Molecular characterization and genetic diversity among Japanese acid citrus (Citrus spp.) based on RAPD markers, The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 78(1), 108-112 16 Beedanagari SR, Dove SK, Wood BW, and Conner PJ (2005), “A first linkage map of pecan cultivars based on RAPD and AFLP markers”, Theor Apll Genet, 110(6), 1127 – 1137 17 Cheeng H Y., Yang W C., Hsiao J Y (2001), “Genetic diversity and relationship among peach cultivars based on random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)”, Bot Bull Acad Sin., 42, 201 - 206 18 Constantinos Tripolitsiotis, Nikoloas Nikoloudkis, Arthanasios Linos, Marianna Hagidimmitriou (2013), “Molecular Characterization and Analysis of the Greek Citrus Germplasm”, Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj Napoca, 41(2), 463 - 471 19 Davies, and F S (1986), The navel orange Rep., J Janick (ed.) AVI Press, Westport, Conn., In: Hort Reviews 20 Dehesdtani A, Kazemitabar S K, and Rahimian H (2007), Assessment of Genetic Diversity of Navel Sweet Orange Cultivars Grown in Mazandaran Province Using RAPD Markers, Asian Journal of Plant Sciences, 6(7), 1119 – 1124 21 De Pasquale F, Siragusa M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, Alonzo G (2006), “Characterization of five sour orange clones through molecular markers and leaf essential oils analysis”, Scientia Horticulturae, 109, 54 - 59.) 22 Dehesdtani A, Kazemitabar SK, Rahimian H (2007), “Assessment of genetic diversity of navel sweet orange cultivars grown in Mazandaran province using RAPD markers”, Asian Journal of Plant Sciences, 6(7), 1119 – 1124 23 De Pasquale F, Siracuga M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, and Alonzo G (2006), Characterization of five sour orange clones through molecular mark- h 45 ers and leaf essential oils analysis, Scisentia Horticulturae, 109(1), 54 - 59 36 De Pasquale F, Siragusa M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, Alonzo G (2006), “Characterization of five sour orange clones through molecular markers and leaf essential oils analysis”, Scientia Horticulturae, 109, 54 - 59.) 24 Ebtsam M Hamza (2013), “Genetic Diversity of Some Citrus Varieties Based on Microsatellite and RAPD Molecular Markers in Egypt”, World Journal of Agricultural Sciences, 9(4), 316 – 324 25 Helvécio Della Coletta Filho, Marcos Antonio Machado, M Luiza P.N Targon and Jorgino Pompeu Jr (2000), “The use of random amplified polymorphic DNA to evaluate the genetic variability of Ponkan Madarin (Citrus Reticulata Blanco) accessions”, Genetics and Molecular Biology, 23(1), 169 172 26 Lamine M., A Chebaane, A Milki (2015), “Genetic diversity analysis in Tunisian Maltaise orange (Citrus sinensis L.)”, Journal of New Sciences, 14(2), ISSN, 2286 – 5314 27 Lamyaa M Sayed, M F Maklad (2015), “Molecular characterization and genetic diversity of some egyptian citrus cultivars using RAPD and ISSRs markers”, Egypt J Genet Cytol., 44, 387 - 403 28 Madhumathi C., Purushotham K., Chandhrasekhar R., Gopal K., Sekhar M.R., Shankar T.G (2016), “Assessment of molecular diversity in Elite Sweet Orange (Citrus sinensis L Osback) accessions using RAPD markers”, Electronic journal of Plant Breeding, 7(2), 332 - 340 29 Martasari C., Karsinah and Reflinur (2012), “Characterization of Indonesian‘Siam’ cultivar (Citrus nobilisLour.) by morphological and ISSR markers”, ARPN Journal of Agricultural and Biological Science,7, 830 - 835 30 Maya M.A., M.G Rabbani, M.G Mahboob and Y Matsubara (2012), “Assessment of Genetic Relationship among 15 Citrus Fruits Using RAPD”, Asian Journal of Biotechnology, 4(1), 30 - 37 31 Mirko Siragusa, Fabio De Pasquale, Loredana Abbate, and Nicasio (2006), “Identification of Sour Orange Accessions and Evaluation of Their Genetic Variability by Molecular Marker Analyses”, HortScience, 41(1), 84 - 89 h 46 32 Nagai, and Tanigawa K O (1928), On Citrus pollination, Procthird, Pan pacific.Sci.Cong.2(2023 - 2029) 33 Naz S, Shahzadi K, Rashid S, Saleem F, Zafarullah A, and Shabbir Ahmad (2014), Molecular characterization and phylogentic relationship of different Citrus varieties of Pakistan, The Journal of Animal & Plant Sciences, 24(1), 315 – 320 34 Oliveira E.C., Amaral Jỳnior A.T., Gonỗalves L.S.A., Pena G.F., Freitas Júnior S.P., Ribeiro R.M., Pereira M.G (2010), “Optimizing the efficiency of the touchdown technique for detecting inter-simple sequence repeat markers in corn (Zea mays)”, Genetic and Molecular Research, 9(2), 835 - 842 35 Sanchez de la Hoz M P., Davila J P., Loarce Y., Ferrer E.( 1996), “Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley”, Genome, 39, 112 – 117 36 Shahzadi K., S.Naz Ilyas (2016), “Genetic diversity of Citrus germplasm in Pakistan based on Random Amplyfied Polymorphic DNA (RAPD) markers”, The Journal of Animal & Plant Sciences, 26(4), 1094 - 1100 37 Wu K S., Jones R., Danneberger L., Scolnik P (1994), “Detection of microsatellite polymorphism without cloning.”, Nucleic Acids Res., 22, 3257 3258 h 47 PHỤ LỤC I S2- S3- S14- S12- S13- S1- S20- S4- S9- S17- S19- CS1- MẪU QS CV V2 CBH CH A B D HG Cr C36 QO B1 QN CP NA CN CS C2 CC 1 2 2 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mồi 1000 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 T1 760 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 750 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 500 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 750 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 700 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1700 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 750 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 450 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 300 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2000 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 900 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 800 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 750 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 550 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 400 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 250 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1600 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1200 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 800 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 750 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mồi T2 Mồi T3 OPT01 OPM13 h 48 OPG17 OPA08 OPQ18 OPB18 450 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 250 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2000 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1500 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1300 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1000 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 900 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 750 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 500 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 450 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 800 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 700 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 600 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 450 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1300 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1000 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 750 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 700 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 600 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 500 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 300 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 250 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 2500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 2200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1800 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1500 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 h 49 OPA04 OPC08 OPO04 1200 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 700 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 600 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 450 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1300 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 800 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 700 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 600 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 500 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 400 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 300 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 2000 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1500 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 800 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 550 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 400 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1500 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1300 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1000 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 800 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 750 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 700 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 650 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 h 50 OPG16 550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 450 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1000 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 900 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 750 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 650 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 450 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 300 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 250 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ký hiệu: số 1: xuất băng vạch Số 0: không xuất băng vạch h h h h