Khóa luận tốt nghiệp đại học xác định mối quan hệ di truyền của cam bố hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào[.]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 THÁI NGUYÊN, 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 47 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN, 2019 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tơi nhận dẫn tận tình Thầy TS Nguyễn Văn Duy – Trưởng khoa CNSH-CNTP Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên phương pháp nghiên cứu, phân tích kết quả,…và tạo điều kiện thuận lợi trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy tận tình hướng dẫn, trực tiếp bảo kĩ làm việc giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài hoàn thành khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Tiến Dũng cán phịng thí nghiệm Thực hành Sinh học phân tử thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm hướng dẫn kĩ làm việc, tận tình bảo, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè người ln bên cạnh động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực khố luận Trong q trình thực tập, q trình làm báo cáo thực tập, khó tránh khỏi sai sót Đồng thời trình độ lí luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy, để báo cáo hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng Sinh viên Nguyễn Thị Thái Thùy năm 2019 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: lồi cam,qt có ý nghĩa thực tiễn Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007) Bảng 3: Diện tích, sản lượng cam Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017) Bảng 1: Kết thu thập mẫu 16 Bảng 2: Trình tự mồi ISSR sử dụng 17 Bảng 3: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 4: Danh mục loại hóa chất sử dụng đề tài 17 Bảng 1: Hệ số tương đồng di truyền cuả 32 mẫu cam nghiên cứu 37 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn vị:nghìn tấn) Hình 1: Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình PCR -ISSR 20 Hình 1: kết điện di kiểm tra DNA tổng số mẫu cam 22 Hình 2: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T1 23 Hình 3: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T2 24 Hình 4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T3 25 Hình 5: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPT-01 26 Hình 6: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPM-13 27 Hình 7: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-17 28 Hình 8: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPQ-18 29 Hình 9: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-08 30 Hình 10: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPB-18 31 Hình 11: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-04 32 Hình 12: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPC-08 33 Hình 13: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPO-04 34 Hình 14: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-16 35 Hình 15 sơ đồ mô tả quan hệ di truyền 32 mẫu cam nghiên cứu (coefficient: hệ số tương đồng di truyền) 38 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ cs Cộng CTAB Cetyl trimetyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FAO Food and Agriculture Organization ISSR Inter - simple sequence repeat NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SSR Simple sequence repeat TAE Tris - acetate - EDTA TE Tris – EDTA v LỜI CẢM ƠN I DANH MỤC BẢNG II DANH MỤC HÌNH III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IV PHẦN MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài .2 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan cam, quýt .3 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc 2.1.1.2 Phân loại .3 2.1.2 Giá trị cam, quýt 2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ cam quýt giới 2.2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ cam, quýt giới .6 2.2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt Việt Nam 2.3 Các kĩ thuật sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1 kỹ thuật RAPD 2.3.1.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD .8 2.3.2 Kĩ thuật ISSR 2.3.2.1 Giới thiệu kĩ thuật ISSR 2.3.3 Một số kĩ thuật khác 10 2.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới nước 11 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 vi 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 13 PHẦN 15 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .15 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu .16 3.2 Vật liệu, thiết bị hóa chất nghiên cứu 16 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu .16 3.2.2 Thiết bị nghiên cứu 17 3.2.3 Hóa chất .17 3.3 Nội dung nghiên cứu 18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA 18 3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh DNA tổng số 19 3.4.3 Phương pháp RAPD, ISSR 19 3.4.4 Phương pháp phân tích đa hình 20 3.5 Các phương pháp xử lý số liệu 21 PHẦN 22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ cam 22 4.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD, ISSR 22 4.2.1 Phân tích đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi 23 4.3 Xác định mối quan hệ di truyền giống camnghiên cứu dựa giản đồ phả hệ DNA 36 4.4 Xây dựng phát sinh chủng loài cam dựa giống nghiên cứu .38 PHẦN 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC I 47 Phần MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề Cây cam (citrus sinensis (L.) Osbeck) thuộc họ Prtaceae loại ăn lâu năm có hương vị thơm ngon giá trị dinh dưỡng cao nhiều người ưa chuộng Trong thành phần cam chưa nhiều vitamin như: vitamin A, B1, C, B9; chất xơ, chất khoáng vi lượng; chứa chất chống oxy hóa có tác dụng lớn chống khối u, chống viêm [2] Một số nghiên cứu Bùi Huy Đáp (1960)[4], Trần Thế Tục năm 1977 [10], Nguyễn Minh Châu (2009)[2] cho thấy, Việt Nam có nguồn gen có múi đa dạng với nhiều vùng trồng cam nổi tiếng truyền thống Tuyên Quang (cam sành Hàm Yên), Bắc Giang (cam sành Bố Hạ), Hà Giang (cam sành), Hòa Bình (cam Cao Phong), Nghệ An (cam Vinh), Hà Tĩnh (cam Bù), Yên Bái (cam canh), Cam Bố Hạ từ lâu trở thành thương hiệu nổi tiếng người tiêu dung nước biết đến từng trở thành kinh tế mũi nhọn tỉnh Bắc Giang Tuy nhiên, qua thời gian vùng cam Bố Hạ với giống cam q đặc sản dần bị thối hóa bị nhiều nguyên nhân, Nông trường cam Bố Hạ bị giải thể Nhóm nghiên cứu đề tài “Bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, Bắc Giang” điều tra thu thập số cam Bố Hạ khu vực trồng cam Bố Hạ trước Việc đánh giá đa hình di truyền, xây dựng phát sinh chủng loài cam Bố Hạ cần thiết nhằm cung cấp thông tin, ứng dụng công tác nghiên cứu bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen quý này, góp phần vào phát triển kinh tế, xã hội người dân tỉnh Bắc Giang Hiện nay, số phương pháp sử dụng phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền cam, quýt ISSR, SSR, RAPD… Đây sở khoa học thực tiễn để quan trọng để ứng dụng việc xác định mối quan hệ cam Bố Hạ với giống cam khác đề tài:”Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với giống cam khác thị phân tử” 2 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ, Bắc Giang với giống cam khác bằng thị phân tử DNA 1.2.2 Mục tiêu cụ thể -Tách chiết DNA tổng số từ cam, quýt đủ điều kiện để thực phản ứng RAPD, ISSR - Phân tích phân đoạn DNA giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD ISSR -Phân tích mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với giống cam thu thập dựa triên sơ đồ phả hệ DNA 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Kết nghiên cứu đề tài sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học việc ứng dụng thị phân tử xây dựng phát sinh chủng loài cam - Kết nghiên cứu đề tài sẽ góp phần bở sung thêm tài liệu khoa học, phục vụ cho công tác giảng dạy nghiên cứu cam nước ta 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với giống cam khác sở để thực biện pháp bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, khôi phục lại thương hiệu cam nởi tiếng góp phần nâng cao đời sống kinh tế, xã hội cho người dân tỉnh Bắc Giang 3 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cam, quýt 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc Cây cam biết đến lâu khoảng 2200 năm trước công nguyên Trung Quốc số người lại cho rằng cam có nguồn gốc từ dãy Himalayas (Ấn Độ) Cam trồng phở biến Ấn Độ, sau lan rộng phía đông, đến vùng Đông Nam Á Vào khoảng kỷ thứ trước công nguyên, cam đưa đến Châu Âu lan tới vùng Địa Trung Hải Sau đó, cam Columbus mang đến Châu Mỹ Những năm sau đó, người làm vườn Châu Mỹ Châu Âu đem cam đến Châu Úc Châu Phi Ngày cam trồng phổ biến nhiều nơi giới [9] Giống Cam (Citrus sinensis Osbeck) xác định có nguồn gốc miền Nam Trung Quốc, Ấn Độ miền nam Indonesia Sau mang đến trồng Châu Âu, Địa Trung Hải Châu Phi vào kỷ 13 đến kỷ XVII [1] Giống cam Washington Navel giới hay có tên gọi cam Navel Việt Nam cho dạng đột bến tự nhiên từ giống cam ngọt, giống phát Bhia Brail, lần trông Úc năm 1928, Florida (Mỹ) năm 1835, California năm 1970 nởi tiếng Washington D.C Sau trồng khắp vùng trồng cam, quýt giới[8] Theo số tài liệu nghiên cứu, cam, quýt có nguồn gốc miền Nam châu Á, lan trải cam, quýt giới gắn liền với lịch sử buôn bán đường biển chiến tranh trước 2.1.1.2 Phân loại Cam quýt thuộc: Giới Plantae Bộ Rutales Họ Rutaceae Chi Citrus Được phân chia làm 130 giống (genera) nằm họ phụ khác [9] Hiện có hai hệ thống phân loại nhiều người áp dụng Theo Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160-162 loài Tanaka quan sát, ghi chép tỉ mỉ đặc điểm hình thái giống biến dị phân chúng thành loài giống có tên khoa học bắt đầu bằng tên giống hay tên loài phát sinh chúng kết thúc bằng chữ ‘Horticuluture” [9] Swingle lại chia cam quýt làm 16 loài [9] Tuy nhiên, nhà khoa học phải sử dụng hệ thống phân loại Tanaka để gọi tên giống cam quýt bảng phân loại chi tiết tới từng giống Theo Tanaka có 10 nhóm quan trọng nhóm True citrus group, lồi trồng phở biến có ý nghĩa với người Danh sách nhóm quan trọng trình bày bảng 2.1[9] STT Tên loài Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt C.sisnensis Osbeck Sweets Orange Cam C.aurantium L Sour Orange Cam chua C.reticulata Blanco Mandarin Quýt C.limon Osbeck Lemon Chanh núm C.medica L Citron Chanh yên C.aurantifolia Swingle Lime Chanh vỏ mỏng C.trifolia L Trioliate Chanh đắng C.grandis L Shadock Bưởi C.paradishi L Pomelo Bưởi chùm 10 C.fortunenna kumquat Quất Bảng 1: lồi cam,qt có ý nghĩa thực tiễn 2.1.2 Giá trị cam, quýt Cam,quýt sản phẩm có giá trị nhiều người ưa chuộng, mang lại nguồn dinh dưỡng q cho người Khơng có ý nghĩa kinh tế, nguồn dinh dưỡng mà cam qt cịn có giá trị cao dược liệu Các sản phẩm cam, quýt cung cấp cho thị trường nước ngồi nước góp phần vào tăng trưởng kinh tế 5 Giá trị dinh dưỡng: Quả có múi có nhiều chất dinh dưỡng nên giá trị sử dụng cao Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Nước 88,8 g Vitamin E 0,18 mg Năng lượng 38 KJ Beta - caroten 71 µg Protein 0,9 g Alpha - caroten 11 µg Lipid 0,1 g Beta - cryptoxanthin 116 µg Glucid 8,3 g Lutein + Zeaxanthin 129 µg Celluloza 1,4 g Purin 19 mg Tro 0,5 g Lysin 43 mg Đường tổng số 9,35 g Methionin 12 mg Canxi 34 mg Tryptophan mg Sắt 0,4 mg Phenylalanin 30 mg Magie 10 mg Threonin 12 mg Mangan 0,52 mg Valin 31 mg Phospho 23 mg Leucin 22 mg Kali 108 mg Isoleucin 23 mg Natri mg Arginin 52 mg Kẽm 0,22 mg Histidin 12 mg Đồng 140 µg Cystin 10 mg Vitamin C 40 mg Tyrosin 17 mg Vitamin B1 0,08 mg Alanin 51 mg Vitamin B2 0,03 mg Acid aspartic 114 mg Vitamin PP 0,2 mg Acid glutamic 99 mg Vitamin B5 0,25 mg Glycin 83 mg 30 µg Prolin 46 mg 0,89 µg Serin 23 mg Folat Vitamin H Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007) Giá trị kinh tế: Cây ăn có múi loại lâu năm, nhanh cho thu hoạch Một số giống cho thu hoạch năm thứ Ở nước ta, suất trung bình cam, quýt thời kỳ t̉i đạt tới 16 tấn/ha Cây cam, quýt sống cho thu hoạch vòng 15-30 năm nên mang lại giá trị kinh tế cao [9] Giá trị dược liệu công nghiệp: Ở nhiều nước, người ta dùng loại thuộc cho Citrus làm thuốc chữa bệnh Thế kỷ XVI, người Trung Quốc người Ấn Độ dùng cam qt để phịng ngừa bệnh dịch hạch, chữa bệnh phởi bệnh chảy máu da Ở Mỹ, vào năm 30 kỷ XX, thầy thuốc dùng cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường Ở nước ta, nhân dân dùng ăn có múi để phịng chữa trị số bệnh từ lâu [9] Giá trị mơi trường sinh thái: Trong q trình sinh sống, loại cam, qt tiết oxy khơng khí làm khơng khí trở nên lành Trong chừng mực định chất bay từ cam, qt có tác dụng diệt số lồi vi khuẩn làm cho khơng khí trở nên hơn, mơi trường sống người tốt Cam, quýt trồng đồi đất bên cạnh việc cho cịn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh mặt đất sau trận mưa lớn, có ý nghĩa lớn việc làm giảm q trình xói mịn, rửa trơi đất Ở vùng trung du miền núi cam, quýt trồng vườn rừng, vườn đồi hệ thống VAC (vườn – ao – chuồng) VACR (vườn – ao – chuồng – rừng) phương thức canh tác áp dụng rộng rãi trang trại nông nghiệp thể nhiều ưu điểm việc thực nơng nghiệp bền vững [9] 2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ cam quýt giới 2.2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ cam, quýt giới Trong suốt kỷ qua, ngành sản xuất cam qt tồn giới khơng ngừng tăng nhanh mức tiêu thụ thị trường giới ngày cao trồng cam quýt chóng thu hoạch lãi suất ln cao Trên Thế giới, sản xuất có múi ngành lớn với diện tích 3,5 triệu sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân đầu người 15kg quả/năm Hiện có 75 nước trồng cam quýt với diện tích sản lượng tăng đáng kể [9] Hình 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn vị:nghìn tấn) Brazil nước sản xuất, xuất trái cam nước cam hàng đầu giới, sản xuất khoảng 30% sản lượng giới 94% sản lượng cam đất nước tập trung bang Sao Paulo Năm 2018/19 sản lượng cam Brazil 16 triệu tấn, tiêu thụ tươi khoảng triệu tiêu thụ khác khoảng 11 triệu Tiếp theo Trung Quốc, EU, ba quốc gia hàng đầu dự kiến sẽ tiếp tục mở rộng sản xuất với tốc độ chậm 2.2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt Việt Nam Nước ta nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sinh trưởng phát triển có múi Trong năm gần Chính phủ, địa phương, có nhiều quan tâm đến phát triển cam Chỉ tiêu Năm 2015 Năm2016 Năm 2017 Diện tích trồng (x1000 ha) 78,5 85,4 97,5 Diện tích cho sản lượng (x1000 ha) 58,4 48,4 64,7 Sản lượng (x 1000 tấn) 758,9 727,4 799,5 Bảng 3: Diện tích, sản lượng cam Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017) Theo Tổng cục Thống kê, năm 2017 sản lượng ăn tăng diện tích sản lượng Sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước; bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4%; quýt đạt 175,5 nghìn tấn, tăng 6,3% Tốc độ tỷ lệ % tăng trưởng thể rõ ưu xu hướng thị trường cam bưởi Tuy nhiên, tởng sản lượng có múi nước đạt thấp, khoảng 1.519.400 tấn; tính bình quân đầu người năm 2017 đạt trung bình khoảng 16kg (tính dân số khoảng 95 triệu người) [14] 2.3 Các kĩ thuật sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1 kỹ thuật RAPD 2.3.1.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD Kĩ thuật RAPD định nghĩa đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên Chỉ thị phân tử RAPD dựa kĩ thuật PCR với bắt cặp ngẫu nhiên đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước với mạch khn, nhân đoạn có trình tự bở sung với trình tự mồi Mồi sử dụng cho phản ứng RAPD mồi ngẫu nhiên có nhiệt độ kéo dài mồi thấp từ 34 - 370C Mặc dù mồi ngẫu nhiên phải đủ tiêu chí tỉ lệ G/C tối thiểu 40% khơng có trình tự base đầu xi ngược giống nhau[7] Kĩ thuật RAPD gồm bước - Tách chiết DNA tổng số - Thực phản ứng PCR nhân gene, điện di gel agarose hay gel polyacrylamide - Xác định tính đa dạng di truyền bằng phần mềm thơng dụng (NTSYSpc, phân tích nhóm UPGMA, lập sơ đồ cây) số liệu thu cho thấy gần gũi cách biệt di truyền mẫu nghiên cứu.Sản phẩm PCR - RAPD thường điện di gel agarose 1,5 - 2% hay điện di gel polyacrylamide 2.3.1.2 Những ưu điểm nhược điểm kĩ thuật RAPD so với kĩ thuật sinh học phân tử khác Ưu điểm: Về mặt kĩ thuật: Kĩ thuật RAPD dễ thực dễ thành công không cần thông tin genome đối tượng nghiên cứu ứng dụng cho lồi khác với mồi chung, thao tác đơn giản dễ thực hiện, chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh cao Thời gian thực nhanh, khả nhân cao [9] Về mặt kinh tế: Chi phí thực thấp Kĩ thuật RAPD thường sử dụng kết hợp với kĩ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử có độ tin cậy cao Nhược điểm: Với ưu điểm RAPD có hạn chế định sản phẩm PCR không ổn định lần nghiên cứu đặc điểm mồi ngẫu nhiên ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp, phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, kết không lặp lại tạo thị trội khơng phân biệt cá thể đồng hợp với cá thể dị hợp[7] 2.3.1.3 Ứng dụng kĩ thuật RAPD Các nghiên cứu cho thấy kĩ thuật RAPD phương pháp hiệu việc phân tích quần thể nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập đồ di truyền Kĩ thuật RAPD sử dụng để nhận biết phân loại giống khác nhau, xác định đa hình di truyền tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo, phân tích xác định mối quan hệ thân thuộc loài hay cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo phân loại Chỉ thị RAPD cịn cơng cụ hiệu việc tìm thị phân tử để phân biệt giống hay loài khác Sun cs (2003) sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình DNA 35 giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB (Fusarium hesd blight) phát thị RAPD liên quan đến tính kháng bệnh FHB[16] Orozco cs (1994) ứng dụng kĩ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền tiến hóa giống cà phê lai tạo từ loài bố, mẹ vùng sinh thái khác làm sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo lai có đặc tính quý[35] 2.3.2 Kĩ thuật ISSR 2.3.2.1 Giới thiệu kĩ thuật ISSR Kĩ thuật ISSR định nghĩa kĩ thuật dựa PCR dùng để nhân đoạn gene nằm hai vùng lặp lại giống hệt ngược chiều Kĩ thuật sử 10 dụng tiểu vệ tinh mồi phản ứng PCR với mồi cho nhiều locus đích để nhân chủ yếu chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác Các tiểu vệ tinh sử dụng mồi kĩ thuật ISSR 2, 3, 4, nucleotide Các mồi sử dụng khơng phải mồi neo mồi neo đầu 3’ 5’ với đến nucleotide thối hóa kéo đến chuỗi bên cạnh Kĩ thuật ISSR sử dụng rộng rãi nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gene, xác định trồng, phân tích nguồn gốc, xác định thay đởi genome đánh giá lai[7] Kỹ thuật ISSR có số lợi so với kỹ thuật khác phân biệt kiểu gen gần khơng cần thơng tin trình tự gen nghiên cứu Giống RAPD, ISSR kỹ thuật nhanh, dễ tiến hành Nó ưu việt RAPD cho nhiều thơng tin lặp lại thí nghiệm mồi dài Nhược điểm chủ yếu ISSR tạo thị trội dị đồng sản phẩm nhân di chuyển đồng thời [7] 2.3.3 Một số kĩ thuật khác Kĩ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kĩ thuật AFLP sử dụng để phát đa hình DNA Phân tích AFLP kết hợp RFLP PCR bằng việc gắn chuỗi nhận biết vào mồi hay gọi chuỗi tiếp hợp để nhân chọn lọc phân đoạn DNA cắt hạn chế Các cặp mồi thường tạo từ 50 đến 100 băng phân tích Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc tổ hợp mồi Kĩ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA từ nguồn gốc Kĩ thuật có số ưu điểm như: có độ tin cậy lặp lại cao; khơng cần thơng tin trình tự DNA thể nghiên cứu; cho nhiều thông tin có khả phân tích số lượng lớn locus đa hình với tở hợp mồi gel cho thấy locus đặc thù; số liệu lưu giữ sở liệu để so sánh Có thể dùng phân biệt cá thể gần nhau, lập đồ genome[16] Kĩ thuật đa hình tiểu vệ tinh nhân ngẫu nhiên (Randomly Amplified Microsatellite Polymorphism - RAMP) Kĩ thuật sử dụng mồi đánh dấu chứa đầu 5' neo đầu 3' lặp lại để nhân DNA genome với có mặt vắng mặt mồi RAPD Sản phẩm nhận 11 phân tách gel polyacrylamide biến tính Do mồi lặp lại đánh dấu nên có sản phẩm mồi neo xác định Nhiệt độ bắt cặp mồi neo thường cao mồi RAPD 10 - 15oC Vì vậy, nhiệt độ bắt mồi cao có mồi neo kéo dài hiệu Ở chu kì PCR với nhiệt độ bắt mồi thấp, hai mồi neo mồi RAPD kéo dài Do đó, chương trình PCR thiết lập cho có chuyển nhiệt độ bắt mồi cao xuống thấp trình phản ứng Hầu hết phân đoạn nhận với mồi RAMP sẽ biến có mồi RAPD mẫu băng khác nhận mồi RAMP mồi RAPD khác cho thấy mồi RAPD cạnh tranh với mồi RAMP chu kì nhiệt độ bắt mồi thấp RAMP sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền số loài lúa mạch[35]và đào[37] Kĩ thuật đa hình độ dài chuỗi đơn giản (Single Sequence Length Polymorphism - SSLP) Là kĩ thuật thị tạo chuỗi lặp lại với độ dài khác nằm hai gene Các chuỗi có độ dài khác số lượng trình tự lặp lại chuỗi khác q trình trao đởi chéo khơng cân giảm nucleotide trình chép Cả hai trình dẫn đến giảm tăng số lượng đơn vị lặp lại genome Sự khác độ dài SSLP sử dụng để đánh giá thay đổi di truyền cá thể loài Kĩ thuật SSLP tiến hành bằng cặp mồi đặc hiệu nhân chuỗi đơn giản nằm hai gene, sản phẩm PCR phân tách gel polyacrylamide [7] 2.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới nước 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu tính đa dạng di truyền chi Citrusbằng thị sinh học phân tử giới Abkenar cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử khoảng cách di truyền loài Citrus Nhật Đối tượng nghiên cứu gồm 31 lồi Citrus khác nhau, có lồi cam chua, loài “Yuzu” 21 loài họ hàng Sử dụng 27 mồi kết có 108 thị tạo thành, 76 thị đa hình, trung bình 2,8 thị mồi Cây phân loại cho thấy loại cam chua 12 khác với loài “Yuzu” họ hàng chúng Các loài “Yuzu” có mối quan hệ gần gũi nhau, nhiên đa dạng di trền loài cao, biểu lộ nguồn gốc khác chúng Trong nghiên cứu này, số mồi RAPD giúp phân biệt loại trồng gần gũi OPA-17, OPE-20 có “Kabosu” mà khơng có “Aka Kabosu”, mồi OPA-20, OPB-05 OPE-16 phân biệt có “Aka kabosu” mà khơng có “Kabosu” [15] Dehesdtani cs (2007) đánh giá đa dạng di truyền cam (Citrus sinensis Navel) trồng Mazandaran (Iran) bằng thị RAPD với 21 mồi ngẫu nhiên 52 mẫu có ba hình thái khác là: vỏ nhẵn, vỏ nhám nửa nhám Bốn mồi tạo băng đa hình có tính lặp lại Trong số băng tạo từ mồi có 70,13% băng đa hình, đa hình di truyền cao nhóm vỏ nhẵn vỏ nhám [20] C Martasari, Karsinah Reflinur (2012) nghiên cứu mô tả 20 giống Siam Indonesia từ tỉnh hình thái học dấu hiệu ISSR Kết cho thấy có khác hình dạng, màu sắc, độ dầy vỏ hương vị chín Sơ đồ tạo từ băng DNA cho thấy thối hóa 20 giống Siam chia thành bốn nhóm Nhóm A bao gồm giống (Lumajang, Banjar 2, Candi, Tulungagung, Mamuju, Tapin Ponorogo) Nhóm B có giống (Batola, Tlekung, Pontianak 2, Bangkinang Madu) Nhóm C hình thành giống Banyuwangi Nhóm cuối D có giống (Jember, Kintamani, Pati, Jambi, Banjar 2) Mỗi nhóm có giống hình thái [29] Năm dòng khác loài cam chua (Citrus aurantium L.) biểu khác biệt có ý nghĩa hình thái học xác định bằng thị phân tử phát triển từ kĩ thuật PCR ISSR RAPD De Pasquale cs (2006) phân tích mẫu nghiên cứu với 11 mồi ISSR mồi RAPD (OPH04, OPAT14, OPH15, OPM04, OPO14 OPN14)[22] Naz cs (2014) tiến hành nghiên cứu tính chất phân tử mối quan hệ di truyền giống Citrus khác Pakistan Mối quan hệ di truyền 17 giống cam, quýt thương mại quan trọng, bao gồm giống địa phương số giống lai đánh giá bằng kỹ thuật RAPD với 15 mồi lựa chọn số 25 mồi Tổng số 188 băng với 153 băng đa hình, trung bình 13 băng mồi Hệ ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI... di truyền cam, quýt ISSR, SSR, RAPD… Đây sở khoa học thực tiễn để quan trọng để ứng dụng việc xác định mối quan hệ cam Bố Hạ với giống cam khác đề tài:? ?Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ. .. truyền cam Bố Hạ với giống cam khác thị phân tử? ?? 2 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ, Bắc Giang với giống cam khác bằng thị phân tử DNA 1.2.2