Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây dây thìa canh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HỒNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R Br EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HOÀNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R Br EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Văn Ơn PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án cơng trình khoa học riêng tơi hướng dẫn PGS.TS Trần Văn Ơn PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu Các số liệu, kết trình bày Luận án trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Luận án NCS Hoàng Minh Châu LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành Luận án này, nhận nhiều giúp đỡ quý báu tập thể thầy cô giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Trước hết, xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu, hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Dược liệu, thầy cô Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội hỗ trợ nhiều q trình nghiên cứu hàn thành luận án Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: - GS Oh Wen Keun, Khoa Dược, trường ĐH Quốc Gia Seoul, Hàn Quốc - Thạc sỹ Phạm Hà Thanh Tùng, Giáo viên môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, Nghiên cứu sinh Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc - GS.TS Nguyễn Thanh Kỳ, nguyên Hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà Nội - PGS.TS Đỗ Thị Hà, phó trưởng khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu - PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, trưởng Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội Đã tạo điều kiện giúp đỡ,hướng dẫn đóng góp ý kiến q báu cho tơi hồn thiện Luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân gia đình, đến người đồng nghiệp công ty Nam Dược ủng hộ, gánh vác công việc tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu NCS Hoàng Minh Châu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN ALP ALAT ASAT ARN AUC COSY DMSO DMEM DTT DTC ĐTĐ EA EDTA : : : : : : : : : : : : : : ESI- MS : EtOH GAPDH : : GACP – WHO : G.albiflorum G alterfolium G.griffithii G hirsutum G inodorum G.latifolium G.sylvestre G.yunnansense G montanum Gla Glc GM GS : : : : : : : : : : : : : Acid deoxyribonucleic Alkaline Phosphatase Chỉ số men gan Chỉ số men gan Acid ribonucleic Diện tích dƣới đƣờng cong (Area under the curve) Phổ Cosy (Correlation Spectroscopy) Dimethyl sulfoxid Dulbecco's Modified Eagle's medium Dithiothreitol Dây thìa canh Gymnema sylvestre Đái tháo đƣờng Ethyl acetat Acid ethylene diamin tetraacetic Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) Ethanol Glyceraldehyd 3- phosphate dehydrogenase Thực hành trồng trọt, thu hái, chế biến tốt dƣợc liệu theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới Gymnema albiflorum Gymnema alterfolium Gymnema griffithii Gymnema hirsutum Gymnema inodorum Gymnema latifolium Gymnema sylvestre Gymnema yunnansense Gynema montanum Acid glucuronic Glucose Gymnemagenin Gymnema sylvestre GS3 GS4 G3PDH HBA1C HDL HE x 400 HFD : : : : : : : HMBC : HPLC : HRESI MS : HSQC : IR MeCN MeOH NFD : : : : NMR : NOESY NP LDL LOL LOD LOQ OA OVL PBS PTP1B p-NPP RP SD STZ TG TLC : : : : : : : : : : : : : : : : Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh Glycerol - 3- phosphate dehydrogenase Chỉ số gắn kết đƣờng hemoglobin hồng cầu High density lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao Nhuộm Hematoxylin – Eosin, độ phóng đại 400 lần Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) Sắc ký lỏng hiệu cao ( High- performance liquid chromatography) Phổ khối lƣợng phun mù điện tử phân giải cao (High resolution Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single Quantum Connectivity) Insulin receptor Acetonitril Methanol Chế độ ăn bình thƣờng (Nomal fat diet) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance Spectrometry) Phổ Noesy (Nuclear Overhause Effect Spectroscopy) Pha thƣờng (Normal phase) Low density lipoprotein- Lipoprotein tỷ trọng thấp Giới hạn tuyến tính ( Limit of Linear) Giới hạn phát ( Limit of Detection) Giới hạn định lƣợng ( Limit of Qualification) Acid oleanolic Chồng lấn (Overlap) Phosphate buffered saline Protein tyrosine phosphatases p-nitrophenyl phosphate Pha đảo (Reverse phase) Độ lệch chuẩn (Standard deviation) Streptozocin Triglycerid Sắc ký lớp mỏng TLTK UA Xyl H NMR 2-NBDG 2D-NMR 13 C -NMR : Tài liệu tham khảo : Acid ursolic : Xylose Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear : Magnetic Resonance Spectrometry) Glucose fluorescent 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol: 4- yl)Amino)-2-Deoxyglucose Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều (Two – dimension : Nuclear magnetic resonance Spectrometry) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 : Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh mục loài thuộc chi Gymnema R Br giới Bảng 1.2 Danh mục loài thuộc chi Gymnema R Br Việt Nam Bảng 1.3 Các hợp chất saponin có khung olean DTC G sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Bảng 1.4 Cấu trúc hóa học hợp chất alternosid phân lập từ G.alternifolium (Lour.) Merr Bảng 1.5 Cấu trúc hóa học số saponin khung olean Gymnema inodorum (Lour.) Decne Bảng 1.6 Một số hợp chất saponin khung dammaran phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Bảng 1.7 Tổng hợp số tác dụng sinh học số loài thuộc chi Gymnema R.Br Gymnema R.Br Bảng 1.8 Hàm lƣợng Gymnemagenin mẫu DTC thu theo tháng với cách làm khô khác 10 16 17 19 26 30 Bảng 2.1 Thời gian thu mẫu DTC G.sylvestre R Br ex Schult 33 Bảng 2.2 Chế độ ăn NFD HFD tính 100g thức ăn 40 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR chất 49 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR chất 53 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR chất 57 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR chất 59 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR chất 63 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR chất 6,7 67 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR chất 72 Bảng 3.8 Sự biến đổi nồng độ glucose máu chuột sau tuần ăn thức ăn giàu chất béo 77 Bảng 3.9 Vi thể tụy chuột sau tuần uống mẫu 80 Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế enzyme PTP1B chất 1-8 86 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR TCNH, aglycon chất gymnemagenol tham khảo 93 Bảng 3.12 Tính thích hợp của hệ thống 101 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp mẫu chất đối chiếu 101 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp mẫu thực 102 Bảng 3.15 Kết khảo sát khoảng tuyến tính phƣơng pháp 102 Bảng 3.16 Kết khảo sát tính phƣơng pháp 103 Bảng 3.17 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp 105 Bảng 3.18 Hàm lƣợng gymnemagenol mẫu dịch chiết thuỷ phân DTC theo tháng 105 Bảng 4.1 Danh sách chất phân lập từ Dây thìa canh 111 Bảng 4.2 Sinh khối DTC vùng trồng Nam Định thời điểm thu hoạch 120 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc khung olean hợp chất G sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.2 Cấu trúc nhóm hợp chất saponin khung olean Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.3 Cấu trúc hóa học chung alternosid phân lập từ lồi G.alternifolium (Lour.) Merr Hình 1.4 Cấu trúc nhóm hợp chất alternosid phân lập từ G Alternifolium (Lour.) Merr Hình 1.5 Cấu trúc số hợp chất saponin có khung olean phân lập từ Gymnema inodorum (Lour.) Decne 15 Hình 1.6 Cấu tạo gymnemasid VI gymnemasid VII 18 Hình 1.7 Cấu tạo chung gymnemasid I-V 18 Hình 1.8 Cấu trúc nhóm gymnemasid phân lập từ G sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.9 Sự thay đổi hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Re Ro rễ nhân sâm theo tuổi thu hái Hình 1.10 Hàm lƣợng gymnemic acid II tại phận Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 2.1 Lá hoa Dây thìa canh vùng trồng Hải Hậu, Nam Định Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu chuột nhắt ĐTĐ typ 16 17 19 30 31 34 41 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất, phân lập chất từ Dây thìa canh 47 Hình 3.2 Cấu trúc hóa học chất 49 Hình 3.3 Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) chất 51 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học chất 53 Hình 3.5 Các tƣơng tác HMBC (H C) COSY (H-H) chất 55 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học chất 56 Hình 3.7 Các tƣơng tác HMBC (H C) COSY (H-H) chất 56 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học chất 59 Tế bào gan thối hóa mỡ nhẹ TMTTTT Hình thái vi thể gan chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột số 29) 1 Tế bào gan thối hóa mỡ nhẹ TMTTTT Hình thái vi thể gan chuột lơ uống ND1TD 2,88 g dƣợc liệu khô/kg(chuột số 57) Tế bào gan thối hóa mỡ nhẹ TMTTTT Hình thái vi thể gan chuột lơ uống DTC 2,88 g dƣợc liệu khô/kg(chuột số 58) Tế bào gan thối hóa nhẹ TMTTTT Hình thái vi thể gan chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 62) Tế bào gan thối hóa nhẹ TMTTTT Hình thái vi thể gan chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 63) PHỤ LỤC 12 HÌNH ẢNH VI THỂ TỤY CHUỘT ( Nhuộm HE, độ phóng đại 400 lần) 1 Tế bào đảo tụy bình thường Đảo tụy kích thước bình thường Hình thái vi thể tụy chuột lô chứng (chuột số 2) Tế bào đảo tụy thối hóa, teo nhỏ Đảo tụy biến dạng giảm kích thước Hình thái vi thể tụy chuột lơ mơ hình (chuột số 18) 1 Tế bào đảo tụy thối hóa, teo nhỏ Đảo tụy biến dạng giảm kích thước Hình thái vi thể tụy chuột lơ mơ hình (chuột số 21) Tế bào đảo tụy thối hóa nhẹ Đảo tụy kích thước gần bình thường Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột số 27) 1 Tế bào đảo tụy thối hóa nhẹ Đảo tụy kích thước gần bình thường Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 80mg/kg (chuột số 29) Tế bào đảo tụy thối hóa nhẹ Đảo tụy giảm nhẹ kích thước Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 2,88 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 78) 1 Tế bào đảo tụy thối hóa nhẹ Đảo tụy gần bình thường Hình thái vi thể tụy chuột lơ uống DTC 2,88 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 79) Tế bào đảo tụy thối hóa nhẹ Đảo tụy gần bình thường Hình thái vi thể tụy chuột lơ uống DTC 8,64 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 71) Tế bào đảo tụy thối hóa nhẹ Đảo tụy giảm kích thước Hình thái vi thể tụy chuột lô uống DTC 8,64 g dƣợc liệu khô/kg (chuột số 74) PHỤ LỤC 13 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN n- HEXAN DÂY THÌA CANH Chất 1: β-amyrin-3-β-O-cinnamoyl Chất 2: Asperglaucid Chất 3: Acid benzoic PHỤ LỤC 14 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN NƢỚC DÂY THÌA CANH Chất 1: Isorhamnetin Chất 2: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl rhamnopyranosid Chất 3: Sarcostin (1→6)-β-D- PHỤ LỤC 15 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT THỦY PHÂN PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT DÂY THÌA CANH (2) (1) R (4) Chất 1: : β-amyrin-3-β-O-cinnamoyl Chất 2: Lupeol Chất 3: β-sitosterol Chất 4: Longispinogenin Chất 5: Daucosterol (3): H (5): Glc PHỤ LỤC 16 SO SÁNH PHỔ 13C CỦA CHẤT 1-5 STT 150Mhz 125Mhz 200Mhz 150Mhz 200Mhz 38,8; CH2 38,9; CH2 39,1; CH2 39,1; CH2 39,1; CH2 26,8; CH2 26,8; CH2 27,0; CH2 27,0; CH2 27,0; CH2 89,3; CH 89,4; CH 89,3; CH 89,3; CH 89,3; CH 39,8; C 39,8; C 39,8; C 39,9; C 39,9; C 55,8;CH 55,9; CH 56,0; CH 56,0; CH 56,0; CH 18,6; CH2 18,6; CH2 18,8; CH2 18,8; CH2 18,7; CH2 33,1; CH2 33,2; CH2 33,3; CH2 33,3; CH2 33,2; CH2 40,4; C 40,3; C 40,4; C 40,5; C 40,5; C 47,2; CH 47,3; CH 47,4; CH 47,4; CH 47,4; CH 10 37,0; C 37,0; C 37,1; C 37,1; C 37,1; C 11 24,1; CH2 24,1; CH2 24,2; CH2 24,1; CH2 24,1; CH2 12 123,5; CH 123,3; CH 123,4; CH 123,0; CH 123,0; CH 13 14 143,6; C 44,0; C 143,4; C 44,0; C 143,5; C 44,2; C 144,1; C 43,9; C 144,4; C 44,2; C 15 36,9; CH2 36,9; CH2 37,0; CH2 37,1; CH2 37,1; C 16 67,0; CH 67,9; CH 68,0; CH 67,2; CH 67,2; CH 17 41,4; C 43,9; C 44,1; C 41,8; C 41,8; C 18 43,6; CH 44,0; CH 44,0; CH 44,1; CH 44,2; CH 19 41,8; CH2 47,9; CH2 48,0; CH2 42,2; CH2 42,2; CH2 20 43,0; C 37,1; C 37,2; C 36,2; C 37,1; C 21 29,7;CH2 73,1; CH2 73,1; CH 29,7; CH2 29,3; CH2 22 25,4; CH2 35,1; CH2 35,3; CH2 25,8; CH2 26,0; CH2 23 17,2; CH3 17,2; CH3 17,2; CH3 28,5; CH3 28,5; CH3 24 28,3; CH3 28,3; CH3 28,5; CH3 17,3; CH3 17,2; CH3 25 15,9; CH3 15,9; CH3 16,0; CH3 16,0; CH3 16,0; CH3 26 17,1; CH3 17,2; CH3 17,3; CH3 17,2; CH3 17,3; CH3 27 27,3; CH3 27,3; CH3 27,4; CH3 27,4; CH3 27,4; CH3 28 68,2; CH2 68,5; CH2 68,6; CH2 69,1; CH2 69,2; CH2 29 181,6; COOH 30,3; CH3 30,4; CH3 82,1; CH2 74,3; CH2 30 20,6; CH3 18,2; CH3 18,3; CH3 20,4; CH3 20,4; CH3 1ʹ 107,0; CH 106,8; CH 107,6; CH 107,6; CH 107,6; CH 2ʹ 74,7; CH 74,7; CH 75,8; CH 75,9; CH 75,9; CH 3ʹ 87,8; CH 87,6; CH 78,5; CH 78,5; CH 78,4; CH 4ʹ 71,8; CH 71,8; CH 73,8; CH 73,8; CH 73,8; CH 5ʹ 77,6; CH 77,5; CH 78,1; CH 78,1; CH 78,5; CH 6ʹ 172,5, COOH 172,9; COOH 173,4; COOH 173,4; COOH 173,2; COOH 1ʹʹ 106,1; CH 105,9; CH 105,9; CH 2ʹʹ 75,9; CH 75,8; CH 75,6; CH 3ʹʹ 78,5; CH 78,4; CH 79,0; CH 4ʹʹ 72,0; CH 72,0; CH 72,1; CH 5ʹʹ 79,0; CH 78,9; CH 78,9; CH 6ʹʹ 62,7; CH2 62,7; CH2 63,2; CH2 PHỤ LỤC 17 SO SÁNH PHỔ 1H CỦA CHẤT 1-5 600Mhz 500Mhz 800Mhz 600Mhz 800Mhz 1,42; ovl; 0,89; t (7.5) 1.38, ovl; 0,83; ovl 1.38, ovl; 0,83; 1.40, ovl; ovl 0,85; t (7,5) 1.40, ovl; 0,85; t (7,5) 2,15; ovl; 1,81; ovl 2,25; ovl; 1,87; ovl 2,19; ovl; 1,82; 2,26; ovl; ovl 1,86; ovl 3,32; dd (4,0; 11,5) 3,33; dd (11,5; 4,0) 3,35, dd (11,5; 3,39; ovl 3,37; dd (4,0; 11,5) 0,74; d (11,7) 0,74; d (12,0) 0,75; d (12,0) 0,76; ovl 0,76; d (11,7) 1,48; ovl; 1,30; ovl 1,49; ovl; 1,30; ovl 1,50; ovl; 1,30; 1,47; ovl; ovl 1,31; ovl 1,47; ovl; 1,29; ovl 1,52; ovl; 1,33; ovl 1,52; ovl; 1,31; ovl 1,50; ovl; 1,34; 1,52; ovl; ovl 1,33; ovl 1,57; ovl 1,55; ovl 1,57; ovl 1,53; ovl 1,57; ovl 1,83; ovl; 1,56; ovl 1,81, ovl; 1,55; ovl 1,82; ovl; 1,57; 1,78; ovl 11 1,83; ovl; 1,57; ovl 12 5,31; br s 5,29; br s 5,28; br s 5,20; br s 5,29; br s 2,24; t (12,0); 1,74; dd (12,0; 4,9) 2,22; t (13.0); 1,74; dd (13,0; 4,0) 2,22; t (13,0); 2,22; t (13,0); 1,71; dd (13,0; 1,72; dd 2,25; ovl; 1,76; dd (13,0; 4,0) 4,0) (13,0; 4,0) 4,68; ovl 4,78, dd (13,0; 4,0) 2,52; ovl STT 15 4,0) ovl 4,81; dd (12,0; 4,9) 4,72; dd (11,3; 4,5) 4,71; dd (11,3; 16 2,61; dd (13,8; 3,9) 2,58, dd (14,0; 4,0) 2,57; dd (14,0; 2,43; dd 18 4,0) (13,7; 3,9) 2,70; t (13,8); 1,79, dd (13,8, 3,9) 2,04; t (14,0); 1,45; ovl 2,02; t (14,0); 2,08; ovl; 19 1,36; ovl 1,35; ovl 2,52; td (13,5; 2,6); 1,93; ovl 4,18; ovl 4,15; ovl 1,94; ovl; 21 4,5) 1,47; td (13,3; 2,17; ovl; 1,84; ovl 1,52; ovl; 1,33; ovl 2,24; ovl; 1,40; ovl 2,05; ovl; 1,48; dd (14,0; 3,5) STT 600Mhz 500Mhz 800Mhz 600Mhz 800Mhz 2,6) 22 2,88; td (13,5; 2,6) 1,99; td (13,5; 2,6) 3,26; dd (13,5; 4,0); 2,07; t (13,5) 3,28; dd (13,5; 2,80; td (14,0; 4,0) 2,08; t (13,5) 2,6); 1,89; td 2.92, td (14.0, 3.5)1.92, td (14.0, 3,5) (13.3, 2,6) 0,96; s 1,28; s 1,31; s 1,29; s 23 2,88; td (13,5; 2,6) 1,99; td (13,5; 2,6) 24 1,26; s 1,27; s 0,97; s 1,00; s 1,02; s 25 0,81; s 0,79; s 0,80; s 0,83; s 0,83; s 26 0,99; s 0,96; s 0,96; s 1,00; s 1,00; s 27 1,38; s 1,36; s 1,36; s 1,33; s 1,39; s 4,41; d (10,3); 3,75; d (10,3) 4,37; d (10,5); 3,75; d (10,5) 4,39; d (10,5); 4,41; d (10,3); 28 3,73; d (10,5) 3,70; d (10,3) 4,47; d (10,3); 3,73; d (10,3) 1,25; s 1,24; s 3,93 d (8,3); 29 3,60; 2H, ovl 3,42; d (8,3) 30 1,58; s 1,25; s 1,24; s 1,21; s 1,22; s 1ʹ 4,98; d (7,5) 4,95; d (7,5) 5,00; d (7,7) 5,03; d (7,8) 5,03; d (7,7) 2ʹ 4,13; ovl 4,13; ovl 4,12; ovl 4,15; ovl 4,15; t (7,7) 3ʹ 4,35; t (7,5) 4,35; ovl 4,32; t (7,7) 4,35; t (7,8) 4,35; t (7,7) 4ʹ 4,51; ovl 4,52; ovl 4,58; t (7.7) 4,61; ovl 4,61; t (7.7) 5ʹ 4,63; d (9,5) 4,60; d (9.5) 4,65; d (7,7) 4,69; ovl 4,69; d (7,7) 1ʹʹ 5,37; d (8,0) 5,36; d (7,5) 4,83; d (7,8) 2ʹʹ 4,05; t (8,0) 4,05; t (7,5) 4,06; t (7,8) 3ʹʹ 4,23; t (8,0) 4,22; t (7,5) 4,24; ovl 4ʹʹ 4,17; ovl 4,13; ovl 4,24; ovl 5ʹʹ 4,02; ovl; 4,51; ovl 4,01; ovl; 4,52; ovl 3,98; t (7,8) 6ʹʹ 4,29; dd (10,9; 5,1) 4,27; dd (10,9; 5,1) 4,56; ovl 4,43; ovl