Keratinase và ứng dụng trong công nghiệp

TIỂU LUẬN SẢN XUẤT KERATINASE VÀ ỨNG DỤNG MỤC LỤC CHƯƠNG 1: KERATINASE VÀ ỨNG DỤNG 1.1 Đặc tính Keratinase .4 1.2 Nguồn gốc Keratinase 1.3 Ứng dụng sinh học công nghiệp keratinase .5 1.3.1 Xử lý làm da sống - ngành da 1.3.2 Chất tẩy rửa ngành dệt may 1.3.3 Khử nhiễm prion keratinase .8 1.3.4 Ứng dụng y tế dược phẩm .8 1.3.5 Chuyển hóa chất thải sừng hóa thành lượng sinh học sản phẩm giá trị gia tăng 1.3.6 Sản xuất bột lông vũ cho ngành thức ăn chăn nuôi, sản xuất lượng sinh học nông nghiệp 1.3.7 Các ứng dụng khác 10 CHƯƠNG 2: SẢN XUẤT KERATINASE 11 2.1 Sản xuất keratinase 11 2.2 Chế phẩm keratinase 13 2.3 Tinh keratinase 14 2.3.1 Kết tủa axeton 15 2.3.2 Kết tủa amoni sulfat 15 2.3.3 Sắc ký trao đổi ion .15 2.3.4 Lọc gel .16 2.3.5 Xác định nồng độ protein hòa tan .16 2.3.6 Độ tinh khiết Enzyme 17 2.4 Đặc điểm sinh hóa keratinase 17 2.4.1 Nhiệt độ pH tối ưu 17 2.4.2 pH độ ổn định nhiệt 18 2.4.3 Ảnh hưởng ion kim loại, chất ức chế chất tẩy rửa 18 Tài Liệu Tham Khảo 20 CHƯƠNG 1: KERATINASE VÀ ỨNG DỤNG 1.1 Đặc tính Keratinase Keratinase (EC 3.4.21 / 24 / 99.11) thường protease serine metalloprotease thủy phân keratins Chúng khác biệt với protease thông thường chúng có đặc tính chất rộng nhiều loại protein kháng proteinase K [1] Keratinase enzym mạnh mẽ với đặc tính sinh hóa đa dạng Hầu hết chúng đơn phân, có mơ tả số enzym đa phân tử Khối lượng phân tử keratinase vi khuẩn nằm khoảng từ 18 (enzym SK1-02 từ Streptomyces albidoflavus) đến 200 kDa (enzym từ Kocuria rosea Fervidobacterium islandicum), enzym nấm gây bệnh lên tới 440 kDa (ví dụ keratinase II Trichophyton mentagrophytes ) Khối lượng phân tử cao thường đặc trưng metalloprotease có nguồn gốc từ vi sinh vật ưa nhiệt [2] 1.2 Nguồn gốc Keratinase Keratinase báo cáo từ quần thể vi sinh vật đa dạng vi khuẩn, xạ khuẩn nấm Trong tất nguồn keratinase, nguồn vi khuẩn có số lượng lớn nhiều so với nấm xạ khuẩn Các loài vi khuẩn thuộc Bacillus, đặc biệt B licheniformis Bacillus subtilis, vi sinh vật tạo sừng hiệu Tất chế phẩm thương mại có dựa KerA từ B licheniformis Tuy nhiên, keratinase báo cáo từ chủng vi khuẩn khác, Pseudomonas, Chryseobacterium, Lysobacter, Nesterenkonia, Kocuria, Microbacterium, Stenotrophomonas, Serratia, Meiothermus Ngoài ra, số loài thuộc chi Fervidobacterium, Clostridium, Thermoanaerobacter báo cáo Xạ khuẩn từ chi Streptomyces Thermoactinomyces Actinomadura keratinilytica báo cáo nhà sản xuất keratinase tiềm [1] Lồi ưa nhiệt có đặc điểm sản xuất keratinase vượt trội so với loài ưa nhiệt tốc độ tăng trưởng cao hơn, trình phản ứng đẩy nhanh, giảm nguy nhiễm bẩn độ ổn định enzym cao Ở nấm, số lượng lớn chủng sản xuất keratinase báo cáo, Trichophyton Microsporum Nấm da gây nhiễm trùng bề ngồi da, tóc móng tay khả sử dụng chất sừng chúng Tuy nhiên, người ta ý nhiều đến chủng, Aspergillus, Doratomyces, Myceliophthora thermophila, Myrothecium, Paecilomyces để sản xuất keratinase Các vi sinh vật sản xuất keratinase phân lập từ điều kiện môi trường sinh thái khác bao gồm mơi trường hiếu khí kỵ khí, Chất thải gia cầm, đất Nam Cực, môi trường Amazonia, đất rhizospheric, suối nước nóng, bùn solfataric [1] Các đặc tính sinh hóa sinh lý keratinase khác vi sinh vật phân lập từ điều kiện mơi trường khác Do đó, đa dạng vi sinh vật tương quan trực tiếp với việc chiết xuất keratinase với phạm vi pH rộng độ ổn định nhiệt [1] 1.3 Ứng dụng sinh học công nghiệp keratinase Phân bón Phụ gia thức ăn chăn ni Sản xuất khí sinh học Sử lý chất thải sừng Tẩy trắng ngọc trai Sử dụng thương mại Ứng dụng khác Chế biến tổ chim Ngành dệt may Ứng dụng keratinase Ngành Da Làm da sống động vật Khử nhiễm prion Chất tẩy rửa Ứng dụng y học mỹ phẩm Loại bỏ mô sẹo Chuyển máy gia tốc Điều trị mụn trứng cá Sản phẩm vệ sinh cá nhân Loại bỏ ráy tai Hình Các ứng dụng công nghệ sinh học công nghiệp keratinase [2] Enzyme vi sinh vật chiếm thị phần đáng kể chất xúc tác công nghiệp, hydrolase chiếm khoảng 65% thị trường Trong số đó, protease nhóm enzym quan trọng phạm vi ứng dụng rộng rãi chúng Ngồi tính đặc hiệu chất rộng, keratinase bật so với protease khác độ bền chung, có lợi nhiều ứng dụng cơng nghiệp Hình cho thấy ứng dụng (tiềm năng) khác keratinase, sản phẩm thương mại phổ biến có thị trường trình bày Bảng Bảng 1: Các sản phẩm keratinase bán sẵn thị trường [2] Ứng dụng Mô tả sản phẩm Sản phẩm thương mại Lấy ráy tai khỏi ống tai ngồi thành cơng, an toàn Loại bỏ ráy tai Zymox hiệu Keratinase có mặt thay tự nhiên cho việc sử dụng Keratoclean® Hydra PB, Chai loại bỏ mơ sẹo axit để loại bỏ mô sẹo chai chân PURE 100 Keratinase Mụn trứng cá tắc nghẽn tuyến bã nhờn với Keratoclean® Sensitive Điều trị mụn trứng cá diện lượng lớn keratin, PB, Keratopeel® PB sử dụng keratinase để điều trị thành công Sử dụng thương mại Sản phẩm Keratinase cải thiện tỷ lệ thức ăn có tác Versazyme® (thức ăn gia cầm) động tích cực đến khối lượng thể gà Sản phẩm Enzyme làm giảm chi phí nấu nướng Sử dụng thương mại xử lý nhiệt độ lơng, làm tăng tỷ lệ tiêu hóa Valkerase® (thức ăn gia cầm) giá trị dinh dưỡng thức ăn Khử nhiễm prion hiệu cho dụng cụ y tế Nó Khử nhiễm prion chứa protease thiết kế để tăng hoạt tính, độ đặc Prionzyme hiệu rộng tính ổn định nhiệt Sản phẩm keratinase cho điều chỉnh nồng độ keratin lỗ chân lơng, giúp loại bỏ mụn Y sinh, dược phẩm nước, da dày sừng, sử dụng để điều PURE100 Keratinase mỹ phẩm trị bệnh da liễu móng, sẹo tái tạo biểu mô Làm đường ống bể chứa enzym khác nhau, bao gồm keratinase Làm đường ống bể chứa enzym Đại lý làm Bioguard Plus khác nhau, bao gồm keratinase 1.3.1 Xử lý làm da sống - ngành da Ngành công nghiệp da ngành công nghiệp lâu đời nhất, phát triển nhanh giới đóng vai trị quan trọng kinh tế ngày Đồng thời, coi nguồn nhiễm lớn giới, chế biến da bao gồm việc sử dụng chất độc hại, gây tác động nguy hiểm cho môi trường công nhân nhà máy công nghiệp [2] Việc xử lý da sống bao gồm loạt quy trình, việc xử lý da trước coi nguồn nhiễm Các hóa chất natri sunfua, vôi chất thải rắn, phát sinh xử lý da sơ bộ, nguyên nhân làm tăng nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), nhu cầu oxy hóa học (COD) tổng lượng chất rắn hòa tan (TDS) nước thải sản xuất nhà máy Sử dụng enzyme giải pháp thay xanh giúp giảm ô nhiễm môi trường cải thiện da Các enzym phân giải protein sử dụng nhiều để làm mềm da sống nhằm cải thiện độ mềm dẻo da chuẩn bị cho trình làm da Các chế phẩm enzym tiêu sừng khác để loại bỏ lông động vật mà không làm tổn thương da (collagen) sử dụng Chúng phân hủy cách có chọn lọc mơ sừng mềm nang lơng, kéo lông nguyên vẹn mà không ảnh hưởng đến độ bền kéo da Các enzym, chủ yếu có nguồn gốc từ Bacillus sp, Pseudomonas stutzeri, Caldicoprobacter algeriensis, Acinetobacter sp., Paenibacillus woosongensis, Vibrio metschnikovii loại nấm khác từ loài Aspergillus tamarii, Penicillium chrysogenum Trichoderma harzianum báo cáo sử dụng ngành da Việc ứng dụng keratinase ngành da giúp cải thiện chất lượng sản phẩm cuối giảm ô nhiễm mơi trường hóa chất, mang lại mơi trường làm việc an toàn [2] 1.3.2 Chất tẩy rửa ngành dệt may Protease kiềm đại diện cho 89% enzym phân giải protein sử dụng cơng nghiệp chất tẩy rửa Các enzym thích hợp để sử dụng chất tẩy rửa cần phải tương thích với thành phần khác chất giặt rửa, đồng thời thể hoạt tính độ ổn định giá trị nhiệt độ pH cao Keratinase kiềm từ Paenibacillus woosongensis TKB2 enzym có tiềm ứng dụng ngành giặt để loại bỏ vết bẩn tổng hợp mà không ảnh hưởng đến kết cấu vải, sợi độ bền quần áo [2] Ngành công nghiệp dệt sử dụng keratinase để xử lý sợi len Các lựa chọn thay an tồn mặt mơi trường cho hóa chất sử dụng trình chế phẩm enzyme, thường bao gồm protease lipase Vai trò proteases loại bỏ lớp sợi thô bên ngồi, làm giảm cảm giác thơ ráp len Cần phải định lượng enzym cách cẩn thận, số protease xâm nhập sâu vào sợi, gây hư hỏng, khối lượng độ bền kéo chúng Đây lý khơng có quy trình hồn tồn dựa enzyme Ở mức độ đó, xâm nhập bị hạn chế cách tăng khối lượng phân tử protease nhằm mục đích ứng dụng cách liên kết chéo hóa học, gắn polyme tổng hợp, v.v Một giải pháp thay tốt sử dụng keratinase cụ thể hoạt động có chọn lọc lớp sừng len mà khơng có tác dụng phụ lên phần sợi khác [2] 1.3.3 Khử nhiễm prion keratinase Prion protein nhỏ gọn mạnh gây bệnh thoái hóa thần kinh seri ous, chẳng hạn TSEs (bệnh não thể xốp truyền nhiễm) Do gia tăng số lượng truyền prion theo chiều ngang từ động vật sang người (bao gồm lây truyền qua đường sắt qua dụng cụ y tế bị ô nhiễm), phương pháp hiệu để khử nhiễm vật chất bị nhiễm prion vơ quan trọng Vì phương pháp liên tục dựa q trình tích cực đòi hỏi nhiều lượng, phân hủy prion enzym cách tiếp cận đầy hứa hẹn để phá hủy protein có độ bền cao có cấu trúc tương tự keratin Cho đến có báo cáo việc có hai keratinase sử dụng cho mục đích khử nhiễm prion - phân lập từ B licheniformis PWD-1 từ Streptomyces sp Nev ertheless, việc xử lý enzym, cần phải xử lý thêm phần vật liệu bị nhiễm thuốc thử kiềm, chất tẩy rửa nhiệt độ cao [2] 1.3.4 Ứng dụng y tế dược phẩm Keratinase sử dụng ngành công nghiệp mỹ phẩm để điều trị mụn trứng cá, vết chai, loại bỏ da sừng khô, điều trị bệnh vẩy nến, v.v Các ứng dụng keratinase ngành dược phẩm chủ yếu liên quan đến việc đưa thuốc diệt nấm vào bề mặt móng sừng Các rối loạn móng, chủ yếu liên quan đến nấm phận, từ tương đối vơ hại (sắc tố), đến tình trạng đau đớn chứng loạn dưỡng móng Điều trị nhiễm nấm móng tay (nấm móng) cơng việc khó khăn theo truyền thống bao gồm việc uống thuốc chống nấm thời gian dài tiêm corticosteroid lặp lặp lại hàng tháng, gây nhiều tác dụng phụ, chẳng hạn phát ban tổn thương gan Một hình thức điều trị thay bơi thuốc chống co rút trực tiếp lên vùng bị bỏng Hạn chế phương pháp khả khơng thấm bề mặt móng tay, ảnh hưởng đến thẩm thấu thuốc hiệu điều trị Một loạt phương pháp học (mài mòn tách móng), vật lý (khắc, điều trị laser, hydrat hóa đóng móng nhanh) phương pháp hóa học (tác nhân tiêu sừng, chẳng hạn urê, axit thioglycolic, axit salicylic, N-acetyl cysteine, mercaptoethanol) sử dụng để cải thiện việc chuyển thuốc đến vị trí tác dụng Tuy nhiên, hóa chất có hiệu nồng độ cao có mùi hăng Mặt khác, keratinase hiệu việc nới lỏng mảng móng có nồng độ thấp, điều lần chứng minh keratinase từ Paecilomyces marquandii [2] 1.3.5 Chuyển hóa chất thải sừng hóa thành lượng sinh học sản phẩm giá trị gia tăng Theo quy định (EC) 1774/2002 quốc hội Châu Âu, chất thải sừng phân loại loại thứ ba sản phẩm động vật, có nghĩa là: (i) lấy từ vỏ động vật, (ii) không dùng cho người , (iii) không truyền bệnh cho người động vật Một lượng lớn chất thải nhà máy chế biến động vật tạo sử dụng làm chất cho lượng sinh học sản phẩm giá trị gia tăng xử lý thích hợp trước sử dụng Xử lý truyền thống chất thải sừng hóa bao gồm sử dụng phương pháp thủy phân có tính kiềm axit, xử lý áp suất cao nhiệt độ cao (lên đến 150 ° C) Mặc dù có ưu điểm nói trên, phương pháp tốn kém, tiêu tốn lượng lớn lượng dẫn đến số axit amin thiết yếu quan trọng cho trình sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng lượng sinh học sau [2] 1.3.6 Sản xuất bột lông vũ cho ngành thức ăn chăn nuôi, sản xuất lượng sinh học nông nghiệp Chất thải ngành chăn ni gia cầm lông, chiếm 7– 10% khối lượng gà Trong năm 2012, khoảng 8,5 tỷ lông gia cầm tạo tồn giới Lơng bao gồm khoảng 90% keratin (phần lớn β-keratin) chứa lượng lớn serine, axit glutamic, proline lượng nhỏ methionine, histidine lysine Vài triệu lông vũ năm phụ phẩm phế thải lớn ngành chăn nuôi gia cầm nguồn ô nhiễm môi trường quan trọng Một lựa chọn để định giá chất thải lông vũ liên quan đến việc chuyển đổi chúng thành bột lơng vũ, sử dụng làm nguyên liệu thô sản xuất dầu diesel sinh học, thành phần bioplastics làm thức ăn chăn ni Q trình chế biến truyền thống cá chết bao gồm nhiệt độ áp suất cao, nguyên nhân gây chi phí cao phá hủy số axit amino thiết yếu (methionine, lysine tryptophan) Do đó, sản phẩm cuối tiêu hóa có giá trị dinh dưỡng thay đổi Những thiếu sót tránh cách thủy phân enzym keratinase lông vũ, dẫn đến sản xuất axit amin chất lượng cao sử dụng thức ăn gia cầm, lợn, động vật nhai lại cá [2] Lơng vũ thủy phân chuyển đổi thành gen sinh học, sử dụng làm phân bón cho nơng nghiệp hữu cho phép giải phóng nitơ chậm, cải thiện phát triển thực vật, thúc đẩy hoạt động vi sinh vật đất, cấu trúc đất tăng khả giữ nước [2] 1.3.7 Các ứng dụng khác Keratinase sử dụng nhiều ứng dụng khác nhau, bao gồm để phân hủy sinh học để ủ chất thải giàu keratin, để sửa đổi cấu trúc sợi len lụa, sản phẩm mỹ phẩm khác chế biến yến sào ăn Một ứng dụng độc đáo tẩy trắng ngọc trai Tại thời điểm hình thành hạt, tạp chất hữu tế bào tự do, tế bào chất nhầy mơ hoại tử có lớp gắn kết Do đó, điều cần thiết phải cải thiện chất lượng hạt trước bán Ngọc trai xử lý theo cách truyền thống chất tẩy trắng nhẹ nhàng (hydrogen perox Ide) làm sáng mềm, chúng bù lại màu sắc chúng ảnh hưởng đến không màu Zhang cộng báo cáo sử dụng keratinase giải pháp thay cho quy trình tẩy trắng kiểu tra [2] 10 CHƯƠNG 2: SẢN XUẤT KERATINASE 2.1 Sản xuất keratinase Chiến lược chung sản xuất keratinase [1] Mặc dù sở hữu tiềm công nghệ sinh học to lớn, hạn chế lớn việc thương mại hóa keratinase mức sản xuất thấp chúng Keratinase thường sản xuất dạng enzym cảm ứng ngoại bào Chúng tiết thành phần mà khơng có keratins Một số vi khuẩn nấm tạo enzym tiêu sừng nội bào [1] Trong hầu hết trường hợp, keratin dạng lông gà, bột lơng vũ, bột keratin, lơng cừu, bột sừng, tóc lớp sừng đóng vai trị chất cảm ứng sản xuất keratin Tuy nhiên, chất không tạo sừng, viz., Bột đậu nành, bột đậu nành, bột vỏ tôm, báo cáo hoạt động chất cảm ứng sản xuất keratinase Nói chung, sản xuất keratinase kèm với suy thoái chất keratin sau Tuy nhiên, động học q trình sản xuất keratinase q trình thối hóa keratin khơng trùng khớp với Do đó, q trình phân hủy sừng khơng thể đóng vai trị điểm đánh dấu cho trình sản xuất keratinase ngược lại Điều keratinase tạo giai đoạn cuối theo cấp số nhân giai đoạn tĩnh phát triển vi sinh vật, phân hủy 11 keratinase diễn sau Nguyên nhân protease khác tiết với keratinase, tự phân ức chế tổng hợp enzym [1] Điều kiện lên men chìm lý tưởng để sản xuất keratinase, ngoại trừ số vi khuẩn ưa nhiệt nấm, q trình lên men chìm ưu tiên cho hoạt động phân giải sừng tối đa Quá trình lên men trạng thái rắn (SSF) sử dụng nhiều gần để thu enzym phân giải sừng SSF trình cơng nghệ sinh học, phản ứng lên men thực chất rắn với thơng số kiểm sốt nhiệt độ, độ ẩm (độ ẩm) chất Độ ẩm điều chỉnh tối ưu hóa hoạt động keratinase lồi vi sinh vật thông qua phát triển tối ưu dòng chảy trao đổi chất [1] Việc xử lý thông số vật lý dinh dưỡng cần thiết để tối đa hóa phát triển vi sinh vật đó, sản xuất keratinase Rất khó so sánh suất keratinase xét nghiệm enzyme, phương pháp sản xuất môi trường tăng trưởng khác Sự lựa chọn nguồn nitơ cacbon có ảnh hưởng lớn đến sản lượng keratinase Các chất nitơ phức tạp, viz., Bột đậu nành, bột đậu nành, chiết xuất nấm men, casein, báo cáo để tăng cường sản xuất keratinase Mặt khác, nguồn nitơ vô muối amoni nitrat ức chế sản xuất keratinase Việc sản xuất keratinase vi sinh vật bị ức chế đường đơn, viz., Glucose, ức chế dị hóa Sự kìm hãm kéo dài q trình phân hủy sừng trình sinh tổng hợp keratinase bị ức chế nguồn cacbon đồng hóa sử dụng hết Các chế kiểm sốt khác q trình sản xuất keratinase hoạt động đồng thời cấp độ phiên mã, nhằm mục đích sử dụng tốt nguồn có sẵn cho dinh dưỡng vi sinh vật [1] 12 Keratinase từ số nguồn vi sinh vật chọn [1] 2.2 Chế phẩm keratinase Versazyme, Valkerase, Prionzyme PURE100 sản phẩm keratinase thương mại có sẵn thị trường Tất chế phẩm dựa keratinase từ B licheniformis PWD-1 Versazyme sản phẩm keratinase thương mại tiếp thị chất phụ gia thức ăn cho gia cầm lợn, BioResource International, Inc (BRI) Durham, Bắc Carolina, vào năm 2005 Nó cải thiện khả tiêu hóa protein 3,5-10% tạo điều kiện giảm hàm lượng protein phần thức ăn giảm 1-2%, làm giảm chi phí thức ăn cho nông dân giảm tác động môi trường chất thải chăn nuôi BRI chọn Novus International, công ty dinh dưỡng sức khỏe động vật, làm đối tác phân phối tồn cầu vào năm 2008 [1] Valkerase loại enzyme độc quyền BRI phát triển vào năm 2006 để cải thiện q trình xử lý lơng vũ chất lượng bột lông vũ nguồn protein 13 peptide tiêu hóa bền vững Việc sử dụng Valkerase làm giảm việc sử dụng lượng chi phí sản xuất cách hạ nhiệt độ nấu rút ngắn khoảng thời gian nấu, giảm hình thành chất kháng dinh dưỡng lanthionine, cải thiện khả tiêu hóa bột lơng vũ Kể từ năm 2007, BRI tăng gấp đôi doanh thu hàng năm sản phẩm họ, viz., Versazyme Valkerase, thâm nhập vào thị trường toàn cầu Brazil, Ấn Độ Trung Quốc Trong báo cáo gần đây, BRI tuyên bố Versazyme Valkerase có doanh thu 12,7 triệu la Mỹ năm 2011, đạt tốc độ tăng trưởng doanh thu 938% từ năm 2008 đến năm 2011 [1] Genencor International, với Cơ quan Bảo vệ Sức khỏe Vương quốc Anh, vào năm 2006 cho đời loại enzyme đầu tiên, Prionzyme, thiết kế đặc biệt chất khử trùng prion cho thiết bị y tế Prionzyme protease thiết kế để tăng hoạt tính, độ đặc hiệu rộng khả điều chỉnh nhiệt để hoạt động điều kiện khác Nó sử dụng để khử trùng dụng cụ y tế sử dụng phẫu thuật xâm lấn, chẳng hạn thủ thuật liên quan đến hệ thần kinh trung ương, mắt amidan, để giảm lây lan bệnh Creutzfeldte-Jakob biến thể [1] PURE100 keratinase chế phẩm thương mại khác, keratinase tái tổ hợp Zurko Bioresearch tiếp thị với Proteos Biotech vào năm 2008 cho ứng dụng y sinh, dược phẩm mỹ phẩm Nó khẳng định có ứng dụng việc loại bỏ keratin bệnh vẩy nến mụn trứng cá, loại bỏ mô sẹo người thối hóa da sừng, làm rụng lơng, chuẩn bị vắc xin cho liệu pháp điều trị bệnh da liễu, tăng cường dược phẩm điều trị móng điều trị sẹo, tái tạo biểu mô [1] 2.3 Tinh keratinase Tinh enzyme bước cần thiết để tạo enzyme phù hợp cho ứng dụng cơng nghiệp khác Nó làm tăng hiệu enzym Keratinase làm nhiều phương pháp khác Chiến lược đơn giản liên quan đến việc tinh enzyme cách kết tủa, sau sắc ký cột [1] Keratinase thơ thường sản xuất trình lên men chìm cách cấy vi khuẩn nấm khiết vào môi trường sản xuất với muối vi lượng bột lông vũ (1%) nguồn cacbon nitơ với chiết xuất nấm men (0,01%), NaCl ( 0,05%), KH2PO4 (0,03%), K2HPO4 (0,04%) MgCl2 (0,01%) [70,91,92] Các mẫu cấy 14 ủ 30-37oC 3-5 ngày, sản phẩm ly tâm phần phía sử dụng làm enzym thơ, tinh thêm [1] 2.3.1 Kết tủa axeton Việc tinh chế phần keratinaza đạt cách kết tủa axeton [1]:  Phần phía có chứa keratinase kết tủa với axeton làm lạnh trước (30-80%)  Axeton thêm vào phần phía theo tỷ lệ 3: ủ 60 phút 20 oC  Hỗn hợp ly tâm tốc độ 10.000 vòng / phút 10 phút  Phần phía loại bỏ cẩn thận viên hòa tan dung dịch đệm Tris-axetat 50 mM, pH=7 Trọng lượng phân tử keratinase tinh chế phần xác định cách chạy điện di gel natri dodecyl sulfatepolyacrylamide (SDS-PAGE) Kết tủa axeton sử dụng để tinh keratinase từ Aspergillus oryzae NRRL447, cho thấy hoạt tính cụ thể 258,8 U / mg với suất gấp 2,3 lần 52,5% Tương tự, keratinase từ B licheniformis FK 14 sau tinh chế cho thấy hoạt tính cụ thể 218 U / mg với độ tinh khiết gấp 86 lần độ thu hồi 25% Một nhược điểm kết tủa axeton protein bị biến tính viên khó phân giải [1] 2.3.2 Kết tủa amoni sulfat Keratinase tinh chế cách kết tủa amoni sulfat Các keratinase tinh khiết báo cáo có khối lượng phân tử khoảng 27-200 kDa từ nguồn vi sinh vật nấm khác [1] Enzyme phần phía kết tủa cách thêm amoni sulfat rắn với dải bão hòa khác nhau: 0-20, 20-40, 40-60, 60-80 80-100% Kết tủa thu cách ly tâm 8000g 30 phút oC Kết tủa enzyme hòa tan dung dịch đệm Tris-HCl tích tối thiểu 50 mM, pH 7,5-8 Dung dịch enzyme sau khử muối cách thẩm tách với chất đệm [1] 2.3.3 Sắc ký trao đổi ion Dung dịch enzym thẩm tách thu sau kết tủa amoni sulfat đưa vào cột dietylaminoetyl (DEAE)-Sepharose hiệu chuẩn trước với dung dịch đệm Tris-HCl 15 50 mM, pH 7,5-8,0 Protein không liên kết rửa khỏi cột cách qua hai thể tích đệm Protein liên kết rửa giải gradien tuyến tính 0-1,0 M NaCl dung dịch đệm với tốc độ dòng 1,0 mL / phút Các phần nhỏ 3,0 mL thu thập sàng lọc hoạt động tiêu sừng Sau đó, phần hoạt động mạnh gộp lại áp dụng lại vào cột carboxymethyl benzamidine Sepharose 6B protein lại rửa giải gradient NaCl (0,5-1,0 M) tốc độ dòng 0,5 mL / phút phần nhỏ 1,0 mL thu thập Các phần hoạt động gộp lại thẩm tách dung dịch đệm TrisHCl 50 mM, pH 7,5-8, để sử dụng thêm [1] 2.3.4 Lọc gel Keratinase tinh chế từ nguồn vi khuẩn nấm khác Tinh chế keratinase thường bao gồm quy trình ba bước bao gồm kết tủa axeton / amoni sulfat, sắc ký trao đổi ion bước cuối lọc gel Các phần hoạt động thu sau sắc ký trao đổi ion gộp lại, chất khơng hịa tan loại bỏ cách ly tâm lọc [1] Các dung dịch đưa vào cột lọc gel có chứa Sephadex G-75 Sephadex G 100 Cột cân với dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM, pH 7,5-8,0, phân đoạn thu thập với tốc độ rửa giải mL / phút Các phân đoạn hoạt động keratinase thu thập cô đặc để sử dụng tiếp Các phương pháp thông thường kết tủa tách sắc ký nhiều bước tốn thời gian Hơn nữa, chúng bao gồm việc sử dụng hóa chất độc hại đắt tiền [1] Một keratinase ngoại bào từ nấm Scopulariopsis brevicaulis tinh chế cách kết tủa ammonium sulfate quy trình liên quan đến kỹ thuật sắc ký DEAEecellulose Sephadex G-100 Suntornsuk cộng tinh chế keratinase chất làm mát nhiệt có khối lượng phân tử 35 kDa từ B licheniformis Một keratinase kiềm 27 kDa từ Bacillus sp lọc Một keratinase có serine vị trí hoạt động tinh chế khỏi B megaterium Một keratinase điều nhiệt có khối lượng phân tử 28,7 kDa tinh chế từ Clostridium sporogenes Tương tự, keratinase ngoại bào từ Lysobacter NCIMB 9497 tinh [1] 16 2.3.5 Xác định nồng độ protein hòa tan Nồng độ protein xác định phương pháp Bradford với albumin huyết bò (BSA) làm tiêu chuẩn Nồng độ protein hòa tan đo phương pháp axit bicinchoninic (BCA) với BSA tiêu chuẩn [1] Một mẫu protein (25 mL) thêm vào 200 mL thuốc thử BCA hỗn hợp phản ứng ủ 37oC 30 phút Độ hấp thụ bước sóng 562 nm (A562) đo [1] 2.3.6 Độ tinh khiết Enzyme Độ tinh khiết enzyme phân tích SDS-PAGE zymography SDS-PAGE thực cách sử dụng gel polyacrylamide phân tách 12% Các mẫu enzym cho SDS-PAGE chuẩn bị cách trộn với dung dịch đệm điện di (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2,5% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycerol, 5% (v/v) bmercaptoethanol, 0,002% (w/v) bromophenol blue) sau mẫu nung 98 oC phút trước điện di [1] Zymography thực cách sử dụng quy trình tương tự sử dụng cho SDS-PAGE ngoại trừ việc bổ sung 0,2% keratin hòa tan vào gel tách sử dụng mẫu enzyme chưa làm nóng Sau hồn thành q trình điện di, gel zymogram ủ với 2,5% (v/v) Triton X-100 rửa đệm Tris-HCl 50 mM (pH 9,0) 40oC Coomassie Brilliant Blue R-250 sử dụng làm chất nhuộm màu cho tất loại gel trình khử thực dung dịch axit axetic: metanol: nước (10:20:70) Các vùng rõ ràng màu xanh lam gel xác nhận hoạt động tiêu sừng enzyme [1] 2.4 Đặc điểm sinh hóa keratinase Keratinase từ số vi sinh vật nghiên cứu rộng rãi đặc tính sinh hóa chúng Các đặc tính quan trọng bao gồm pH nhiệt độ ảnh hưởng chất ức chế, ion kim loại, dung môi, chất tẩy rửa không ion chất khử [1] 2.4.1 Nhiệt độ pH tối ưu Phần lớn keratinase vi sinh vật nấm protease kiềm trung tính có hoạt tính tối ưu khoảng pH 7,5-10,0 Hầu hết keratinase thể ổn định phạm vi pH rộng nhiệt độ từ ưa nhiệt đến ưa nhiệt Một số keratinase tìm thấy với hoạt tính tối ưu pH có tính kiềm cao pH axit Keratinase từ 17 Streptomyces thermoviolaceus SD8 cho thấy pH tối ưu 8, pH tối ưu Thermoactinomyces candidus 222 8,6 Enzyme phân hủy sừng từ B licheniformis cho thấy hoạt động tối đa pH 8,5 [1] Phạm vi nhiệt độ tối ưu từ 30 đến 80 oC hầu hết keratinase Keratinase từ T candidus 222 cho thấy nhiệt độ tối ưu 70°C Keratinolytic enzymes từ Chrysosporium keratinophilum vi khuẩn ưa nhiệt Fervidobacterium islandicum AW-1 cho thấy nhiệt độ đặc biệt cao 90 100 oC, với chu kỳ bán rã tương ứng 30 90 phút Keratinase từ Lysobacter NCIMB 9497 cho thấy hoạt động tiêu sừng cao nhiệt độ tối ưu 50oC, keratinase từ Chryseobacterium sp kr6 hiển thị nhiệt độ tối ưu 55oC Keratinase từ Chryseobacterium sp RBT thử nghiệm để có hoạt tính tối đa pH 8,6 50 oC Saccharomonospora viridis SJ-21, phân lập từ suối nước Gujarat, Ấn Độ, cho thấy hoạt động enzym tối đa 55oC pH 9,5 [1] 2.4.2 pH độ ổn định nhiệt Các nghiên cứu độ ổn định pH cho thấy keratinase thường hoạt động ổn định phạm vi pH rộng từ đến 13 Keratinase tinh khiết từ Streptomyces pactum DSM 40530 cho thấy ổn định phạm vi pH từ đến 10 phạm vi nhiệt độ từ 40 đến 75oC Keratinase từ F islandicum AW-1 cho thấy khả ổn định nhiệt 90 phút 100oC từ Thermoanaerobacter keratinophilus 80oC Các enzym tiêu sừng từ Nesterenkonia sp AL-20 Bacillus pseudofirmus AL-89 tinh đặc trưng Keratinase từ Nesterenkonia sp AL-20 ổn định phạm vi pH rộng, hiển thị 90% hoạt tính khoảng pH 7,5 đến 11,5 Enzyme tiêu sừng từ B pseudofirmus AL-89 giữ lại khoảng 70% hoạt tính ban đầu trở lên cho thấy ổn định phạm vi pH rộng 6,5-11,0 [1] 2.4.3 Ảnh hưởng ion kim loại, chất ức chế chất tẩy rửa Keratinase serine protease kim loại có đặc tính chất rộng Hầu hết keratinase bị ức chế chất ức chế peptidase đặc hiệu serine phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Keratinase từ Serratia sp HPC 1383 cho thấy ức chế 47% có PMSF bị ức chế phần chất khử β -mercaptoethanol (39%) ion Zn 2+ (41%) [116] Tuy nhiên, ion kim loại hóa trị hai Ca 2+ Fe2+ làm tăng hoạt tính enzym 15% 26% Nói chung, hoạt động keratinase kích thích diện ion kim loại hóa trị hai Ca 2+, Mg2+, Mn2+ Một keratinase từ chủng B 18 subtilis MTCC-9102 hoàn toàn bị ức chế EDTA, 1,10-phenanthroline, Hg 2+ Cu2+, không bị ảnh hưởng PMSF Các ion kim loại Zn 2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+ Ni2+ tăng cường hoạt động keratinase Sự tăng cường hoạt động enzym keratinase từ B licheniformis ER-15 quan sát thấy với β -mercaptoethanol mM Hoạt tính enzyme keratinase ngoại bào từ B pumilus KS12 tăng cường gấp tám lần dithiothreitol β -mercaptoethanol Hoạt động enzym tăng cường chất hoạt động bề mặt, chất tẩy rửa chất oxy hóa khác [1] Tài Liệu Tham Khảo 19 [1] D Kothari, A Rani, A Goyal, "Keratinases," in Current Developments in Biotechnology and Bioengineering, 2017, pp 447-469 [2] Beti Vidmar and Maša Vodovnik, "Microbial Keratinases: Enzymes with Promising Biotechnological Applications," Food Technology & Biotechnology, pp 312-328, 2018 20