Nghiên Cứu Tạo Nguyên Liệu Chứa Bacillus Clausii Dạng Bào Tử.pdf

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG T[.]

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Thu Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, ngồi nỗ lực thân, em nhận nhiều giúp đỡ gia đình, thầy cơ, bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Thu Phương người thầy tận tình bảo, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi từ ngày đầu đến em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến thầy cô anh chị kĩ thuật viên môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội quan tâm giúp đỡ em suốt thời gian làm thực nghiệm Em xin trân trọng cảm ơn thầy cô cán Trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, quan tâm em suốt năm học tập trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè ln động viên khích lệ em suốt q trình học tập làm khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Phùng Thị Ngọc Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Vai trò 1.1.3 Probiotic từ bào tử 1.2 KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii 1.2.1 Đặc điểm hình thái .6 1.2.2 Cấu trúc gen 1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 1.2.4 Đặc điểm sinh thái 1.2.5 Điều kiện nuôi cấy 1.2.6 Ứng dụng B clausii .7 1.2.7 Một số nghiên cứu lên quan tới B clausii 1.3 BÀO TỬ VI KHUẨN 1.3.1 Quá trình hình thành bào tử 11 1.3.2 Tính chất bào tử vi khuẩn ứng dụng .11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 13 2.1.1 Nguyên vật liệu 13 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.1.3 Thiết bị .14 2.2 Nội dung nghiên cứu .15 2.2.1 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn 15 2.2.2 Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu trình bảo quản 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu .15 2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina 15 2.3.2 Phương pháp nhân giống môi trường lỏng .15 2.3.3 Phương pháp đo quang đánh giá sinh trưởng vi sinh vật 15 2.3.4 Phương pháp thu sinh khối .16 2.3.5 Phương pháp xử lý sinh khối lysozym thu bào tử 16 2.3.6 Phương pháp đông khô 17 2.3.7 Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska 17 2.3.8 Xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp pha loãng liên tục…………………………………………………………………………… 18 2.3.9 Định lượng đường dư theo phương pháp Schoorl – Regenbogen 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn 21 3.1.1 Xác định thời điểm lượng sinh khối bào tử hình thành nhiều .21 3.1.2 Khảo sát phát triển vi khuẩn bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy 23 3.2 Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu trình bảo quản .26 3.2.1 Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy .26 3.2.2 Lựa chọn phương pháp bảo quản B clausii 30 3.2.3 Theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu bảo quản NaCl 0,9% 33 3.2.4 Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính tốn số lượng ống sản phẩm tạo thành 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid Ribonucleic ATCC : American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) B cereus : Bacillus cereus B clausii : Bacillus clausii B subtilis : Bacillus subtilis Cfu : Colony - Forming Units (số đơn vị khuẩn lạc) DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí hiệu chủng giống thuộc sưu tập vi sinh vật tế bào Đức) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm giới) MT1 : Môi trường canh thang OD : Optical Density (mật độ quang) TB : Tế bào V /P : Vòng/phút VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization (Tổ chức y tế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG Trang 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 13 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 14 3.1 Khả sinh trưởng B clausii thể qua giá trị mật độ 22 quang hình ảnh sau nhuộm Ogietska 3.2 Giá trị mật độ quang lượng đường tiêu thụ B clausii 24 100ml môi trường nuôi cấy bổ sung nồng độ glucose khác 3.3 Mật độ quang số lượng VSV sống sót mẫu sau 27 xử lý 3.4 Hình thái B clausii tiêu nhuộm Ogietska 28 3.5 Tình trạng B clausii mẫu nguyên liệu nhuộm Ogietska 31 sau khoảng thời gian bảo quản 3.6 Giá trị mật độ quang mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau 32 tháng bảo quản 3.7 Số lượng B clausii sống sót thời điểm trình bảo 34 quản 3.8 Mật độ quang số lượng bào tử B clausii ống chuẩn nồng độ pha lỗng 36 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH Trang 1.1 Sản phẩm chứa B clausii 1.2 Vi khuẩn B clausii 1.3 Cấu tạo bào tử vi khuẩn 10 1.4 Sự hình thành bào tử 11 2.1 Xác định số lượng vi sinh vật phương pháp đo độ đục 16 3.1 Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang lượng glucose tiêu 24 thụ B clausii theo nồng độ glucose môi trường nuôi cấy 3.2 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót mật độ quang 28 mẫu sau xử lý phương pháp khác 3.3 Hình ảnh B clausii nhuộm Ogietska kính hiển vi vật kính 32 100 (mẫu bảo quản NaCl sau tháng) 3.4 Biểu đồ biểu diễn biến thiên số lượng VSV sau khoảng 34 thời gian bảo quản 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B clausii 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện giới xu hướng sử dụng sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên phục vụ sống phát triển mạnh mẽ, đặc biệt sản phẩm men vi sinh (probiotic) Các chủng probiotic sử dụng đa dạng Các loài nghiên cứu rộng rãi Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans Bacillus licheniformis ưu điểm riêng biệt Đó khả sinh bào tử, bào tử vi khuẩn sinh tự nhiên để chúng tồn lâu dài điều kiện khắc nghiệt, mà điều kiện vi khuẩn trưởng thành bị giết chết [28] Chế phẩm Enterogermina chế phẩm chứa Bacillus clausii dạng bào tử sử dụng rộng rãi thị trường Nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy, dạng bào tử, lợi khuẩn B clausii an tồn vượt qua mơi trường acid khắc nghiệt dịch dày đến ruột với tỷ lệ sống cao hẳn loại lợi khuẩn thông thường khác Men vi sinh dạng bào tử lợi khuẩn B clausii giúp bổ sung vi khuẩn có lợi lập lại cân hệ vi khuẩn đường ruột, giúp phòng ngừa điều trị hiệu rối loạn tiêu hóa Trên thực tế, việc sản xuất nguyên liệu chứa bào tử gặp nhiều vấn đề Đó phải thu lượng bào tử tối đa tinh khiết khơng cịn lẫn tế bào chất hay xác tế bào từ sinh khối thu sau ni cấy Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử” thực để giải vấn đề với mục tiêu sau: Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu trình bảo quản CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Định nghĩa Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa “vì sống” Theo nghĩa gốc, "biotic" hay "biosis" từ chữ "life" đời sống, "pro" thân thiện, nên probiotic hiểu theo nghĩa thân thiện với đời sống người Hiểu sát nghĩa hơn, chất bổ sung dinh dưỡng chứa vi khuẩn hay vi nấm có ích [27], [40] Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – chứng minh việc tiêu thụ Lactobacillus hạn chế nội độc tố hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích điều bí ẩn sức khỏe người Cô-dắc Bulgary, họ sống khỏe mạnh tuổi thọ lên tới 115 tuổi hơn, nguyên nhân họ tiêu thụ lớn sản phẩm sữa lên men, điều ông báo cáo sách “sự kéo dài sống” – The Prolongation of life (1908) Có thể nói Metchnikoff người đưa đề xuất mang tính khoa học probiotic, làm sở cho nghiên cứu probiotic Định nghĩa probiotic phát triển theo thời gian Lily Stillwell mô tả probiotic hỗn hợp tạo thành động vật nguyên sinh mà thúc đẩy phát triển đối tượng khác [41] Phạm vi định nghĩa mở rộng Sperti vào đầu năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật Probiotic vi sinh vật vi khuẩn hay nấm men mà thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột sinh vật chủ [41] Vì vậy, khái niệm “Probiotic” ứng dụng để mơ tả “cơ quan chất mà góp phần vào cân hệ vi sinh vật ruột” Định nghĩa chung sau làm xác Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic thực phẩm bổ sung VSV sống đem lại tác động có lợi cho vật chủ cách cải thiện cân hệ vi sinh đường ruột” [35] Theo định nghĩa FAO WHO năm 2002 “Probiotic vi sinh vật sống mà đưa vào thể với lượng đủ lớn đem lại tác động có lợi cho sức Kho tài liệu miễn phí Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ 28 100 0.6 0.477 0.483 0.5 80 0.342 60 0.4 0.3 100 93 40 0.197 0.2 20 Mật độ quang Số lượng VSV ( x 108 cfu/ml) 120 0.1 28 19 0 Mẫu nước cất Mẫu NaCl 0,9% Mẫu Lysozyme Mẫu đông khô Số lượng VSV (x 10^8 cfu/ml) OD (10^-1) Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót mật độ quang mẫu sau xử lý phương pháp khác Bảng 3.4 Hình thái B clausii tiêu nhuộm Ogietska Hình ảnh sau nhuộm Tình trạng mẫu Tế bào Bào tử Pha loãng nước cất + + Pha lỗng NaCl 0,9% + + Đơng khô + + Xử lý lysozym _ + Chú thích: (+) Có (-) Khơng Nhận xét: Các kết thu từ bảng 3.3 hình 3.2 cho thấy: 29 + Lượng sinh khối thu nhiều pha lỗng nước cất nước muối sinh lí, thể giá trị mật độ quang cao (0,477 0,483) Trong giá trị mật độ quang sau đông khô 0,342 xử lý lysozym cịn 0,197 + Sau pha lỗng sinh khối nước cất nước muối sinh lí, thu số lượng vi sinh vật sống sót nhiều phương pháp xử lý lysozym đông khô (100.108 cfu/ml 93.108 cfu/ml) Xử lý lysozym số lượng VSV giảm cịn 28.108 cfu/ml, sau đơng khơ số lượng VSV sống sót thấp (19.108 cfu/ml) Từ bảng 3.4 nhận thấy: pha loãng sinh khối nước cất nước muối sinh lí thu bào tử lẫn tế bào sinh dưỡng; đông khô sinh khối VSV từ môi trường nuôi cấy thu bào tử lẫn tế bào sinh dưỡng xác tế bào; xử lý lysozym thu hoàn toàn dạng bào tử Bàn luận: Các kết giải thích sau: + Sinh khối thu sau ngày nuôi cấy, không qua xử lý, pha loãng nước cất dung dịch NaCl 0,9% số lượng vi sinh vật gần khơng thay đổi thời điểm đó, tế bào VSV chưa chuyển hết thành dạng bào tử, cần thêm thời gian để tế bào vi khuẩn chuyển hết thành dạng bào tử + Đông khô sinh khối thu từ môi trường nuôi cấy, số lượng VSV đạt nồng độ cao (ở mức 108 cfu/ml) nhiên số lượng VSV sống sót pha loãng sinh khối nước cất NaCl 0,9% phương pháp xử lý lysozym Mặt khác xử lý theo phương pháp này, sinh khối thu lẫn nhiều tế bào B clausii Do đó, đơng khơ khơng tối ưu để sử dụng cho mục đích thu bào tử tinh khiết với lượng lớn + Xử lý lysozym có ưu điểm phương pháp trên: thời gian ngắn loại hết tế bào thu toàn bào tử, kết phù hợp với nghiên cứu dược sĩ Vũ Thị Ngọc Bích [1] Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp trải qua nhiều giai đoạn (phá vỡ vỏ tế bào, loại bỏ vỏ tế bào, rửa) sau lần lượng sinh khối bị rửa trôi nhiều lượng tế bào vi khuẩn chưa chuyển sang bào tử bị loại nên số lượng vi sinh vật giảm đáng kể (trước xử lý giá trị mật độ quang 30 đo 0,491 sau xử lý 0,197) Hơn nữa, phương pháp sử dụng nhiều loại hóa chất khác nhau, cách tiến hành phức tạp giá thành lysozym cao dẫn đến chi phí tăng cao Sinh khối thu cịn chứa lượng nhỏ lysozym ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu thời gian bảo quản sử dụng Từ nhận định trên, lựa chọn phương pháp pha loãng sinh khối VSV nước cất, NaCl 0,9% phương pháp xử lý lysozym để tiến hành thí nghiệm 3.2.2 Lựa chọn phương pháp bảo quản B clausii Mục tiêu: Xác định phương pháp nhằm bảo quản nguồn bào tử thời gian dài mà không bị hoạt tính Tiến hành: Sinh khối sau thu mục 3.2.1.a, 3.2.1.b 3.2.1.d tiến hành bảo quản nước cất nước muối sinh lí Theo dõi khả chuyển dạng bào tử mẫu khoảng thời gian khác theo phương pháp nêu mục 2.3.7 Kết quả: 31 Bảng 3.5 Tình trạng B clausii mẫu nguyên liệu nhuộm Ogietska sau khoảng thời gian bảo quản Xử lý lysozym, bảo Bảo quản NaCl Bảo quản nước 0,9 % cất tuần TB xanh + bào tử đỏ TB xanh + bào tử đỏ Bào tử đỏ tuần TB xanh + bào tử đỏ TB xanh + bào tử đỏ Bào tử đỏ TB xanh đi, lượng bào TB xanh đi, bào tử tử đỏ chiếm chủ yếu chiếm chủ yếu Mẫu tuần Chủ yếu bào tử đỏ, thỉnh quản NaCl 0,9 % Bào tử đỏ tuần Bào tử đỏ tuần Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ tháng Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ tháng Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ thoảng có TB xanh Bào tử đỏ Nhận xét: Sau tuần, mẫu nguyên liệu bảo quản NaCl chuyển hết thành bào tử, mẫu bảo quản nước cất lẫn tế bào Đến tuần thứ 5, mẫu bảo quản nước cất chuyển hết sang dạng bào tử Sau tháng, tất mẫu bảo quản giữ dạng bào tử Kho tài liệu miễn phí Ket-noi.com blog giáo dục, cơng nghệ 32 Hình 3.3 Hình ảnh B clausii nhuộm Ogietska kính hiển vi vật kính 100 (mẫu bảo quản NaCl sau tháng) Bảng 3.6 Giá trị mật độ quang mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau tháng bảo quản Mẫu Bảo quản nước cất Bảo quản NaCl 0,9% Xử lý lysozym OD (10-1) 0,431 0,440 0,158 % so với bảo quản NaCl 0,9% 97,8% 100% 36% Nhận xét: Khi bảo quản nước muối sinh lí nước cất (không qua bước xử lý lysozym), lượng sinh khối không bị nhiều So với sinh khối bảo quản nước muối, lượng sinh khối bảo quản nước cất đạt 97,8% sinh khối sau xử lý lysozym đạt 36% Bàn luận: + Phương pháp bảo quản sinh khối nước muối sinh lí nước cất đơn giản, dễ làm, chi phí thấp bào tử thu với lượng lớn, tinh khiết so với 33 phương pháp xử lý lysozym Tuy nhiên phương pháp cần khoảng thời gian (1 tháng) để tế bào sinh dưỡng chuyển hết thành dạng bào tử + Khi bảo quản sinh khối nước muối sinh lí cho thấy có ưu điểm so với nước cất Có thể giải thích nước muối sinh lí mơi trường đẳng trương so với tế bào vi khuẩn, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào vi khuẩn Nước cất có mơi trường nhược trương so với tế bào vi khuẩn, nên nước tự động khuếch tán từ bên vào bên tế bào vi khuẩn theo chế thẩm thấu, dẫn tới tượng trương nước tế bào [10] Trong mơi trường nhược trương, tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, làm giảm lượng bào tử hình thành sau + Mẫu xử lý lysozym sau bảo quản nước muối sinh lí giữ nguyên dạng bào tử cho thấy tính ưu việt sử dụng nước muối sinh lí để bảo quản Từ nhận định thấy, để thu bào tử tinh khiết với lượng lớn phương pháp bảo quản sinh khối VSV NaCl 0,9% mà không qua bước xử lý phương pháp tối ưu Mẫu sinh khối bảo quản NaCl 0,9% sử dụng cho thí nghiệm 3.2.3 Theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu bảo quản NaCl 0,9% Sinh khối vi sinh vật suốt trình bảo quản chịu nhiều tác động ngoại cảnh khác dẫn tới bị biến chất thay đổi màu sắc, vẩn đục hay có mùi khó chịu số lượng vi sinh vật giảm sút Do đó, cần phải theo dõi liên tục mẫu bảo quản tiến hành khảo sát định kì tỷ lệ sống sót bào tử thu nhằm tạo nguồn nguyên liệu tối ưu Mục tiêu: Theo dõi thể chất xác định tỷ lệ sống sót bào tử sau khoảng thời gian khác Tiến hành: Sau thời gian bảo quản bào tử nước muối sinh lí, theo dõi màu sắc, mùi mẫu lưu, lấy mẫu làm tiêu Ogietska quan sát nảy mầm bào tử, đồng 34 thời tiến hành xác định số lượng bào tử sống sót theo phương pháp pha lỗng liên tục nêu mục 2.3.8 Kết quả: Bảng 3.7 Số lượng B clausii sống sót thời điểm trình bảo quản Thời gian Ban đầu tháng tháng tháng Số lượng VSV 93.108 cfu/ml 85.108 79.108 106.108 cfu/ml cfu/ml cfu/ml Số lượng VSV (×108 cfu/ml) 120 100 106 93 85 80 79 Số lượng VSV 60 40 20 0 tháng tháng tháng Thời gian tháng Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn biến thiên số lượng VSV sau khoảng thời gian bảo quản Nhận xét: Trong suốt thời gian tháng, nguyên liệu bào tử tạo bảo quản nước muối sinh lí giữ nguyên thể chất số lượng bào tử sống sót gần không thay đổi (số lượng VSV đạt mức 108 cfu/ml) Sau tháng bảo quản, bào tử thu có màu trắng ngà, lắng đáy lọ, phần nước suốt, không màu, không mùi Trên tiêu nhuộm Ogietska thấy xuất toàn bào tử bắt màu đỏ Bàn luận: 35 Bảo quản nước muối sinh lí có ưu điểm bào tử giữ nguyên thể chất số lượng Có thể giải thích mơi trường nước muối sinh lí khơng cịn nguồn dinh dưỡng, khơng cịn điều kiện thuận lợi cho bào tử nảy mầm trở lại Tóm lại, để tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử tinh khiết với lượng lớn có thể, cần tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật môi trường canh thang với thời gian ngày, sau ly tâm thu sinh khối, rửa sinh khối bảo quản nước muối sinh lí 3.2.4 Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính tốn số lượng ống sản phẩm tạo thành Mục tiêu: Xác định lượng ống sản phẩm tạo Tiến hành:  Lập đường chuẩn : + Từ ống nguyên liệu thị trường pha loãng 2, 4, 6, 8, 10 lần nước muối sinh lí ống nghiệm khác Tiến hành đo quang với bước sóng 600nm, mẫu trắng nước muối sinh lí chuẩn bị song song mẫu thử + Đồng thời mức pha loãng lại tiếp tục tiến hành pha loãng theo nguyên tắc pha loãng liên tục theo phương pháp nêu mục 2.3.8 Cấy 3ml dịch chứa vi khuẩn cần khảo sát vào bình nón có chứa môi trường thạch thường hấp tiệt trùng, lắc sau đổ đĩa petri Ni cấy tủ ấm 37ºC 24  Từ số liệu đo quang số lượng khuẩn lạc mọc đĩa petri vẽ đường chuẩn  Xác định lượng ống sản phẩm tạo từ 100ml môi trường nuôi cấy + Tiến hành lấy mẫu nguyên liệu bảo quản nước muối sinh lí thu mục 3.2.2 (bảng 3.5 3.6), pha loãng 10 lần, sau tiến hành đo quang với bước sóng 600nm, mẫu trắng nước muối sinh lí chuẩn bị song song mẫu thử 36  Số liệu đo quang đưa vào đường chuẩn để suy số lượng vi sinh vật Kết quả: Bảng 3.8 Mật độ quang số lượng bào tử B clausii ống chuẩn nồng độ pha loãng Độ pha lần lần lần lần 10 lần OD 0,506 0,251 0,170 0,125 0,104 Số lượng 124.107 46.107 39.107 27.107 13.107 VSV cfu/ml cfu/ml cfu/ml cfu/ml cfu/ml loãng OD 0.6 y = 0.0037x + 0.045 R² = 0.98 Mật độ quang 0.5 0.4 0.3 OD Linear (OD) 0.2 0.1 0 20 40 60 80 100 120 140 Số VSV (10^7) Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B clausii Mật độ quang mẫu nguyên liệu chứa toàn dạng bào tử nuôi cấy từ môi trường canh thang sau pha loãng 10 lần 0,440 (bảng 3.6) Dựa vào đường chuẩn tính số lượng bào tử B clausii có 1ml mơi trường ni cấy 106,8.108 cfu 37 Do đó, 100ml mơi trường nuôi cấy tạo ra: 106,8.1010 cfu ống sản phẩm thị trường 5ml có chứa 2.109 bào tử Do số lượng ống sản phẩm thu sau nuôi cấy B clausii 100ml môi trường là: 106,8.1010 : 2.109 = 533,7 ống Kết luận sơ bộ: Tóm lại, sau ngày nuôi cấy B clausii, tiến hành ly tâm thu sinh khối bảo quản sinh khối NaCl 0,9% sau tháng tế bào sinh dưỡng chuyển hoàn toàn sang dạng bào tử Sau tháng số lượng VSV sống sót đạt mức 85.108 cfu/ml Sau tháng số lượng VSV giữ 106.108 cfu/ml, không giảm so với lượng VSV ban đầu 93.108 cfu/ml Do thấy tính ưu việt mẫu nguyên liệu chứa bào tử Trong trình bảo quản, bào tử không nảy mầm trở lại, điều kiện bảo quản bào tử giữ màu trắng ngà lắng đáy ống nghiệm, dung dịch bảo quản khơng màu Đã tính tốn lượng bào tử tạo từ môi trường nuôi cấy: với 100ml mơi trường ni cấy thu 533 ống sản phẩm với số lượng bào tử theo yêu cầu 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài thu số kết sau: Lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp thu lượng bào tử Bacillus clausii lớn nhất: Nuôi cấy B clausii môi trường canh thang với thời gian ngày Xác định phương pháp xử lý bảo quản để tạo nguồn nguyên liệu chứa toàn dạng bào tử với lượng lớn theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu: xử lý bảo quản nước muối sinh lí Sau tháng bảo quản NaCl 0,9% sinh khối B clausii chuyển hết thành bào tử Lượng bào tử thu tinh khiết cao bảo quản nước cất, xử lý lysozym đông khô Sau tháng nồng độ VSV sống sót giữ mức 108 cfu/ml Với 100ml mơi trường ni cấy thu 533 ống sản phẩm với số lượng bào tử theo u cầu II KIẾN NGHỊ Vì thời gian có hạn nên khóa luận chưa thể đề cập hết vấn đề liên quan Dưới vài đề xuất để đề tài hồn thiện hơn: Tiếp tục theo dõi hình thành bào tử B clausii nuôi cấy môi trường canh thang bổ sung glucose từ 2% - 6% Nuôi cấy bảo quản bào tử B clausii NaCl 0,9% thu bào tử, tiếp tục nghiên cứu theo hướng tạo nguyên liệu dạng khô để phát triển với quy mô lớn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Thị Ngọc Bích (2013), Nghiên cứu xử lý sinh khối Bacillus clausii để thu bào tử, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất y học Hồ Lê Quỳnh Châu cộng (2010), “Đánh giá khả bám dính kháng khuẩn mức độ invitro số chủng vi sinh vật có tiềm sử dụng làm probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 57 Nguyễn Lân Dũng (2011), Vi sinh vật học, NXB giáo dục Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Hà Thị Thanh Huyền (2014), Nghiên cứu sử dụng Alginat làm chất bảo vệ trình đơng khơ Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Duy Khánh (2006), Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận văn kĩ sư chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đình Luyện (2009), Thực tập kĩ thuật sản xuất dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.74 – 75 Nguyễn Thị Bích Ngọc (2011), Khảo sát điều kiện ni cấy vi khuẩn B clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội 10 Cao Văn Thu (2005), Sinh học đại cương, Trường đại học Dược Hà Nội, tr 33 11 Cao Văn Thu (2008), Vi sinh vật học, NXB giáo dục, tr 33 – 34 12 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), “Công nghệ sinh học”, NXB giáo dục, tập 4, tr 129 – 154 Tiếng Anh 13 Asha Devil N K., Balakrishnan K., Gopal R and Padmavathyl S (2008), “Bacillus clausii MB9 from the east coast regions of India: Isolation, biochemical characterization and antimicrobial potentials”, Current science, 95, pp 627 – 635 14 Barbosa T M., Serra C R., La Ragione R M., Woodward M J and Henriques A O (2005), “Screening for Bacillus isolated in the broler gastrointestinal tract”, Applied and Environmental Microbiology, 71, pp 968 – 978 15 Casuala G., Cutting S M (2002), “Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract”, Appl Environ Microbiol, 68, pp 2344 – 2352 16 Ciprandi G., Tosca M A., Milanese M., Caligo G and Ricca V (2004), “Cytokines evaluation in nasal lavage of allergic children after Bacillus clausii administration: A pilot study”, Pediatr Allergy Immunol, 15, pp 148 – 151 17 Ciprandi G., Vizzaccaro A., Cirrillo I and Tosca M A (2005), “Bacillus clausii effects in children with allergic rhinitis”, Allergy, 60(5), pp 702 – 703 18 Driks A (2004), “The Bacillus Spore coat”, Phytopathology, 94, pp 1249 – 1251 19 Duc Le H, Hong H A., Barbosa T M., et al (2004) “Charac – terization of Bacillus probiotics available for human use”, Appl Environ Microbiol, 70, pp 2161 – 2171 20 Green D H., Wakeley P R., Page A., Barnes A., Baccigalupi L., Ricca E., and Cutting S M (1999), “Charac – terization of two Bacillus probiotics”, Appl Environ Microbiol, 65, pp 4288 - 4291 21 Hong H A., Le Hong Duc, Simon M C (2005), “The use of bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp 813 – 835 22 Ivanovska T P., Petrusevska-Tozi L., Kostoska M D., Geskovski G., Grozdanov A., Stain “Microencapsulation C., of Stafilov Lactobacillus T., casei Mladenovska in K (2012), Chitosan-Ca-Alginate microparticles using spray-dying method”, Macedonian Journal of Chemistry and Chemical Engineering, 31, pp.115 – 123 23 Kobayashi T., Kageyama Y., Sumitomo N., Saeki K., Shirai T and Ito S (2005), “Contribution of a salt bridge triad to the thermostability of a highly alkaline protease from an alkaliphilic Bacillus strain”, World J Microbiol Biotechnol, 21, pp 961 -967 24 Lieske J C., Goldfarb D S., De Simone C., Regnier C (2005), “Use of a Probiotic to Decrease Enteric Hyperoxaluria”, Kidney International, 68(3), pp 1244 – 1249 25 Marseglia G L., Tosca M., Cirillo I., Licari A, Leone M., Marseglia A., et al (2007), “Efficacy of Bacillus clausii spores in the prevention of recurrent respiratory infections in children: a pilot study”, The Clin Risk manag, 3(1), pp 13 – 17 26 Martini M C., Bollweg G L., Levitt M D and Savarano D A (1987), “Lactose digestion by yogurt ẞ-galactosidase: influence of pH and microbial cell integrity”, The American Journal of clinical nutrition, 45, pp 432 - 436 27 Mcfarlane G Cummings JH (1999), “Probiotics and prebiotics can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health”, pp 999 – 1003 28 Nicholson W J., Munakata N., Horneck G., Melosh H J and Setlow P (2000), “Resistance of Bacillusendospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64, pp 548 – 572 29 Nielsen P., Fritze D and Priest F G (1995), “Phenetic diversity of alkaliphilic bacillus strains: proposal for nine new species”, Microbiology, 141, pp 1745 – 1761 30 Nista E C., Candelli M., Cremonini F., Cazzato I A and et al (2004), “Bacillus clausii therapy to reduce side-effects of anti-Helicobacter pylori treatment: randomized, double-blind, placebo controlled trial”, Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 20(10), pp 1181 – 1188 31 Oskouie S F G., Tabandeh F., Yakhchali B., Eftekhar F (2008), “Response surface optimization of medium composition for alkaline protease production by Bacillus clausii”, Biochemical Engineering Journal, 39, pp 37 – 42 32 Saad N., Delattre C., Urdaci M., Schmitter J M., Bressollier P (2013), “An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field”, LWT – Food Science and Technology, 50(1), pp – 16 33 Sazawal S., Hiremath G., Dhingra U., Malik P., Deb S., E Black R (2006), “Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhea: a meta-analysis of Kho tài liệu miễn phí Ket-noi.com blog giáo dục, cơng nghệ masked, randomized, placebo-controlled trials”, Lancet Infect Dis, 6, pp 374 – 382 34 Shirai T., Suzuki A.,Yamane T., Ashida T., Kobayashi T., Hitomi J and Ito S (1997), “High-resolution crystal structure of M-protease: phylogeny aided analysis of the high-alkaline a daptation mechanism”, Protein Engineering, 10(6), pp 627 - 634 35 Singh P K., Deol P K., Kaur I P (2012), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginate beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 3, pp 83 -90 36 Spinosa M R., Braccini T., Ricca E., De Felice M., Morelli L., Pozzi G and Oggioni M R (2000), “On the fate of ingested Bacillus spores”, Research in Microbiology, 151, pp 361 – 368 37 Spinosa M R., Wallet F., Courcol J R and Oggioni M R (2000), “The trouble in tracing opportunistic pathogens: cholangitis due to Bacillus in a French hospital caused by a train related to an Italian probiotics”, Microbial ercology in health and disease, 12, pp 99 – 101 38 Soccol C R., De Souza L P and et al (2010), “The potential of Probiotics”, Food Technol Biotechnol, 48(4), pp 413 – 434 39 Tuohy K M., et al (2007), “Survivability of a probiotic Lactobacillus casei in the gastrointestinal tract of healthy human volunteers and its impact on the faecal microflora”, J Appl Microbiol, 102, pp 1026 – 1032 40 Vivek K B (2013), “Use of encapsulated Probiotics in dairy based foods”, International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277 – 209X, 3(1), pp 188 – 199 41 World Gastroenterology Organization Food and Agriculture Organization of The United Nations (2006), “Probiotics in Food: Health and nutritional properties and guidelines for evaluation”