Luận văn thạc sĩ xây dựng cơ sở dữ liệu adn mã vạch và nhân giống dây thìa canh (gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

viii DANH M C H NH Hình 1.1 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sehunlt Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Dây thìa canh 33 Hình 3.2 Kết nhân đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Dây thìa canh thu dùng mồi P10 34 Hình 3.3 Kết nhân đoạn gen trnL từ mẫu Dây thìa canh thu dùng mồi p11 35 Hình 3.4 Kết nhân đoạn gen ITS1 từ mẫu Dây thìa canh dùng mồi p12 35 Hình 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng psbA-trnH 38 Hình 3.6 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng trnL 39 Hình 3.7 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng ITS1 40 Hình 3.8 Mẫu tái sinh chồi mơi trường dinh dưỡng MS 42 Hình 3.9 Một số hình ảnh Dây thìa canh thí nghiệm 46 Hình 3.10 Một số hình ảnh Dây thìa canh giai đoạn nhanh nhanh chồi 49 Hình 3.11 Dây thìa canh hồn chỉnh 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) đánh giá dược liệu quan trọng chiến lược phát triển thảo dược Việt Nam Thành phần hóa học có hoạt tính sinh học dây thìa canh axit gymnemic, hoạt chất thuộc nhóm saponin triterpenoid Ngồi ra, Dây thìa canh cịn chứa thành phần khác flavone, anthraquinone, hentriacontane, pentatriacontane, α β-chlorophylls, phytin, resins, d-quercitol, axít tartaric, axit formic, axit butyric, lupeol Axit gymnemic có tác dụng kích thích sản sinh tế bào beta tuyến tụy, giúp thể tái thiết lập khả cân đường huyết tự nhiên; ức chế hấp thu đường ruột; ức chế gan tân tạo glucose vào máu, đồng thời kích thích enzyme chịu trách nhiệm tiêu thụ, sử dụng đường mơ Lá dây thìa canh sử dụng rộng rãi điều trị đái tháo đường thuốc lợi tiểu khắp giới, đặc biệt Ấn Độ, Việt Nam số nước khác Một số hợp chất hoạt tính sinh học phân lập từ thảo dược để chữa bệnh tiểu đường Ngoài sử dụng chống đầy khó tiêu, táo bón, vàng da, bệnh trĩ, bệnh tim, hen suyễn, viêm phế quản Hiện nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng, nhiên loài tự nhiên bị giảm số lượng chất lượng khai thác mức, điều kiện ngày bất lợi môi trường tự nhiên, nên việc nghiên cứu nhân giống bảo tồn cần thiết, cấp bách việc lưu giữ nguồn gen quý Mã vạch ADN đoạn ADN ngắn, nằm hệ gen (nhân, lục lạp ty thể) đặc trưng loài sinh vật Do việc xác định lồi mã vạch ADN có độ xác cao Phương pháp trở thành công cụ hữu hiệu cho nhà khoa học việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền quan hệ di truyền loài Dây thìa canh nhân giống phương pháp, gieo hạt giâm hom, biện pháp nhân giống có ưu điểm định không tránh khỏi nhược điểm sinh trưởng không đồng đều, hệ số nhân thấp, phụ thuộc mùa vụ v.v Để giải nhược điểm trên, phương pháp nuôi cấy mô tế bào rút ngắn thời gian cho phép nhân nhanh để tạo số lượng lớn giống Dây thìa canh thời gian ngắn, đảm bảo hàm lượng hoạt chất ổn định, không nhiễm bệnh, ưu việt so với phương pháp truyền thống Với mục tiêu xây dựng sở liệu ADN mã vạch cho lồi Dây thìa canh nhằm xác định lồi phục vụ bảo tồn phát triển dược liệu, tiến hành nghiên cứu: Xây dựng sở liệu ADN mã vạch nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) phương pháp ni cấy in vitro Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Chi Gymnema Lịch sử phân loại chi Gymnema gắn liền với lịch sử quan điểm phân loại hai họ Thiên lý (Asclepiadaceae) họ Trúc đào (Apocynaceae) Trong đa số tài liệu phân loại thực vật kinh điển, chi Gymnema xếp họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [52], [58] Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại công bố năm 2009, Takhtajan theo quan điểm Hallier (1905, 1912), Stebbins (1974), Thorne (2006), Endress & Bruyns (2000) Endress & Stevins (2001) để gộp Apocynaceae Asclepiadaceae thành họ nhất, Gymnema trở thành chi phân họ Asclepiadoideae họ lớn Apocynaceae [47] Cho đến quan điểm thừa nhận rộng rãi hệ thống phân loại quốc tế [59] Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Gymnema Bậc phân loại Ngành Lớp Phân lớp Bộ Họ Phân họ Chi Theo thực vật chí Trung Quốc [2], [52] Magnoliophyta Magnoliopsida Lamiidae Gentianales Asclepiadaceae Gymnema Hệ thống Takhtajan (2009) [47] Magnoliophyta Magnoliopsida Lamiidae Gentianales Apocynaceae Asclepiadoideae Gymnema 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố chi Gymnema Các loài thuộc chi Gymnema leo, khơng có rễ phụ thân Lá mọc đối, không nạc Cụm hoa xim, dạng tán chùm Hoa nhỏ Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, khơng có tuyến Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập nụ, tiền khai vặn phải Tràng phụ đơn,vảy tràng phụ dính tràng, thường có hàng lơng xếp dọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau, bao phấn ơ, có phần phụ đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn có sáp bao bên ngồi vách khối phấn, khối phấn khơng có mỏm đỉnh, quan truyền phấn có gót đính chi, khối phấn hướng lên, có khối phấn phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu khơng thót lại thành dạng vịi nhụy; cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [14], [52] Phân bố chi Gymnema rộng, vùng Tây châu Phi đến Australia, châu Á 1.1.2 Các loài thuộc chi Gymnema Theo dự án “The plant list” thực Royal Botanic Gardens, Kew Missouri Botanical Garden khởi động từ năm 2010 xác định 120 loài thuộc chi Gymnema thu thập từ sở liệu khác giới có 52 tên khoa học chấp nhận (43,3%), 50 tên xác định tên đồng nghĩa (41,67%), 18 tên chưa xác định xác thơng tin (15%) [58] Dưới 52 loài thuộc chi Gymnema chấp nhận theo “The plant list” [58] Gymnema acuminatum Wall Gymnema albidum Decne Gymnema albiflorum Costantin Gymnema brevifolium Benth Gymnema calycinum Schltr Gymnema chalmersii Schltr Gymnema cumingii Schltr Gymnema cuspidatum (Thunb.) Kuntze Gymnema decaisneanum Wight Gymnema dissitiflorum Ridl Gymnema dunnii (Maiden & Betche) P.I.Forst Gymnema elegans Wight & Arn Gymnema erianthum Decne Gymnema foetidum Tsiang Gymnema longiretinaculatumTsiang Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Wilcock Gymnema macrothyrsa Warb Gymnema maingayi Hook.f Gymnema mariae Schltr Gymnema micradenium Benth Gymnema molle Wall ex Wight Gymnema montanum Hook.f Gymnema montanum var beddomei Hook.f Gymnema muelleri Benth Gymnema pachyglossum Schltr Gymnema piperii Schltr Gymnema pleiadenium F.Muell Gymnema glabrum Wight Gymnema griffithii Craib Gymnema hainanense Tsiang Gymnema hirtum Ridl Gymnema inodorum (Lour.) Decne Gymnema javanicum Koord Gymnema khandalense Santapau Gymnema kollimalayanum A.Ramach & M.B.Viswan Gymnema lacei Craib Gymnema lactiferum (L.) R.Br ex Schult Gymnema latifolium Wall ex Wight Gymnema littorale Blume Gymnema recurvifolium Blume Gymnema rotundatum Thwaites Gymnema rufescens Decne Gymnema schlechterianum Warb Gymnema spirei Costantin Gymnema suborbiculare K.Schum Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Sm Gymnema syringaefolium (Decne.) Costantin Gymnema thorelii Costantin Gymnema tricholepis Schltr Gymnema trinerve R.Br Gymnema uncarioides Schltr Gymnema yunnanense Tsiang 1.1.3 Các loài thuộc chi Gymnema Việt Nam Tổng hợp thông tin tài liệu thực vật nước tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000), Võ Văn Chi (2004) [3] Trần Thế Bách (2007) [4], đồng thời với địa điểm thu mẫu nghiên cứu liên quan đến chi Gymnema, số loài thuộc chi Gymnema phân bố Việt Nam liệt kê bảng 1.2 với tên thức đối chiếu theo hệ thống danh pháp quốc tế Bảng 1.2 Các loài chi Gymnema Việt Nam TT Tên loài Tên thƣờng gọi Phân bố Bát Bạc (Hà Sơn Bình) Gymnema albiflorum Cost Lõa ti hoa trắng Gymnema inodorum (Lour) Deene (Tên khác: Gymnema tingens (Roxb.) Sprengel - Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Lõa ti không mùi, Lõa Cạn, Thái Ngun, Hịa ti nhuộm, Rau mỏ, Bình, Vĩnh Phúc Dây thìa canh to - Rộng khắp đất rừng, cạnh suối lùm bụi TLTK [4] [1], [2], [4], [13], [14] TT Tên loài Tên thƣờng gọi Phân bố TLTK [1], [4], [13], [14] Gymnema latifolium Wall ex Wight Dây thìa canh to, Lõa ti rộng Hà Sơn Bình,Hịa Bình, Ninh Bình, Kom Tum,Thái Nguyên, Tuyên Quang, Gia Lai, Tây Ninh Gymnema yunnanense Tsiang Lõa ti Nam Vân Kiên Giang, Kom Tum, Gia Lai, Đăk Lăk [1], [13], [14] Gymnema reticulatum (Moon) Alst ) Lõa ti mạng, Dây thìa canh gân mạng Núi Dinh, Tuyên Quang [1], [2], [4] Dây thìa canh, dây muôi, Lõa ti rừng Hà Bắc, Sầm Sơn, Thanh Hóa,Quảng Trị,Quảng Ninh, Phú Yên, Vĩnh Phúc, Nam [1], [2], [4], Định, Quảng Trị, Khánh [13], [14] Hòa, Quảng Nam Bờ bụi, hàng rào Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult 1.2 Giới thiệu chung Dây thìa canh 1.2.1 Nguồn gốc, phân loại Dây thìa canh hay cịn gọi Dây mi, với danh pháp khoa học Gymnema sylvetre (Retz), chi Lõa ti (Gymnema), họ Thiên lý (Asclepiada ceae), Việt Nam, chi Lõa ti (Gymnema) có khoảng lồi [16],[36],[37] Cây thường mọc bờ bụi, hàng rào số nơi miền Bắc Việt Nam từ Hải Hưng, Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum,…Ngồi ra, cịn phân bố Trung Quốc, Ấn độ, Inđonexia 1.2.2 Đặc điểm thực vật học Dây thìa canh Dây leo, cao từ - m; thân non màu xanh, phủ lông mịn, thân già màu nâu; có lỗ vỏ, đường kính lỗ vỏ từ 0,5 - mm Tồn có nhựa mủ màu trắng hay vàng Lá mọc đối, cuống dài - mm; đường kính cuống - mm; phiến hình bầu dục trứng hay trứng ngược, chiều dài - cm rộng 2,5 - cm, mép nguyên; có - cặp gân phụ, rõ mặt Hoa nhỏ màu trắng vàng, xếp thành xim dạng tán nách Có đài, thuỳ dài mm, có lơng mịn rìa lơng Tràng 5, dính thành ống, dài 1,8 - mm, mặt ngồi nhẵn; tràng phụ gắn với tràng, có răng, dính với họng tràng Cột nhị nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5 mm, rộng 0,8 - mm Bộ nhị có bao phấn ngắn; khối phấn gồm hai thùy, dài khoảng 0,2 mm, liên kết với nhờ trung đới màu vàng nâu Bộ nhụy có vịi với đầu rộng hình nón vượt q bao phấn Quả đại dài - cm, rộng dưới, đường kính chỗ lớn khoảng 1,5 cm Hạt dẹp, dài mm, có mào lơng màu trắng, dài khoảng - 3,5 cm, thường có khoảng 40 hạt [16],[36],[37] Ghi chú: cành mang hoa: hoa: đài mở với tuyến: cột nhị nhụy: nhụy: quan truyền phấn khối phấn (pollinarium): quả: hạt (hình theo Tsiang & Li 1977) Hình 1.1 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sehunlt 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào Nhân giống nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), vi nhân giống (micropropagation) tên gọi chung cho phương pháp nuôi cấy in vitro cho phận nhỏ tách khỏi [15] dùng phổ biến để nhân giống thực vật 1.3.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Khái niệm: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật lĩnh vực nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật môi trường nhân tạo, điều kiện vô trùng [11] Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa học thuyết tính tồn tế bào nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt vào cuối kỷ 19 đầu kỷ 20: “Mọi tế bào thể sinh vật mang toàn lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành cá thể hoàn chỉnh” Ngày nhà khoa học chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ Trong ni cấy in vitro, q trình phát sinh hình thái thực chất kết q trình phân hố phản phân hố tế bào Kỹ thuật ni cấy mô, tế bào xét kỹ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời điều kiện nhân tạo vô trùng) cách định hướng dựa vào phân hóa phản phân hóa tế bào sở tính tồn tế bào thực vật Để điều khiển phát sinh hình thái mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào mơi trường ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật auxin cytokinin Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất mơi trường khác tạo phát sinh hình thái khác Khi mơi trường ni cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện IAA)/cytokinin (đại diện kinetin) thấp phát sinh hình thái mơ ni cấy theo hướng tạo chồi, tỷ lệ cao mơ ni cấy phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ tỷ lệ cân đối phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus) [10] 1.3.2 Các bước tiến hành phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Giai đoạn chuẩn bị: Là bước quy trình nhân giống Giai đoạn gồm khâu như: chọn lọc mẹ để lấy mẫu, chọn quan để lấy mẫu Mô chọn để ni cấy thường mơ có khả tái sinh cao ống nghiệm, bệnh, giữ đặc tính q mẹ Sau chọn chế độ khử trùng thích hợp để mẫu cấy bị nhiễm thấp nhất, đồng thời khả sinh trưởng phát triển tốt Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến dùng tác nhân hố học có tính sát trùng mạnh cồn 70%, HgCl2, NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2, để khử trùng mẫu Nồng độ chất khử trùng chọn sở thực tiễn thí nghiệm, theo ngun tắc mơ non nồng độ thấp, mơ già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khử trùng với Cũng bổ sung chất kháng nấm vi khuẩn vào môi trường nhằm tăng hiệu khử trùng Thời gian khử trùng xác định thực nghiệm loài mơ ni cấy Nhìn chung, mơ non khử trùng thời gian ngắn, mô già thời gian dài Giai đoạn nuôi cấy khởi động: Là giai đoạn ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mơ cấy Môi trường xác lập cho loại cây, loại mô nuôi cấy Các mẫu nuôi cấy không bị nhiễm khuẩn, nấm virus lưu giữ phịng ni cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau thời gian định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu xuất cụm tế bào quan (chồi, cụm chồi, rễ) phơi vơ tính có đặc tính gần phơi hữu tính Đây vật liệu khởi đầu q trình nhân nhanh tiếp sau Giai đoạn nhân nhanh: Một mẫu cấy tạo từ nhận cụm chồi, phơi vơ tính sinh trưởng tốt, q trình nuôi cấy bước vào giai đoạn nhân nhanh Người ta cần thu tốc độ nhân nhanh cao điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường tối ưu hóa nhằm đạt mục tiêu 50 tăng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (cơng thức NT4) kết nhân chồi có xu hướng giảm, điều nói lên chất điều hịa sinh trưởng có nồng độ cao có tác dụng ngược đến sinh trưởng thực vật Như vậy, thí nghiệm chọn cơng thức NT3 để nhân nhanh chồi Dây thìa canh phù hợp, với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 96,66%, số chồi trung bình mẫu đạt 3,45 chồi, chiều cao chồi đạt 4,23 cm (tương tự kết Vũ Hoài Sâm CS, 2015), tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 68,17%, kích thước chồi cao, mập, màu xanh đậm 3.2.5 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ Khả quang hợp sinh trưởng in vitro bị hạn chế nồng độ khí CO2 cung cấp cho bình ni cấy khơng đủ suốt thời gian chiếu sáng (Desjardins et al.,1988; Fujiwara et al., 1987; Kozai, 1991) Nên khả quang hợp bị ảnh hưởng, địi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho hoạt động sinh trưởng tế bào Trong giai đoạn tạo rễ, chồi có đầy đủ ni cấy bình để giàn đèn neon giúp quang hợp để tạo lượng đường định nên việc bổ sung thêm lượng đường vừa đủ cần thiết giai đoạn tạo rễ, bổ sung q nhiều đường lãng phí mơi trường dễ bị nhiễm khuẩn Trong nội dung nghiên cứu này, thí nghiệm bố trí với mơi trường khống MS bổ sung 0,1 mg/l IBA, 0,1 mg/l NAA, (10 - 20) g/l sucrose Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng sucrose ến khả rễ CTTN Sucrose (g/l) Tỉ lệ rễ (%) Số rễ TB/cây Chiều dài TB/rễ (cm) ĐT1 10 62,33c 1,21c 1,9bc ĐT2 15 71,67b 1,93b 2,2cb ĐT3 20 78,33a 2,70a 3,1d 51 Ghi chú: Chữ khác bảng số liệu thể sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 phép phân tích SPSS Tỉ lệ rễ %) % 78,33 80 70 71,67 62,33 60 50 Tỉ lệ rễ (%) 40 30 20 10 ĐT1 ĐT2 ĐT3 Biểu 3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng sucrose ến khả rễ Kết thí nghiệm (bảng 3.6 biểu đồ 3.5) cho thấy cơng thức thí nghiệm với lượng đường khác tạo khác biệt, công thức ĐT3 bổ sung lượng sucrose 20 mg/l cho kết tạo rễ tốt với tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài rễ đạt 78,33%; 2,7 rễ/cây; 3,1 cm Kết xử lý thống kê cho thấy khác có ý nghĩa 3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA IBA đến khả rễ Tạo hoàn chỉnh bước cuối quy trình ni cấy in vitro trước đưa huấn luyện trồng vườn ươm nên việc nghiên cứu cho rễ tạo hoàn chỉnh với tỷ lệ cao quan trọng Theo Farooq et al (2008), auxin có vai trị việc tạo rễ môi trường tạo rễ in vitro, thơng qua ảnh hưởng đến phân chia tế bào hình thành rễ Trong nội dung nghiên cứu này, cơng thức thí nghiệm bố trí với mơi trường khống MS có bổ sung hai chất điều hịa sinh trưởng nhóm auxin (0,2 – 0,6 mg/l) IBA (0,2 - 0,6 mg/l) NAA Kết theo dõi tuần trình bày bảng 3.7 52 Bảng 3.7 Kết ảnh hƣởng nồng ộ IBA NAA ến khả rễ CTTN Chất ĐHST (mg/l) Tỉ lệ rễ (%) Số rễ TB/cây Chiều dài rễ (cm) IBA NAA ĐC 00 00 19,68a 0,40hgd 0,63a RT1 0,2 00 67,06bef 1,44ghd 2,33bf RT2 0,4 00 86,51ch 2,53fb 3,40cd RT3 0,6 00 96,54dg 3,56e 3,90dc RT4 00 0,2 61,35ebf 2,98dhg 2,80egh RT5 00 0,4 76,67fbe 1,97c 2,33fb RT6 00 0,6 90,01gd 2,26bf 3,13ghe RT7 0,3 0,3 88,52hc 2,11a 2,87hge Ghi chú: Chữ khác bảng số liệu thể sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 phép phân tích SPSS Tỉ lệ rễ %) 96,54 100 90,01 86,51 90 88,52 76,67 80 67,06 70 61,35 60 50 Tỉ lệ rễ (%) 40 30 19,68 20 10 ĐC RT1 RT2 RT3 RT4 RT5 RT6 RT7 Biểu 3.6 Ảnh hƣởng nồng ộ IAA NAA ến khả rễ 53 Kết thu (bảng 3.7 biểu đồ 3.6) cho thấy, mẫu cấy công thức mơi trường rễ, chồi in vitro cấy mơi trường khống MS khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (R0), tỷ lệ rễ thấp đạt 19,68 %, số rễ trung bình đạt 0,4 rễ/cây, chiều dài trung rễ 0,63 cm, rễ màu trắng nhạt, mảnh Các công thức mơi trường có sử dụng chất điều hịa sinh trưởng thực vật với liều lượng khác (0,2 - 0,6 mg/l) IBA (RT1-RT3) cho tỷ lệ rễ cao RT3 đạt 96,54%, số rễ trung bình đạt 3,56 rễ/cây chiều dài rễ trung bình đạt 3,9 cm Công thức môi trường bổ sung (0,2 - 0,6 mg/l) NAA (RT4 - RT6) có tỷ lệ chồi rễ đạt 61,35 đến 90,01%, với số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình/rễ cao 2,26 rễ; 3,13 cm (RT6) Thí nghiệm bổ sung đồng thời IBA NAA (RT7) cho tỷ lệ rễ đạt 88,52%, với số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình/rễ 2,11 rễ; 2,87 cm Như vậy, chọn công thức môi trường RT3 môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l IBA phù hợp cho ni cấy rễ tạo hồn chỉnh Dây thìa canh Kết xử lý thống kê cho thấy khác có ý nghĩa Tạo rễ môi trường khác Tạo rễ mơi trường RT3 Hình 3.11 Dây thìa canh hồn chỉnh 54 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xác định trình tự nucleotide đoạn gen trnH- PsbA, trnL ITS1 sản phẩm PCR có kích thước tương ứng 565bp, 567bp 767bp sai khác 01 cặp nucleotide đoạn gen so với trình tự gen trnH-PsbA, trnL ITS1 loài thuộc chi Gymnema, với mã số NCBI là: MF064898.1, KE953920.1 MG730191.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro Dây thìa canh đạt số kết sau: Khử trùng mẫu cành Dây thìa canh khử trùng kép dung dịch HgCl2 0,1% phút Ni cấy mơi trường khống MS bổ sung 0,2 mg/l BAP, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar đạt tỷ lệ mẫu 72,15%, tỷ lệ tái sinh 68,25% Nhân nhanh chồi Dây thìa canh mơi trường khoáng MS bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l khoai tây, 6,5 g/l agar, 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi 96,66%, số chồi trung bình mẫu 3,45 chồi, chiều cao chồi 4,23 cm, chồi cao, mập, màu xanh đậm Kích thích rễ tạo hồn chỉnh mơi trường khống MS bổ sung 0,6 mg/l IBA, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l khoai tây, 20 g/l sucrose, 6,5 g/l agar Tỷ lệ rễ đạt 96,54%, số rễ trung bình đạt 3,56 rễ/cây với chiều dài rễ 3,90 cm Kiến nghị - Đăng kí trình tự đoạn mã vạch nghiên cứu ngân hàng gen quốc tế NCBI 55 - Tiếp tục nghiên cứu thiết kế cặp mồi thích hợp cho việc nhân gen để tiến hành giải trình nucleotide xác định đoạn ADN đặc trưng gen lại từ mẫu ADN dây thìa canh - Tiếp tục nghiên cứu với nhiều thang nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để nhân nhanh chồi rễ tạo hoàn chỉnh để đưa công thức phù hợp cho hệ số nhân nhanh chồi rễ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thế Bách (2007), ghiên cứu phân loại Họ Thiên Lý Việt am, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt am, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr.283-284 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt am (Tập 2), NXB Trẻ, tr 671-703 Hà Văn Huân (2015), Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử ADN (mã vạch DNA) phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam, Ngân hàng liệu DNA Việt Nam Huỳnh Văn Kéo, Ngô Viết Nhơn (2006), Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen thực vật vườn quốc gia Bạch Mã Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 1(2): 127-129 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng cơng nghệ tế bào thực vật phục hồi lồi gỗ quý Giá tỵ, Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học Kỹ thuật, 352-357 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài đặc sản Trầm hương Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 2526/7/2003, NXB Khoa học Kỹ thuật, 358-361 Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân nhanh Trinh nữ hoàng cung phương pháp in vitro Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học Kỹ thuật, 722-724 10 Nguyễn Quang Thạch (2000) Giáo trình sinh lý thực vật Nxb Nông nghiệp Hà Nội 57 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2000) Bài giảng môn học công nghệ sinh học thực vật - Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 12 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXb Nơng Nghiệp Hà Nội 13 Đinh Thị Thu Thủy (2014), Đánh giá tác dụng hạ glucose máu dịch chiết lồi chi Gymnema R.Br Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội 14 Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật thành phần hố học loài chi Gymnema R.Br Việt nam, Luận văn thạc sĩ dược học, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội 15 Nguyễn Văn Uyển (1993) uôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng Nxb Nông nghiệp, tr 23-44 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 16 Baskaran et al (1990), “Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin dependent diabetes mellitus patients”, Journal of Ethnopharmacology 30(3), pp 295-300 17 Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) - Avaluable medicinal plant In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44(5): 436-411 18 Baharum, S.N (2012), “Application of 16s rDNA and cytochrome b ribosomal markers in studies of lineage and fish populations structure of aquatic species”, Molecular biology reports, 39 (5), pp 5225-5232 19 Brown, B, Emberson R.M, and Paterson A.M (1999), “Mitochondrial COI and II provide useful markers for Wiseana (Lepidoptera: Hepialidae) species identification”, Bulletin of Entomological Research, 89 (04), pp 287-293 20 Casiraghi, M, Labra M, Ferri E, Galimberti A, and De Mattia F (2010), “DNA barcoding: theoretical aspects and practical applications” 21 Chase, M.W, Cowan R.S, et al (2007),“A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants”, Taxon, 56 (2), pp 295-299 58 22 Chen, S, Yao H, et al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS one, (1), pp e8613 23 Chiou, S.-J, Yen J.-H, Fang C.-L, Chen H.-L, and Lin T.-Y (2007), “Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta medica, 73 (13), pp 1421-1426 24 Chase M W, Nicolas S, Mike W, James M D, Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462): 1889 - 1895 25 Fazekas, A.J., Burgess K.S., et al (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well”, PLoS One, (7), pp e2802 26 Ford, C.S, Ayres K.L, et al (2009), “Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on land plants”, Botanical Journal of the Linnean Society, 159 (1), pp 1-11 27 Group, C.P.W, Hollingsworth P.M, et al (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (31), pp 12794-12797 28 Havens K, Guerrant E, Maunder M (1999), Strategies for survival: Ex situ Plant conservation Report of a research symposium held at the Chicago Botanic Garden, BG Journal, 3(3) 29 Hebert, P.D, Cywinska A, and Ball S.L (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512), pp 313-321 30 Hebert, P.D, Penton E.H, Burns J.M, Janzen D.H, and Hallwachs W (2004), “Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101 (41), pp 14812-14817 31 Hebert, P.D, Ratnasingham S, and De Waard J.R (2003), “Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related 59 species”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (Suppl 1), pp S96-S99 32 Hollingsworth, M.L, Andra Clark A, et al (2009), “Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with species- level sampling in three divergent groups of land plants”, Molecular Ecology Resources, (2), pp 439-457 33 Hollingsworth, P.M (2011), “Refining the DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49), pp 19451-19452 34 Hollingsworth, P.M, Graham S.W, and Little D.P (2011), “Choosing and using a plant DNA barcode”, PloS one, (5), pp e19254 35 Joshi M, Dhar U (2003), In vitro propagation of Saussurea obvallata Edgew An endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya, Plant Cell Rep, 21(10): 933-939 36 K Grover et al (2002), “Medicinal plants of India with anti-diabetic potential”, Journal of Ethnopharmacology 81, pp 81-100 37 Kapoor LD (1990), “Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants”, Boca Raton, F.L, CRC Press, pp 200-201 38 Lee H, Yi D, Kim J, and Kim K, Development of plant DNA barcoding markers from the variable noncoding regions of chloroplast genome in Abstract presented at the second international barcode of life conference Academia Sinica, Taipei, Taiwan 2007 39 Logacheva M, Penin A, Samigullin T, Vallejo-Roman C, and Antonov A (2007), “Phylogeny of flowering plants by the chloroplast genome sequences: in search of a “lucky gene””, Biochemistry (Moscow), 72 (12), pp 1324-1330 40 N Shigematsu et al (2001), “Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre R.Br leaves on lipid metabolism in rats”, Biol Pharm Bull 24(6), 713-717 41 Nerea Larranaga and José L Hormaza (2015), “DNA barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona ( Annonaceae) 60 42 Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034 43 Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant, Plant Med, 69(6): 571-573 44 Schoch, C.L, Seifert K.A, et al (2012), “Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 (16), pp 6241- 6246 45 Scharaschklin T, Doyle J.A.( 2005), Phylogeny and historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology and noncoding chloroplast sequence data Syst Bot 30: 712–735 46 Shaw J, Lickey E.B, Schilling E E, Small R.L (2007), “Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94): 275-288 47 Takhtajan (2009), "Flowering Plants", Springer Verlag 48 Taberlet P, Eric C, Franỗois P, Ludovic G, Christian M, Alice V, Thierry V, Gérard C, Christian B, and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 49 Van den Berg C, Higgins W E, Dressler R L, Whitten W M, Soto Arenas M A, Culham A, Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana 15: 96114 50 Van DeWiel C C M, Van Der Schoot J, Van Valkenburg J L, Duistermaat C H, Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from noninvasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 61 51 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, 99: 1530 – 1540 52 Wu Z Y & P H Raven (1995), “Flora of China Vol 16 (Gentianaceae through Boraginaceae)”, Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St Louis pp.479 53 Wang W, Wu Y, Yan Y, Ermakova M, Kerstetter R (2010), “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology 10: 205 54 Wu F, Mueller L A, Crouzillat D, Petiard V, TanksleyS.D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics, 174: 1407-1420 55 Yu, J, Xue J.H, and Zhou S.L (2011), “New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms”, Journal of Systematics and Evolution, 49 (3), pp 176-181 56 Yao H, Song J, Liu C, Luo K, Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE, 5: 13102 57 Yong H L, Jinlan R, Shilin C, Jingyuan S, Kun L, Dong L and Hui Y (2010), “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research, 4(24): 2706-2709 TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 58 Lecomte Henri, Humbert Henri, Gagnepain F (1914), Flore g n rale de l'Indo-Chine, Tome quatri me, scl piadac es marantac es, Masson et Cie, Paris TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN 59 List the plant (2010), „ Vertionl1: publish on the internet http://www.theplantlish.org/" PH L C Phụ lục Thành ph n mơi trƣờng MS Dung dịch mẹ Hóa chất Nồng ộ (mg/l) Dung dịch mẹ nồng ộ ậm c 20 l n mg/l) NH4NO3 1650,0 33000,0 KNO3 1900,0 38000,0 MgSO4 7H2O 370,0 7400,0 MnSO4 4H2O 22,3 446,0 ZnSO4 7H2O 10,6 212,0 CuSO4 5H2O 0,025 0,5 CaCl2 2H2O 440,0 8800,0 KI 0,83 16,6 CoCl2 6H2O 0,025 0,5 10 KH2PO4 170,0 3400,0 11 H3BO3 6,2 124,0 12 Na2MoO4 2H2O 80 13 FeSO4 7H2O 27,85 557,0 14 Na2Edta 2H2O 37,25 745,0 15 Nicotinic acid 40,0 16 Pyridocine HCl 40,0 17 Thiamine HCl 40,0 18 Glycine 2,0 40,0 19 PVP 20 Dung dịch mẹ Hóa chất 20 Biotin 21 Vitamine C 22 Nồng ộ (mg/l) Dung dịch mẹ nồng ộ ậm c 20 l n mg/l) 0,1 20 BAP 10 10 23 IAA 10 10 24 IBA 10 10 25 Inositol 100mg/l 26 Sucrose 30 mg/l 27 Agar 28 pH 5-6g/l 5.6-5,8