(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ĐÀO THỊ THÚY HẰNG XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 842 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Văn Việt Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Đào Thị Thúy Hằng ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Việt tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Tôi xin cảm ơn cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2018 Học viên Đào Thị Thúy Hằng iii M CL C LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii M C L C iii DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH M C BẢNG vi DANH M C BIỂU ĐỒ vii DANH M C H NH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Chi Gymnema 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố chi Gymnema 1.1.2 Các loài thuộc chi Gymnema 1.1.3 Các loài thuộc chi Gymnema Việt Nam 1.2 Giới thiệu chung Dây thìa canh 1.2.1 Nguồn gốc, phân loại 1.2.2 Đặc điểm thực vật học Dây thìa canh 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào 1.3.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.3.2 Các bước tiến hành phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.4 Thành tựu nuôi cấy mô tế bào dược liệu Dây thìa canh .10 1.4.1 Nghiên cứu nước 10 1.4.2 Thế giới 12 1.5 Tổng quan mã vạch ADN 12 1.5.1 Giới thiệu mã vạch ADN (DNA barcode) 12 1.5.2 Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật .14 1.5.3 Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN thực vật .18 Chƣơng M C TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu tổng quát 22 2.2 Mục tiêu cụ thể .22 2.3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 22 iv 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.3.2 Hóa chất 22 2.3.3 Dụng cụ - máy móc 23 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu .24 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.3 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá 31 2.4.4 Phương pháp theo dõi 32 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu .32 2.5 Địa điểm thời gian bố trí thí nghiệm .32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Xây dựng sở liệu ADN mã vạch Dây thìa canh 33 3.1.1 ết tách chiết D t ng số 33 3.1.2 Kết PCR đoạn mã vạch ADN .34 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn mã vạch ADN với đoạn mồi khác 37 3.2 Kết nhân giống Dây thìa canh phương pháp nuôi cấy in vitro .41 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi 41 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nhân nhanh chồi 43 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ B P đến nhân nhanh chồi 45 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi 47 3.2.5 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ .50 3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IB đến khả rễ .51 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PH L C v DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT MS Murashige & Skoog, 1962 BAP 6-Bezyl amino purine KIN Kinetin (6 -furfurol amino purine) IBA Indole -3 -Butyric Acid -NAA -Naphthalene Acetic Acid CT Cơng thức ĐC Đối chứng ĐHST Điều hịa sinh trưởng WPM Woody Plant Medium CS Cộng TB Trung bình vi DANH M C BẢNG Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Gymnema Bảng 2.1 Trình tự thơng tin cặp mồi đặc hiệu 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.4 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến kết tạo mẫu 28 Bảng 2.5 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi 29 Bảng 2.6 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi 29 Bảng 2.7 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin α-NAA đến nhân nhanh chồi30 Bảng 2.8 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ 30 Bảng 2.9 Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA NAA đến khả rễ 31 Bảng 3.1 Đánh giá ba vùng ADN đề xuất 36 Bảng 3.2 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 41 Bảng 3.3 Kết ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nhân nhanh chồi 43 Bảng 3.4 Kết ảnh hưởng nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi 45 Bảng 3.5 Kết ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi 48 Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ 50 Bảng 3.7 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA NAA đến khả rễ 52 vii DANH M C BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi 42 Biểu đồ 3.2 a Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến tỷ lệ tạo cụm chồi 44 Biểu đồ 3.2 b Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi 44 Biểu đồ 3.3 a Ảnh hưởng nồng độ BAP đến tỷ lệ tạo cụm chồi 46 Biểu đồ 3.3 b Ảnh hưởng nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi 46 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi 48 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến khả rễ 51 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng nồng độ IAA NAA đến khả rễ 52 viii DANH M C H NH Hình 1.1 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sehunlt Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Dây thìa canh 33 Hình 3.2 Kết nhân đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Dây thìa canh thu dùng mồi P10 34 Hình 3.3 Kết nhân đoạn gen trnL từ mẫu Dây thìa canh thu dùng mồi p11 35 Hình 3.4 Kết nhân đoạn gen ITS1 từ mẫu Dây thìa canh dùng mồi p12 35 Hình 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng psbA-trnH 38 Hình 3.6 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng trnL 39 Hình 3.7 Vị trí nucleotide sai khác so sánh vùng ITS1 40 Hình 3.8 Mẫu tái sinh chồi môi trường dinh dưỡng MS 42 Hình 3.9 Một số hình ảnh Dây thìa canh thí nghiệm 46 Hình 3.10 Một số hình ảnh Dây thìa canh giai đoạn nhanh nhanh chồi 49 Hình 3.11 Dây thìa canh hồn chỉnh 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) đánh giá dược liệu quan trọng chiến lược phát triển thảo dược Việt Nam Thành phần hóa học có hoạt tính sinh học dây thìa canh axit gymnemic, hoạt chất thuộc nhóm saponin triterpenoid Ngồi ra, Dây thìa canh cịn chứa thành phần khác flavone, anthraquinone, hentriacontane, pentatriacontane, α β-chlorophylls, phytin, resins, d-quercitol, axít tartaric, axit formic, axit butyric, lupeol Axit gymnemic có tác dụng kích thích sản sinh tế bào beta tuyến tụy, giúp thể tái thiết lập khả cân đường huyết tự nhiên; ức chế hấp thu đường ruột; ức chế gan tân tạo glucose vào máu, đồng thời kích thích enzyme chịu trách nhiệm tiêu thụ, sử dụng đường mô Lá dây thìa canh sử dụng rộng rãi điều trị đái tháo đường thuốc lợi tiểu khắp giới, đặc biệt Ấn Độ, Việt Nam số nước khác Một số hợp chất hoạt tính sinh học phân lập từ thảo dược để chữa bệnh tiểu đường Ngồi sử dụng chống đầy khó tiêu, táo bón, vàng da, bệnh trĩ, bệnh tim, hen suyễn, viêm phế quản Hiện nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng, nhiên loài tự nhiên bị giảm số lượng chất lượng khai thác mức, điều kiện ngày bất lợi môi trường tự nhiên, nên việc nghiên cứu nhân giống bảo tồn cần thiết, cấp bách việc lưu giữ nguồn gen quý Mã vạch ADN đoạn ADN ngắn, nằm hệ gen (nhân, lục lạp ty thể) đặc trưng loài sinh vật Do việc xác định lồi mã vạch ADN có độ xác cao Phương pháp trở thành công cụ hữu hiệu cho nhà khoa học việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền quan hệ di truyền loài ... liệu ADN mã vạch cho lồi Dây thìa canh nhằm xác định loài phục vụ bảo tồn phát triển dược liệu, tiến hành nghiên cứu: Xây dựng sở liệu ADN mã vạch nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) phương. .. VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Xây dựng sở liệu ADN mã vạch Dây thìa canh 33 3.1.1 ết tách chiết D t ng số 33 3.1.2 Kết PCR đoạn mã vạch ADN .34 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn mã vạch. .. vi nhân giống (micropropagation) tên gọi chung cho phương pháp nuôi cấy in vitro cho phận nhỏ tách khỏi [15] dùng phổ biến để nhân giống thực vật 8 1.3.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy